链球菌感染的治疗的制作方法

专利名称：链球菌感染的治疗的制作方法
链球菌感染的治疗本申请涉及保护免于链球菌疾病的疫苗和免疫原性组合物的领域，具体地，涉及使用疫苗来治疗肺炎链球菌疾病的方法，所述疫苗含有来自多组氨酸三联体家族蛋白的蛋白，具体地，涉及使用这些疫苗和免疫原性组合物的治疗方法。
背景技术：
肺炎链球菌(SirepiococciAs pneumoniae)是世界上的传染性的发病率和死亡率的主要原因之一，其可引起大范围的感染，诸如中耳炎、肺炎、菌血症和脑膜炎{ Hausdorff2005，McCullers 2001 }。该微生物的抗生素抗性株的出现，已经进一步突出了对提供有效的预防性疫苗接种的需要{ Lynch, III 2005，Bridy-Pappas 2005 }。当前的疫苗由以流行病学上占优势的血清型为基础的肺炎球菌荚膜多糖的选择组成，所述多糖与载体蛋白缀合或未缀合{ Dagan 2004, Fedson 2004, Mbelle 1999, Smart 1987 }。但是，所述疫苗制剂没有覆盖该微生物的所有血清型，在全球的具有不同优势血清型的某些区域中，这可能是特别相关的{ Dagan 1992 }。另外，可以预见到，血清型特异性的疫苗的使用，最终允许非疫苗血清型的阳性选择{ Nunes 2008，Singleton 2007 }。一个替代方案涉及靶向共同的肺炎球菌抗原的疫苗的开发。在多种候选物中，Pht蛋白家族(限于链球菌属)构成有希望的候选物，它们在肺炎球菌物种中是十分保守的{ Hamel 2004, Zhang 2001 }，且在受感染的个体中是抗体靶标，在被免疫的小鼠中在激发以后是保护性的{ Beghetto 2006 }。最初，该蛋白家族被3个研究组独立地报道，并使用3个分开的命名Pht (对于肺炎球菌组氨酸三联体){ Adamou 2001 }、Php (对于肺炎球菌组氨酸蛋白){ Zhang 2001 }和BVH { Hamel 2004 }。那些蛋白的特征在于组氨酸三联体基序HxxHxH，该基序在它们的氨基酸序列中重复5-6次。已经描述了该家族的4个成员PhtA (BVH-11-3)、PhtB (PhpA/BVH-11)和 PhtD (BVH-11-2)(它们具有多达 81% 序列同一性)和PhtE (BVH-3)，PhtE与其它3种蛋白不同，与它们仅表现出最多35%同一性。它是一种更长的蛋白，具有组氨酸三联体基序的6次重复的唯一蛋白。在小鼠免疫接种研究中，已经证实Pht家族的所有成员会提供针对许多不同菌株/血清型的随后肺炎球菌感染的高保护水平{ Adamou 2001, Hamel 2004, Ogunniyi 2007, Wizemann 2001, Zhang 2001 }。尽管它们在针对肺炎链球菌的疫苗接种中具有潜在重要性，尚未确定这些蛋白的生物学功能。来自抗体标记实验和流式细胞术实验的结果证实，Pht蛋白暴露于有荚膜的细菌的表面上{ Hamel 2004 },这与它们作为疫苗祀标的相关性相一致。通过标志物标记的诱变，已经提示，PhtA、PhtB和PhtD涉入肺特异性的毒力{ Hava 2002 }，没有关于它们的生物学功能的进一步指示。在它们的假定的作用中，已经提出了补体因子C3b的中和{ Hostetterl999, Ogunniyi 2009 },这暗示，它们会干扰吞卩遼作用。此外，还怀疑在附着中的作用。实际上，已经报道了#切和之间的遗传联系{ Panina 2003 }，所述
编码假定的层粘连蛋白粘着蛋白{ Spellerberg 1999 }。最后，由于组氨酸残基在组氨酸三联体中的高数目，已经提出，Pht蛋白可能参与DNA和/或金属结合{ Adamou 2001}。更具体地，一些研究突出了 Pht家族和锌之间的联系。实际上，已经在基因的上游区域中发现了 AdcR-结合位点，AdcR被描述为调节锌摄入的转录因子{ Panina 2003}。此外，PhtA的一部分的晶体结构揭示了与组氨酸三联体结构域结合的锌离子的存在{Riboldi-Tunnicliffe 2005 }。但是，不清楚锌清扫或运输是否是那些蛋白的功能，或锌是否起构象作用或功能作用。疫苗候选物需要解决的重要方面是，它们的表达水平和有关的调节、它们的出现以及它们的序列变异性。因此，我们已经解决了关于Pht蛋白的这些不同的方面。肺炎链球菌会引起表现出不同病状的不同疾病状态，这取决于肺炎球菌群体的繁殖部位。在肺炎链球菌进入血流中的情况下，产生败血病，而在肺炎链球菌在肺中繁殖的情况下，产生肺炎。肺炎链球菌也是中耳炎感染的一种重要病原体。肺炎链球菌还可以进入脑脊液中，造成脑膜炎。需要开发更好的肺炎球菌疫苗，所述疫苗能够靶向特定的肺炎球菌疾病，并提供针对特定形式的肺炎球菌疾病的最佳保护。·因此，提供了一种治疗或预防肺炎链球菌感染的方法，其中所述肺炎链球菌感染发生在这样的环境中其中Zn2+和/或Mn2+的浓度低至足以上调至少一种PhtX蛋白在肺炎链球菌中的表达；所述方法包括下述步骤给人患者施用药学有效量的PhtX蛋白。在本发明的第二个方面，提供了一种用于治疗或预防肺炎链球菌感染的免疫原性组合物，其包含药学有效量的分离的Phtx蛋白，其中所述肺炎链球菌感染发生在处于下述环境的人患者中其中Zn2+和/或Mn2+的浓度低至足以上调至少一种PhtX蛋白在肺炎链球菌中的表达。在本发明的第三个方面，提供了药学有效量的分离的Phtx蛋白在药物生产中的用途，所述药物用于治疗或预防肺炎链球菌感染，其中所述肺炎链球菌感染发生在处于下述环境的人患者中其中Zn2+和/或Mn2+的浓度低至足以上调至少一种PhtX蛋白在肺炎链球菌中的表达。


图I.肺炎链球菌血清型4菌株TIGR4中的# 基因的构成。图2. /Ai基因的含有启动子的上游区域。(a)/ A访基因，(b)/7AM基因，(c)#汾基因，(A、Imb基因，(e)yfnA基因。-35和-10区域标有双下划线，用粗体文字和符号(+1)指示转录起始位点，假定的核糖体结合位点(rbs)标有下划线,用箭头表示开放读码框,所述箭头指示在一系列粗体文字上的转录方向。在左侧的数字与GenBank登录号AY569979(a、d和e)和AY569980 (b和c)中的序列位置相对应。图3· 和基因的Rho-非依赖性的转录终止子序列。isdphtE, VcdphtB,U)phtD, (A)PhtA和(Θ)/Λ5 /基因。终止密码子是标有下划线的粗体字，终止子区域标有下划线，用虚线标出下划线的序列指示终止子的发夹区域。用箭头表示开放读码框，所述箭头指示在一系列粗体文字上的转录方向。在(a)中，斜体字区域基因；假定的起始密码子标有双下划线)与#访基因的前481 bp具有78%同一性。但是，标有下划线的终止密码子会阻止重要的基因翻译。数字与GenBank登录号AY569979 (a和c)和AY569980 (b、d和e)中的序列位置相对应。图4. pht转录物的RT-PCR分析。(a)显示RT-PCR产物的1%琼脂糖凝胶，所述RT-PCR使用来自生长至对数中期生长期的细胞的模板RNA。泳道1-8与(b)中的示意图中的区域1-8相对应。使用在图中描绘的侧接对应区域的引物对，制备在泳道1-8中显示的RT-PCR产物。在括弧中指示了每种预测的RT-PCR产物的长度。图5.细菌提取物的SDS-PAGE免疫印迹法。使用抗-PhtD抗体探测来自下述菌株的提取物PhtABDE-四重突变体(A)、PhtE-突变体(B)、PhtD-突变体(C)、PhtB-突变体(D)、PhtA_突变体(E)和野生型(F)菌株。不同的Pht带的位置指示在右侧，分子量标志物是在图的左侧。图6. 4/⑶C野生型菌株和Pht-缺陷型突变体在MS培养基中的生长曲线(a)。还在含有或不含 Zn2+ 200 μ M (b)、Mn2+ 200 μ M (c)或 Fe2+ 200 μ M (d)的 MS 中测定了野生型、PhtD-缺陷型和Pht四重突变体的生长曲线。每个图描绘了 3个实验中的一个代表实验的结果。图7.在有或没有TPEN 30 μ M (锌螯合剂)下培养WU2细菌细胞。接着，用抗-PhtB/D (a)、抗-PhtE (b)、抗-PhtD/E (c)或抗-型3多糖(d)抗体，随后用AlexaFluor-缀合的山羊抗-小鼠第二抗体，探测细胞，然后通过流式细胞术分析它们。作为对照，用第二缀合抗体温育细胞。显示了不同条件的代表性的FACS图。图8.蛋白印迹分析。对全细胞提取物进行SDS-PAGE，继之以免疫印迹法。用多克隆抗-PhtD探测9个不同菌株(a)，并用多克隆抗-PhtE探测8个(b)。显示了分子量标志物。图9. PhtX家族成员的信号序列对比。阴影区指示在至少2/3的PhtX家族成员中保守的氣基Ife。图10.致命的肺炎链球菌鼻内攻击以后的小鼠存活率。用AS02-佐剂化的PhtD、PhtA、PhtB, PhtE或单独的AS02 (对照)免疫小鼠(n=20/组)，然后用3/43型肺炎球菌菌株攻击它们。通过时序检验，与对照相比进行统计分析PhtD，/7=0. 0126 ；PhtA, ρ=0· 0103 ；PhtB,/7=0. 0038 ;PhtE，/ =0. 0033。图11.免疫接种以后的抗体水平。A)用AS02-佐剂化的CbpA、PspA或PhtD全身地免疫小鼠。B)用LT-佐剂化的CbpA、PspA或PhtD鼻内地免疫小鼠。在两种情况下，在第42天采血，并通过ELISA测量特定抗体的水平。图12.在致命的肺炎链球菌鼻内攻击以后的小鼠存活率。说佐热也饱CbpA、PspA, PhtD或单独的AS02 (对照)免疫小鼠，然后用2/D39型CA),3/43型(B)或4/CDC型(C)肺炎球菌菌株攻击它们。通过时序检验，与对照相比进行统计分析(A) CbpA,/7=0. 0002 ；PspA, /7=0. 0001 ；PhtD, /7=0. 0009。(B) CbpA, /7=0. 885 ；PspA, p=0. 184 ；PhtD,/7=0. 027。(C) CbpA,/7=0. 825 ；PspA,/ =0. 538 ；PhtD,/ <0. 0001。图13.疫苗在肺炎链球菌鼻咽定殖(colonization)模型中的效力。用PhtD、PhtA、PhtB, PhtE或单独的LT (对照)免疫Balb/c小鼠，然后用2/D39肺炎球菌菌株鼻内地攻击它们。在攻击后第2天和第6天，计数鼻洗出液中的细菌菌落，并表示为IoglO平均cfu。每个点代表一只小鼠。黑色水平条是几何平均值。虚线指示检测限(在O. 84)。每天用ANOVA进行统计分析。显示了相对于对照的所有显著差异。* ρ<0· 05 ；ns :不显著的。图14.疫苗在肺炎链球菌鼻咽定殖模型中的效力。用CbpA、PspA, PhtD、PsaA或单独的LT (对照)免疫Balb/c小鼠，然后用2/D39 (A)、4/CDC (B)或6B/CDC (C)肺炎球菌菌株鼻内地攻击它们。在攻击后第2天和第6天，计数鼻洗出液中的细菌菌落，并表示为IoglO平均cfu。每个点代表一只小鼠。虚线指示检测限(在O. 84)。黑色水平条是几何平均值。每天用ANOVA进行统计分析。显示了相对于对照的所有显著差异。* /7<0. 05/7<0. 01 ;*** /7<0. 001, ns :不显著的。图15.疫苗在肺炎链球菌肺定殖模型中的效力。用AS02-佐剂化的PhtD或仅用AS02 (对照)免疫CBA/J小鼠，然后用中等毒力的19F/2737肺炎球菌菌株攻击它们。在攻击后第3、4或5天，取出肺，并通过菌落计数(cfu)评价细菌负载。每个点代表一只小鼠。虚线指示检测限(在2)。黑色水平条是几何平均值。用AN0VA2对比3天内的组，随后进行Tuckey-HSD /7<0. 0001。发明详述
本发明提供了一种治疗或预防肺炎链球菌感染的方法，其中所述肺炎链球菌感染发生
在这样的环境中其中Zn2+和/或Mn2+的浓度低至足以上调至少一种PhtX蛋白在肺炎链球菌中的表达；所述方法包括下述步骤给人患者施用药学有效量的PhtX蛋白。Zn2+和Mn2+以游离形式和结合形式存在于人体中。结合的Zn2+或Mn2+与诸如白蛋白等蛋白质结合，并占这些离子的大部分。另一个方面，小量游离的Zn2+或Mn2+存在于诸如血液、淋巴、间隙液或脑脊液等体液中。术语“结合的”涉及与诸如白蛋白等蛋白质紧密结合的离子。术语“游离的”涉及没有与诸如白蛋白等蛋白质紧密结合的离子。这样的游离离子更易于被肺炎链球菌摄入。在一个实施方案中，本发明的方法提供了一种治疗或预防肺炎链球菌感染的方法，其中所述肺炎链球菌感染发生在这样的环境中其中游离的Zn2+和/或Mn2+浓度低至足以上调至少一种PhtX蛋白在肺炎链球菌中的表达。在一个实施方案中，本发明的方法提供了一种治疗或预防肺炎链球菌感染的方法，其中所述肺炎链球菌感染发生在这样的环境中其中结合的和/或游离的Zn2+和/或Mn2+浓度低至足以上调至少一种PhtX蛋白在肺炎链球菌中的表达。为了本发明的目的，术语“低至足以上调至少一种PhtX蛋白的表达”是指Zn2+和/或Mn2+ (结合的和/或游离的)的水平
a)低于在人体的相当位置常见的水平，使得存在于人体中的肺炎链球菌的至少一种PhtX蛋白的表达水平高于在正常条件下(即在具有一般Zn2+或Mn2+水平的个体中)在机体的相当区室中发现的肺炎链球菌的PhtX表达水平；或
b)低于在人体的高Zn2+可用性区域中发现的水平，使得存在于该位置中的肺炎链球菌的至少一种PhtX蛋白的表达水平高于在相同个体的机体的高Zn2+可用性区域中发现的肺炎链球菌的PhtX表达水平。在一个实施方案中，结合的Zn2+的水平下降。在一个实施方案中，游离的Zn2+的水平下降。通过降低Zn2+和/或Mn2+的总水平，可以实现情形a)，而通过在具有相对较低的Zn2+和/或Mn2+水平的部位处发生的肺炎链球菌感染，可以实现情形b)。PhtX蛋白是组氨酸三联体家族蛋白的一个成员。PhtX蛋白任选地是全长蛋白，但是可能是所述蛋白的片段或包含至少一个片段或全长Phtx蛋白的融合蛋白。在肺炎链球菌中表达的Phtx蛋白是全长蛋白，但是，施用给人患者的PhtX蛋白任选地是全长PhtX蛋白、PhtX蛋白的片段或包含至少一个PhtX蛋白或其片段的融合蛋白。
在一个实施方案中，PhtX蛋白选自PhtA、PhtB, PhtD和PhtE。在一个实施方案中，PhtX蛋白是PhtD。本发明涉及多组氨酸三联体家族(Pht)蛋白的成员、其片段或融合蛋白。所述PhtA、PhtB、PhtD或PhtE蛋白的氨基酸序列可以与在WO 00/37105或WO 00/39299中公开的序列(例如，就PhtD而言，与WO 00/37105的SEQ ID NO: 4的氨基酸序列1-838或21-838)具有 80%、85%、90%、95%、98%、99% 或 100% 同一性。Pht (多组氨酸三联体)家族包括蛋白PhtA、PhtB、PhtD和PhtE。该家族具有以下特征脂质化序列；由脯氨酸富集区和几个组氨酸三联体分隔开的两个结构域，可能涉及金属或核苷的结合或酶活性；(3-5)卷曲螺旋区；保守的N-末端和异源的C末端。它存在于已检验的所有肺炎链球菌菌株中。同源蛋白已在其它链球菌和奈瑟氏球菌中发现。然而，要理解的是，术语Pht A、B、D和E是指具有在上文或下文引用文献中公开的序列的蛋白，以及其天然发生(和人工制备的)变体，所述变体与参考蛋白具有至少90%的序列同源性。任选地为至少95%相同或至少97%相同。
对于PhtX蛋白而言，PhtA在WO 98/18930中公开，也称作Sp36。如上所述，其是聚组氨酸三联体家族的蛋白，并具有II型信号基序LXXC。PhtD在WO 00/37105中公开，也称为Sp036D。如上所述，它也是聚组氨酸三联体家族蛋白，并具有II型LXXC信号基序。PhtB在WO 00/37105中公开，也称为Sp036B。PhtB家族的另一成员是C3-降解多肽，在WO00/17370中公开。该蛋白也来自聚组氨酸三联体家族，并具有II型LXXC信号基序。例如，免疫功能等效物为在WO 98/18930中公开的蛋白Sp42。PhtB截短物(约79 kD)在WO99/15675中公开，它也被认为是PhtX家族成员。PhtE在WO 00/30299中公开，称作BVH-3。当本文提到任何Pht蛋白时，意味着可使用Pht蛋白的免疫原性片段或其融合体。例如，提到的PhtX包括来自任何Pht蛋白的免疫原性片段或其融合体。提到PhtD或PhtB也就提到了可见于例如WO 0198334的PhtDE或PhtBE融合体。本发明的治疗方法或用途可能涉及施用全长PhtX蛋白、PhtX蛋白片段或包含PhtX蛋白的至少I或2个片段的融合蛋白。在使用Pht蛋白片段(独立的或作为融合蛋白的一部分)时，每个片段任选地含有一个或多个组氨酸三联体基序和/或这些多肽的卷曲螺旋区。组氨酸三联体基序是多肽的一部分，具有序列HxxHxH，其中H为组氨酸，X为非组氨酸的氨基酸。卷曲螺旋区是Lupus, A等，(1991)Science 252 ;1162_1164通过“Coils”算法预测的区域。在一个实施方案中，该片段或每个片段含有一个或多个组氨酸三联体基序以及至少一个卷曲螺旋区。在一个实施方案中，该片段或每个片段含有恰好或至少2、3、4或5个组氨酸三联体基序(任选地，在2个或多个三联体之间具有天然Pht序列，或者具有三联体内序列，该三联体内序列与天然肺炎链球菌三联体内Pht序列一例如示于WO 00/37105的SEQ ID NO: 4的三联体内PhtD序列超过50%、60%、70%、80%、90%或100%相同)。在一个实施方案中，该片段或每个片段含有恰好或至少2、3或4个卷曲螺旋区。在一个实施方案中，本文公开的Pht蛋白包括具有连接的信号序列的全长蛋白、信号肽(例如在N-末端的20个氨基酸)已被去除的成熟全长蛋白、Pht蛋白的天然发生变体和Pht蛋白的免疫原性片段(例如上述片段，或含有 W000/37105 (SEQ ID NO 4、6、8 或 10)或 W000/39299 (SEQ ID NO 2、
4、6、8、10 或 14)中的氨基酸序列的至少 15、20、30、40、50、125、150、175、200、250、300、350、400,450或500个连续氨基酸的多肽，其中所述多肽能够激发对W000/37105或W000/39299中所述氨基酸序列特异性的免疫应答)。在一个实施方案中，PhtX蛋白是在WO 09/12588中描述的片段，例如包含SEQ ID NO: 2，3或4的序列或由其组成的那些。具体地说，本文使用的术语“PhtD”包括具有连接的信号序列的全长蛋白、信号肽(例如在N-末端的20个氨基酸)已被去除的成熟全长蛋白、PhtD的天然发生的变体和PhtD的免疫原性片段(例如上述片段，或含有W000/37105或W000/39299中的PhtD氨基酸序列的至少15个或20个连续氨基酸的多肽，其中所述多肽能够激发对W000/37105或W000/39299中所述PhtD氨基酸序列(例如，就PhtD而言，WO 00/37105的SEQ ID NO: 4，或TO 00/39299的SEQ ID NO: 14)特异性的免疫应答)。上述的PhtD的所有形式可以用于本发明中。在本发明的一个实施方案中，治疗或预防方法的目标是在患者血液中生长的肺炎链球菌，例如用于治疗或预防败血症或菌血症。在一个实施方案中，血液中的游离Zn2+的浓度水平小于 ΙΟηΜ、7ηΜ、5ηΜ、3ηΜ、2ηΜ、InM、700ρΜ、500ρΜ、300ρΜ、200ρΜ、ΙΟΟρΜ、70ρΜ、50ρΜ、30ρΜ、20ρΜ或ΙΟρΜ，这从血清测得。可以如下测量Zn2+水平使用标准规程，从血液样品制 备血清样品，并使用石墨炉原子吸收分光光度仪(GF-AAS)或使用原子吸收光谱法(例如通过使用Vista AX-CXD同时ICP-AES波谱仪)分析所述样品。在本发明的一个实施方案中，在血液中的结合的和游离的Zn2+浓度小于5、3、2、
1、0· 5,0. 3,0. 2 或 O. lmg/1,或小于 20、18、15、12、10、8、5、3、2、1、0· 5 或 O. I μ Μ,这从血
清测得。可以如下测量Zn2+水平使用标准规程，从血液样品制备血清样品，并使用石墨炉原子吸收分光光度仪(GF-AAS)或使用原子吸收光谱法(例如通过使用Vista AX-CXD同时ICP-AES波谱仪)分析所述样品。在本发明的一个实施方案中，在血液中的游离Mn2+的浓度小于10ηΜ、7ηΜ、5ηΜ、3nM、2nM、InM、700pM、500pM、300pM、200pM 100pM、70pM、50pM、30pM、20pM 或 10pM，这从血清测得。可以如下测量Mn2+水平使用标准规程，从血液样品制备血清样品，并使用使用原子吸收光谱法(例如通过使用Vista AX-CXD同时ICP-AES波谱仪)分析所述样品。在本发明的一个实施方案中，在血液中的结合的和游离的Mn2+浓度小于5、3、2、I、0. 5,0. 3,0. 2 或 0. lmg/1，或小于 20、18、15、12、10、8、5、3、2、1、0· 5,0. 2 或 0. I μΜ，这从血清测得。可以如下测量Mn2+水平使用标准规程，从血液样品制备血清样品，并使用使用原子吸收光谱法(例如通过使用Vista AX-CXD同时ICP-AES波谱仪)分析所述样品。在本发明的一个实施方案中，治疗或预防方法的目标是，在患者肺中生长的肺炎链球菌，例如用于治疗或预防肺炎。在一个实施方案中，肺中的游离Zn2+的浓度小于300、200、100、80、50、20、10、5、3或I μ g/kg，这从支气管灌洗液测得。在一个实施方案中，在肺中的游离Mn2+的浓度小于300、200、100、80、50、20、10、5、3或I μ g/kg，这从支气管灌洗液测得。任选地，从组织样品中测量Zn2+或Mn2+的水平，在该情况下，在肺组织中的Zn2+ (或Mn2+)的浓度小于 20、15、10、5、2 或 I μ g/g 或 300、200、150、100、50、20、10、5、2、1、0· 5 或
0.1 μ Μ，这从肺组织测得。类似地，通过原子吸收光谱法(例如通过使用Vista AX-C⑶同时ICP-AES波谱仪)，可以测量在组织样品中的离子水平。在一个实施方案中，所述肺炎链球菌感染发生在耳区室中，例如中耳，例如作为中耳炎感染。在一个实施方案中，在中耳中的Zn2+和/或Mn2+水平小于300、200、150、100、50、
20、10、5、2、1、0· 5、0· 2 或 0. I μ Μ。
在一个实施方案中，所述肺炎链球菌感染发生在脑膜中，例如作为脑膜炎感染。在一个实施方案中，在脑脊液中的Zn2+浓度小于1.5、1、0. 75、0. 5、0. 25或O. I μ M或小于100、75、50、40、25或10 μ g/L。在一个实施方案中，在脑脊液中的Mn2+浓度小于2. 5、2、
I.5、I 或 O. 5 μ g/L 或小于 50、25、10 或 5nM。在本发明的一个实施方案中，所述人患者具有降低的Zn2+和/或Mn2+水平，这通过支气管灌洗液和/或血液测试测得。“降低的水平”是指通过支气管灌洗液或血液测试测得的Zn2+和/或Mn2+水平小于一般人的水平。在本发明的一个实施方案中，要用PhtX治疗的人患者是Zn2+和/或Mn2+缺少的。也就是说，Zn2+和/或Mn2+水平低于该体液(例如，血清、脑脊液、间隙液、支气管灌洗液)的 通常水平的 90、80、70、60、50、40、30、20、10、5 或 1%。在一个实施方案中，所述人患者处于应激中。应激的患者在体内(例如在血液、间隙液、脑脊液和/或淋巴中)具有较低的Zn2+和/或Mn2+水平。在一个实施方案中，由于以前的细菌菌株(例如肺炎链球菌、脑膜炎奈瑟氏菌、流行性感冒杆菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、难辨梭菌、A群链球菌、B群链球菌和/或粘膜炎莫拉菌菌株)的感染，所述人患者在体内具有较低的Zn2+和/或Mn2+水平。所述以前的感染任选地是慢性细菌感染。在一个实施方案中，PhtX (例如PhtD)的施用是为了治疗或预防败血病、菌血症、脑膜炎、中耳炎或肺炎形式的肺炎链球菌感染。在本发明的方法或用途中，所述PhtX蛋白也可以有益地与其它抗原相组合。“组合的”(by combined)是指免疫原性组合物包含来自以下组合中的所有蛋白，其或者为载体蛋白，或者为游离蛋白，或者为二者的混合物。例如，在后文陈述的两种蛋白的组合中，两种蛋白都可以用作载体蛋白，或者两种蛋白都可以作为游离蛋白存在，或者两种蛋白都可以作为载体蛋白和游离蛋白存在，或者一个可作为载体蛋白和游离蛋白存在，而另一个仅作为载体蛋白或仅作为游离蛋白存在，或一个可作为载体蛋白和另一个可作为游离蛋白存在。当给出3种蛋白的组合时，存在类似的可能性。组合包括但不限于PhtD + NRlxR2、PhtD +NRlxR2-Sp91Cterm 嵌合蛋白或融合蛋白、PhtD + Ply,PhtD + Sp128,PhtD + PsaA,PhtD +PspA> PhtA + NRlxR2、PhtA + NRlxR2_Sp9ICterm 嵌合蛋白或融合蛋白、PhtA + Ply、PhtA+ Sp128, PhtA + PsaA, PhtA + PspA、RlxR2 + PhtD、RlxR2 + PhtA。任选地，NRlxR2 (或RlxR2)来自CbpA或PspC。任选地，其来自CbpA。其它组合包括3种蛋白组合，例如PhtD +NRlxR2 + Ply以及PhtA + NRlxR2 + PhtD。在一个实施方案中，疫苗组合物包含去毒的肺炎链球菌溶血素以及PhtD或PhtDE作为载体蛋白。在又一个实施方案中，疫苗组合物包含去毒的肺炎链球菌溶血素以及PhtD或PhtDE作为游离蛋白。在一个实施方案中，蛋白组合包括PhtD和肺炎链球菌溶血素、或PhtD和去毒的肺炎链球菌溶血素。在一个实施方案中，本发明的方法或用途使用PhtD、去毒的肺炎链球菌溶血素和至少一种肺炎链球菌荚膜糖(优选地与载体蛋白缀合)的组合。一方面，本发明提供了一种免疫原性组合物，其包含PhtX蛋白和至少4、5、6、7、8、
9、10、12、14 I、5、16、17、18或20种肺炎链球菌荚膜糖缀合物，所述缀合物含有来自不同肺炎链球菌血清型的糖。在这样的一个实施方案中，至少一种糖与PhtX蛋白(诸如PhtD)或其融合蛋白缀合，且所述免疫原性组合物能够激发针对PhtX (例如PhtD)的有效免疫应答。在本发明的另一个方面，所述免疫原性组合物包含至少4、5、6、7、8、9、10、12、14、15、16、17、18或20种肺炎链球菌荚膜糖缀合物和PhtX蛋白(例如PhtD)，所述缀合物含有来自不同肺炎链球菌血清型的糖，所述PhtX蛋白作为游离蛋白或未缀合的蛋白。在一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物包含肺炎链球菌溶血素。所述肺炎链球菌溶血素优选地如下去毒例如通过化学处理，或通过至少一个氨基酸的突变。本发明另外提供了一种免疫原性组合物，其含有药学上可接受的赋形剂和/或佐剂。 本发明的免疫原性组合物可被佐剂化，尤其是在计划用于老年人群而且用于婴儿人群时。适宜的佐剂包括铝盐，例如氢氧化铝凝胶或磷酸铝或明矾，而且可以为其它金属盐，例如钙盐、镁盐、铁盐或锌盐。任选地选择为THl型应答的优先诱导物的佐剂。这些高水平的Thl型细胞因子倾向于支持诱导针对给定抗原的细胞介导的免疫应答，而高水平的Th2型细胞因子倾向于支持诱导针对抗原的体液免疫应答。Thl和Th2型免疫应答的区别不是绝对的。实际上，个体将支持被描述为以Thl为主或以Th2为主的免疫应答。然而，经常便利地根据Mosmann和Coffman在鼠⑶4 +veT 细胞克隆中所描述的(Mosmann, T. R.和 Coffman, R. L. (1989) THl and Th2 cells:different patterns of lymphokine secretion lead to different functionalproperties. (Annual Review of Immunology, 7, 145-173 页)考虑细胞因子家族。传统上，Thl型应答与T淋巴细胞生产INF-γ和IL-2细胞因子有关。经常与Thl型免疫应答的诱导直接相关的其它细胞因子不由T细胞产生，例如IL-12。相比之下，Th2型应答与11-4、IL-5、IL-6、IL-IO的分泌有关。主要促进Thl应答的适宜佐剂系统包括单磷酰脂质A或其衍生物(或通常为去毒的脂质A -参见例如W02005107798)，尤其是3-脱-O-酰化单磷酰脂质A (3D-MPL)(关于其制备参见GB 2220211 A);以及单磷酰脂质A、任选的3-脱-O-酰化单磷酰脂质A连同铝盐(例如磷酸铝或氢氧化铝)或水包油乳剂的组合。在这些组合中，抗原和3D-MPL包含在相同的颗粒结构中，允许更有效地传递抗原性和免疫刺激性信号。研究表明，3D-MPL能够进一步增强明矾吸附抗原的免疫原性[Thoelen等，Vaccine (1998)16:708-14 ；EP 689454-B1]。增强的系统包括单磷酰脂质A和皂苷衍生物的组合，尤其是如在WO 94/00153中公开的QS21和3D-MPL的组合，或者如在WO 96/33739中公开的较少反应原性的组合物，其中QS21用胆固醇猝灭。在WO 95/17210中描述了一种特别有效的佐剂制剂，其包含在水包油乳剂中的QS21、3D-MPL和生育酚。在一个实施方案中，免疫原性组合物另外含有皂苷，其可为QS21。制剂还可以包含水包油乳剂和生育酚(W0 95/17210)。含有寡核苷酸的未甲基化CpG (W0 96/02555)和其它免疫调节性寡核苷酸(W00226757和W003507822)也是THl应答的优先诱导物，适用于本发明。业已表明，水包油乳剂佐剂自身可用作佐剂组合物(EP O 399 843B)，水包油乳剂和其它活性物质的组合也已被描述为疫苗佐剂(W0 95/17210 ；W0 98/56414 ；W099/12565 ；W0 99/11241)。已表述了其它油性乳剂佐剂，例如油包水乳剂(US 5,422, 109 ；EP O 480 982 B2)和水包油包水乳剂(US 5, 424, 067 ；EP O 480 981 B)。所有这些都构成了油性乳剂系统(尤其是在掺入母育酚时)，以形成本发明的佐剂和组合物。在一个实施方案中，油性乳剂(例如水包油乳剂)还包含乳化剂，例如吐温80和/或固醇，例如胆固醇。在一个实施方案中，油性乳剂(任选地水包油乳剂)含有可代谢的无毒性油，例如角鲨烷、鲨烯或生育酚，例如α生育酚(和任选地鲨烯和α生育酚这二者)，以及任选的乳化剂(或表面活性剂)，例如吐温80。还可以包括固醇(例如胆固醇)。生产水包油乳剂的方法是本领域技术人员熟知的。一般来说，该方法包括将含母育酚的油相与表面活性剂如PBS/吐温80 "*溶液混合，然后用匀浆器进行匀浆，对本领域技术人员应显而易见的是，包括将混合物两次通过注射器针头的方法应适于匀化小体积液体。同样地，本领域技术人员可修改在微射流仪(M110S微流体机器，最多为50个通道，在6巴的最大压力输入下2分钟的时间段(输出压力为约850巴))中的乳化方法，以产生更小体积或更大体积的乳剂。该修改可通过常规实验完成，包括测量所得乳剂，直到得到具有所需直径的油滴的制剂。 在水包油乳剂中，油和乳剂应处于水性载体中。水性载体可为例如磷酸缓冲盐水。在稳定的水包油乳剂中存在的油滴大小任选地可小于I微米，可基本上在30-600纳米的范围内，任选地基本约30-500纳米直径，任选地基本150-500纳米直径，尤其是约150纳米直径，如按光子相关光谱学所测量的。在这点上，以数目计80%的油滴应在该范围内，任选地以数目计超过90%的油滴和任选地以数目计超过95%的油滴在限定的尺寸范围内。按照常规，本发明的油性乳剂中存在的组分量为O. 5-20%或2-10%的油(总剂量体积)，例如鲨烯；且如果有α生育酚则为2-10% ;以及O. 3-3%的表面活性剂，如聚氧乙烯山梨糖醇酐单油酸酯。任选地，油(例如鲨烯)母育酚(例如α-生育酚)的比率等于或小于1，因为这样提供了更稳定的乳剂。诸如吐温80或司盘85的乳剂也可以以约1%的水平存在。在某些情况下，本发明的疫苗还包含有稳定剂可能是有利的。乳化系统的实例描述于WO 95/17210、WO 99/11241和WO 99/12565，其公开了基于鲨烯、α生育酚和吐温80的乳化佐剂，其任选地与免疫刺激剂QS21和/或3D-MPL —起配制。因此，在本发明的一个实施方案中，本发明的佐剂可另外含有其它的免疫刺激齐U，例如LPS或其衍生物，和/或皂苷。其它免疫刺激剂的实例描述于本文和“VaccineDesign-The Subunit and Adjuvant Approach，，1995, Pharmaceutical Biotechnology,第 6 卷，Powell, M. F.和 Newman, M. J.编辑，Plenum Press, New York and London,ISBN 0-306-44867-X。通过将含有本发明的免疫原性组合物的疫苗制备物经全身或粘膜途径给药，所述疫苗制备物可用于保护或治疗易于感染的哺乳动物。这些给药可包括经肌肉内(頂)、腹膜内(IP)、真皮内(ID)或皮下(SC)途径注射；或经粘膜施用至口 /消化道、呼吸道、泌尿生殖道。疫苗的鼻内(IN)施用可能用于治疗肺炎或中耳炎(由于能更有效地阻止肺炎链球菌的鼻咽携带，因此能在其最早期减弱感染)。尽管本发明的疫苗可作为单次剂量施用，但其组分也可以同时或在不同时间一起共施用(例如肺炎链球菌糖缀合物可单独施用、同时施用，或在施用疫苗的任何细菌蛋白组分之后1-2周施用，用于彼此之间免疫应答的最佳协调)。对于共施用，任选的Thl佐剂可存在于任意的或全部的不同给药中。除了单一给药途径之夕卜，还可使用2种不同的给药途径。例如，可頂(或ID)施用糖或糖缀合物，可IN (或ID)施用细菌蛋白。另外，本发明的疫苗可頂施用初次剂量，IN施用加强剂量。疫苗中的蛋白抗原的含量通常在1-100 μ g的范围内，任选地5-50 μ g，例如在5-25 μ g的范围内。在初始接种后，受试者可接受I次或数次足够间隔的加强免疫。疫苗制剂一般描述于Vaccine Design (“The subunit and adjuvant approach”(Powell M. F.和 Newman M. J.编辑)(1995) Plenum Press New York)。在脂质体中的囊化描述于Fullerton,美国专利4，235，877。本发明的疫苗或免疫原性组合物可储存在溶液中，或低压冻干。在一个实施方案中，溶液在用作无定形冻干保护剂的糖存在下冻干，所述糖例如为蔗糖、海藻糖、葡萄糖、甘露糖、麦芽糖或乳糖。在一个实施方案中，溶液在用作无定形冻干保护剂的糖和提供改善的块状结构的填充剂(例如甘氨酸或甘露醇)存在下冻干。晶体填充剂的存在允许在高盐浓度存在下缩短冻干周期。用于冻干本发明的免疫原性组合物或疫苗的这些混合物的实例包括 蔗糖/甘氨酸、海藻糖/甘氨酸、葡萄糖/甘氨酸、甘露糖/甘氨酸、麦芽糖/甘氨酸、蔗糖/甘露醇/海藻糖/甘露醇、葡萄糖/甘露醇、甘露糖/甘露醇和麦芽糖/甘露醇。典型地，两种成分的摩尔比率任选地为1:1、1:2、1:3、1:4、1:5或1:6。本发明的免疫原性组合物任选地含有上述冻干试剂。上述稳定剂和稳定剂的混合物还可以包括能够增加制剂的玻璃化温度(Tg’ )的聚合物，例如聚(乙烯吡咯烷酮)(PVP)、羟乙基淀粉或葡聚糖，或者用作晶体填充剂的聚合物，例如聚乙二醇(PEG)，例如具有1500-6000分子量的聚乙二醇，和葡聚糖。尽管本发明的免疫原性组合物可通过任何途径施用，但将所述疫苗施用到皮肤中(ID)构成了本发明的一个实施方案。人皮肤含有外“角状”表皮，叫做角质层，其覆盖表皮。在此表皮下面是叫做真皮的层，其又覆盖皮下组织。研究者已表明，将疫苗注射到皮肤中，尤其是真皮中，刺激免疫应答，其还可能与许多其它优势有关。用本文所述疫苗皮内接种构成了本发明的可选特征。皮内注射的常规技术“芒图操作(mantoux procedure)”包括下述步骤清洁皮肤，然后伸出一只手，使小号针(26-31号)的斜面朝上，以10-15°的角度将针插入。一旦针斜面被插入，就降低针管并前推，同时轻压使其在皮肤下抬高。然后将液体非常缓慢地注入，这样便在皮肤表面上形成一个大包或肿块，接着缓慢抽出针。近来，已描述了特别设计用于皮内或通过皮肤施用液体制剂的装置，例如在WO99/34850 和 EP 1092444 中描述的装置，以及例如在 WO 01/13977、US 5, 480, 381, US
5,599, 302,US 5,334，144,US 5, 993, 412,US 5, 649, 912,US 5,569，189,US 5, 704, 91UUS
5,383, 85UUS 5, 893, 397,US 5, 466, 220,US 5,339，163,US 5, 312, 335,US 5, 503, 627,US5，064，413、US 5，520、639、US 4，596，556、US 4，790，824、US 4，941，880、US 4，940，460、WO 97/37705和WO 97/13537中描述的喷射注射装置。疫苗制剂的真皮内给药替代方法可包括常规注射器和针，或设计用于固体疫苗的弹道式给药的装置(W0 99/27961)，或透皮贴剂(W0 97/48440 ；W0 98/28037);或皮肤表面给药(经真皮或经皮传送，WO 98/20734 ；W098/28037)。在所有情况下，本发明人都意欲用术语“由……组成”分别任选地取代本文的术语“包含”、“含有”和“包括”。
本文的涉及本发明的“疫苗组合物”的实施方案也适用于与本发明的“免疫原性组合物”相关的实施方案，反之亦然。在本专利说明书中提及的所有参考文献或专利申请都通过引用结合到本文中。为了可更好地理解本发明，提供以下实施例。这些实施例仅是为了例证目的，不应解释为以任何方式限制本发明的范围。
实施例方法
动物
在该研究中使用的OFl和CBA/J雌性小鼠购自Charles River实验室(Lyon，法国)。Balb/c小鼠购自Harlan (Horst，荷兰)。根据比利时国家动物实验指南，在 GlaxoSmithKline Biologicals (GSK, Rixensart,比利时)进行所有实验和测定。细菌菌株和培养条件
菌株2/D39由JC Paton (University of Adelaide,澳大利亚)友情提供。从疾病控制和预防中心(⑶C)得到菌株4/⑶C和6B/⑶C，从美国典型培养物保藏中心(ATCC)得到 19F/2737 菌株。菌株 3/43 由 E Yourassowski (Brugmann Hospital, University ofBrussel,比利时)提供。肺炎链球菌菌株TIGR4 { Tettelin 2001 }由 Andrew Camilli (TuftsUniversity School of Medicine, Boston, MA, USA)友情提供。WU2 菌株由 David EBriles (University of Alabama at Birmingham, Birmingham, Alabama, USA)友情提供。从⑶C (疾病控制和预防中心)得到4型菌株。在37 V /8%C02,在含有 O. 5% (w/v)酵母浸出物的 Todd-Hewitt 培养基(THB，Difco)中常规地培养肺炎球菌。在适当时，分别以O. 2和250 μ g/ml的浓度加入红霉素和/ 或壮观霉素(Sigma-Aldrich, Bornem,比利时)。在含有或不含I. 5% (w/v)细菌培养用琼脂(Difco)的Luria-Bertani培养基(LBT, Difco)中，在37°C培养大肠杆菌DH5a和JM109菌株(Gibco BRL, LifeTechnology)16 h。在适当时，以100 μ g/ml的浓度,将红霉素或壮观霉素加入生长培养基中。就关于Pht出现的研究而言，除了 23个自制的和肺炎球菌分子流行病学网络(PMEN)菌株以外，TJ Mitchell (苏格兰)提供了 34种分离物，RE Gertz (美国)提供了 6种分离物，AB Brueggemann (英国)提供了 2种分离物,9种分离物来自美国典型培养物保藏中心(ATCC)。抗原
CbpA (或 PspC)是一种截短的重组蛋白，如 Brookes-Walter 等人 J. Infect. Dis. 67;6533-6542( 1999)所述，由JC Paton友情提供。所述蛋白从D39菌株的序列构建而成，因而属于进化枝(clade)A。PspA (进化枝2)和PsaA是源自2/D39菌株的重组蛋白(Ogunniyi等人 Infect. Immun. 68; 3028-3033 (2000)) 二者由 JC Paton 提供。DNA处理和分析
使用 Plasmid Midi 或 Mini Purification 试剂盒(Qiagen Benelux, Venlo,荷兰)，得到大肠杆菌质粒DNA。使用QIAquick PCR纯化试剂盒，纯化PCR产物，并使用QIAquick凝胶提取试剂盒(Qiagen),在1% (w/v)琼脂糖凝胶上纯化DNA消化物。从New EnglandBioLabs (ffestburg, Leusden,比利时)得到限制酶和连接酶。将 Expand High Fidelity系统(Roche, Mannheim,德国)用于这些研究的每个PCR反应。在供应商推荐的条件下,使用所有商业产品。在Applied Biosystems 自动化 DNA 测序仪(模型 3100) (Applied BiosystemsInc, Forster City, CA, USA)上，使用 Big Dye Terminator Sequencing 试剂盒进行 DNA测序。用 MacVector V6. 5 软件(Oxford Molecular Ltd. , Madison)或 Vector NTI 7. I软件(Informax),进行序列分析,并与可得到的肺炎链球菌TIGR4基因组序列(www. tigr.org) { Peterson 2001 }进行序列对比。肺炎链球菌基因组DNA提取
通过将来自I或2个大量接种的血琼脂平板的汇合的过夜生长物收获进I ml TE (10 mM Tris-HCl; 5 mM EDTA; pH 7. 8)中，得到来自每个菌株的染色体DNA。将细菌悬浮液在微量离心机中在最高速度离心5分钟，将沉淀物重新悬浮于75μ1 TE中。通过相继加入20μ1溶菌酶(100 mg/ml)和20μ1蛋白水解酶K (20 mg/ml)，并在37°C温育45分钟，得至Ij细胞裂解物。然后，加入500μ1裂解缓冲液(10 mM Tris-HCl, pH 8. O; O. 14 M NaCl; O. IM柠檬酸钠；I mM EDTA, pH 8.0; 0.1% (w/v)脱氧胆酸钠)，并在室温温育10分钟。在该温育时段结束时，将250μ1乙酸铵(7. 5 mM, pH 7. 7)加入粗裂解物中，并在冰上温育10分钟。用苯酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)萃取粘稠的DNA 2次，并在异丙醇中沉淀。用70%(v/v)乙醇洗涤得到的DNA，并重新悬浮于50μ1含有0·6μ1 RNA酶A (10 mg/ml)的TE中。在4°C保藏DNA悬浮液。RNA 分离
从肺炎球菌分离出总RNA，所述肺炎球菌在THY中从O. 01的600 nm光密度(0D_)生长至不同0D_，以评价在不同生长期的基因表达(对数期早期，OD600=O. 3 ;对数期晚期，OD600=O. 9 ;静止期，OD600=L 2)。将细胞离心，并重新悬浮于含有6 mg溶菌酶ml-1和I mg脱氧胆酸钠πιΓ1的、不含RNA酶的Tris-EDTA中，在室温温育10 min。温育后，按照生产商的说明书，用QIAGEN RNeasy Mini试剂盒进行RNA分离。如下消除污染的基因组DNA :与I单位的DNA酶I /^g RNA 一起在37°C温育RNA样品I h，随后用2. 5 mM EDTA在65°C进行DNA酶灭活10 min。按照生产商的说明书，使用Ribogreen RNA定量试剂盒(MolecularProbes),定量总 RNA。 cDNA末端的5，-快速扩增(RACE)
从Ranasinghe & Hobbs { Ranasinghe 1998 }改进出用于鉴别转录起点的方法。简而言之，使用对基因的3’末端特异性的引物,按照生产商的说明书,使用SuperscriptII逆转录酶(Invitrogen)从总RNA合成第一链互补DNA (cDNA)。然后加入RNA酶A在室温I h，以在cDNA-RNA杂交物上产生3’平端。使用T4 DNA连接酶(在16°C温育过夜)，将所述杂交物插入EcoRV-消化的pKS质粒(Stratagene)中。使用另一个反向3’末端特异性的PhtE引物和pKS特异性的T7启动子引物，启动PCR反应，以扩增5’末端。进行pKS_cDNA连接的测序，以鉴别+1碱基。 转录终止子鉴别基于 Brendel 和 Trifonov 的方法{ Brendel 1984 },使用 Wisconsin序列分析包 10. I版(Genetics Computer Group),进行终止子鉴别。RT-PCR
如下进行RT-PCR研究。首先在含有ΙΟμΜ 3’ -末端基因特异性的反向引物和20单位RNaseOut的混合物(10μ1总体积)中在65°C使RNA (2Pg)变性5 min。然后通过加入5 mM二硫苏糖醇、I mM dNTP、15 单位的 Thermoscript 逆转录酶(Invitrogen)、IX cDNA 合成缓冲液和不含RNA酶的无菌水至20μ1的体积，进行反转录反应。将反转录混合物在56-58°C温育I小时，随后在85°C逆转录酶变性5 min。通过与I单位的RNA酶H —起在37°C温育所述反转录溶液20 min,降解在RNA-cDNA杂交物上的RNA链。使用用于反转录反应的不同 的5’基因特异性的正向引物和3’基因特异性的反向引物(0. 5μΜ终浓度)、0. 2 mM dNTP、耐热性DNA聚合酶反应缓冲液、2. 5单位的耐热性DNA聚合酶(Amersham Biosciences)和无菌水(至50μ1的体积)，使用2μ1 cDNA,进行PCR反应。PCR循环由如下组成在94°C初始变性5 min，随后是25-30个在94°C变性15-30秒、在55°C (#访、#妨)或63°C iphtB、D、J)退火15-30秒和在72°C延伸I min的循环，以在72°C保持5_7 min的最终延伸步骤结束。还进行由RNA组成的阴性对照(没有反转录反应)，以排除RNA制备物中的DNA污染。通过1% (w/v)琼脂糖凝胶电泳，分离PCR产物，并通过溴化乙锭染色进行显影。Pht突变体的制备
从在大肠杆菌中复制、但是不在肺炎链球菌中复制的pGEM-T载体(Promega Benelux,Leiden,荷兰)，构建诱变物载体。它们含有在抗生素抗性基因周围的、通过PCR扩增的、与要缺失的Pht基因的上游和下游区域相对应的重组区(用于构建诱变物载体的引物和限制位点可以应请求而提供)。为了制备四重Pht-缺陷型突变体，必须使用2个不同的抗生素抗性基因，以便组合在2个不同基因座(基因座访和基因座妨冲的缺失。对于phtD/phtE基因座，选择红霉素抗性基因iermB、,其从pJDC9载体的衍生物扩增而来。对于妨基因座，使用从pR350质粒(由J Paton友情提供)纯化出的壮观霉素抗性基因(aai/设)基因)。使用不同的构建质粒，在DH5a或JM109大肠杆菌菌株中进行克隆，并铺板在含有各自抗生素的LB琼脂上。通过使用CaCl2-处理过的细胞的标准方法{ Hanahan 1985 }，进行用质粒DNA转化大肠杆菌。如下制备用于转化的4/CDC肺炎链球菌菌株进行2个连续的培养步骤，然后用在CTM培养基(10 g/Ι酪蛋白氨基酸；5 g/1胰蛋白胨；5 g/1 NaCL; 10 g/1酵母浸出物；O. 4 M K2HPO4; 20% 葡萄糖；30 mg/ml 谷氨酰胺；1% BSA, O. I M CaCL2; pH 7.8)中的重新悬浮液制备等分试样，并在15%甘油中冷冻。那些等分试样用于转化。融化后，加入CSP-I或CSP-2(100 ng/ml，在CTM培养基中)，以诱导感受态，并在37°C温育细菌。采取不同的时间点(5、10、15和20 min)来优化感受态。加入I μ g诱变物载体以后，在摇动下在32°C温育细胞30 min，然后在5% CO2下在37°C温育2_4 h。最后，将细菌铺板在含有适当抗生素的血琼脂上。对于四重突变体，使用与上述相同的方案，用携带PhtA、B缺陷的质粒转化PhtD, E-KO菌株。SDS-PAGE和蛋白印迹分析
如下得到热杀死的细菌悬浮液将来自5个大量接种的血液琼脂平板的汇合的过夜生长物收获进 I ml 无菌的 PBS(0. 14 M NaCl, 2. 7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, L 8 mM KH2PO4,pH 7. 2)中，并在56°C温育45分钟。然后，将样品缓冲液(60 mM Trizma碱，1% (w/v)SDS, 10% (v/v)甘油，0，01% (w/v)溴酹蓝，2% (ν/ν) β -巯基乙醇)加入热杀死的悬浮液中。将制备物煮沸5分钟，在微量离心机中在最大速度离心2分钟，并如Laemmli所述{ Laemmli 1970 },通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行分离。如{ Towbin1979 }所述，通过电泳将蛋白从丙烯酰胺凝胶转移到硝酸纤维素膜(Bio-Rad，Richmond,CA)上。用针对PhtD产生的小鼠多克隆抗体，随后用与碱性磷酸酶缀合的山羊抗-小鼠IgG(Promega Benelux.),探测膜。使用NBT/BCIP底物系统,使酶标记的带显影。在缺乏离子的培养基中的培养物生长
在不同的离子耗尽(depletion)或补充条件下，在化学上确定的合成培养基(MS) {SICARD 1964 }中，培养野生型4/⑶C菌株和对应的PhtD-和Pht四重缺陷型突变体。给MS培养基交替地补充递增浓度的Mn2+、Fe2+、Fe3+、Cu2+或Zn2+。在对数期中和在静止期时，监测在600 nm的光密度。将结果与野生型的结果进行对比。 在含有或没有Zn特异性的螯合剂N，N，N’，N’，-四(2_吡啶基甲基)乙二胺(TPEN)下，培养野生型WU2菌株，以在RNA (通过RT-PCR)和蛋白(通过流式细胞术)水平观察锌耗尽对Pht表达的效果。流式细胞术
在37°C、8% CO2，在THB + 0.5%酵母浸出物中培养WU2细菌直到对数期。或者，将TPEN30μΜ(锌螯合剂)加入培养基中。离心后，将细菌沉淀物重新悬浮于含有抗-PhtE、抗-PhtB/D、抗-PhtD/E或抗-3型多糖单克隆抗体(作为对照)的溶液中。在4°C保持2 h以后，将溶液离心，在PBS-BSA 2%中洗漆细菌沉淀物,然后在AlexaFluor (Molecular Probes)-缀合的山羊抗-小鼠第二抗体的PBS-BSA 2%溶液中，在室温温育它们I h。洗涤后，在PBS-甲醛0. 25%中固定细胞，并进行FACS分析。记录表面荧光的中位值。 定量反向-转录酶PCR
使用RNeasy Midi试剂盒(Qiagen)将来自生长至0. D. 0. 5 (对数期中期)的D39菌株的总RNA纯化,并用Quant-iT RiboGreen RNA测定试剂盒(Invitrogen)定量。样品(I μ g)用I. 5 μ I的RQl RNA酶-缺乏的DNA酶(Promega)在37°C处理30分钟两次。通过添加I μ I的DNA酶STOP终止反应，随后在65°C温育10分钟。使用Superscript II反向转录酶(Invitrogen)、随机引物(Invitrogen)和重组的RNasin 核糖核酸酶抑制剂(Promega)产生第一链cDNA。如生产商所述,使用TaqMan PCR核心试剂的试剂盒(Applied Biosystems),在50 μ I的反应体积中进行实时PCR。使用下述引物和探针-.gyrB，GGGAAATAGCGAAGTGGTCAAG (正向)，GGAATCGGAGAAGGCTTCAC (反向)和 TTACCAATCGCCTCTTC(探针)'phtD, CCCATGCGGACAATATTCG (正向)，TGACTGCGTTCCTGCTTCTG (反向)，CGTTTAATCTCTTCTTTTGT (探针)。所有测定以两份重复进行(从培养到q-PCR)，并通过2_“CT方法(Livak和Schmittgen, 2001 )，使用gyrB作为内在对照并在单独的THB中生长作为校准物，分析相关基因转录。Pht出现的测定
为了选择肺炎链球菌的代表性菌株，根据通过MLST (多基因座序列类型(Multi-LocusSequence Type) ; www. mist, net)测得的菌株基因型,分析群体结构。基于MLST分离物序列类型(ST)，测定主要的克隆谱系。对于每个组，选择代表性的菌株用于出现分析，所述出现分析通过蛋白印迹法使用抗-PhtD多克隆抗体(与A、B和D交叉反应性的)或抗-PhtE在全细菌提取物上进行，并使用对PhtA、B、D或E特异性的引物通过PCR在肺炎球菌基因组DNA上进行。用于PhtD保守分析的DNA测序
使用PhtD特异性的寡核苷酸引物，对107个MLST-选择的菌株的DNA进行PCR扩增。通过ClustalX程序，比对107个序列，并通过Superneedle程序,计算同一'丨生(同一'I"生百分比是100 X (相同物的数目/最短序列长度))。实施例I pht基因的表征
ph t基因的基因组构成(organiza tion)
在以前的工作中，来自肺炎链球菌菌株SP64基因组文库{ Hamel 2004 }的重叠克隆的DNA测序和PCR分析允许推论出在该6B型菌株中的pht基因和它们的邻近基因的基因组构成。phtA和phtB基因以及PhtD和PhtE基因构成一对。在TIGR网站(www. tigr. org)上的BLAST分析{ Peterson 2001 }指示，2个基因串列(tandem)在肺炎链球菌TIGR4基因组中的位置相隔约161 kbp，且所述基因组构成与在SP64菌株中观察到的构成相同(图I)。相同的# 基因构成也存在于4/CDC菌株和WU2菌株中，例外是，phM在后者中缺失(数据未显示)。在TIGR4菌株DNA上的pht基因周边测序证实了后一观察结果(数据未显示)。另外的分析证实在选择用于进一步研究的TIGR4菌株中，phtA和/ 妨相隔157 bp,而 ph tD 和 ph tE 相隔 209 bp。IphtD-phtE串列一侧，与编码层粘连蛋白结合蛋白的A和B群链球菌基因(分别具有登录号 ΑΑΚ34689 { Ferretti 2001 }和 AAD13796 { Spellerberg 1999 })具有72%序列相似性的基因位于#切基因上游7 bp处(图I)。该基因产物最近还被命名为AdcAII，并被描述为ABC转运蛋白样锌结合蛋白{ Loisel 2008 }。1392-bp ORF(位于
基因同系物上游142 bp处)编码这样的蛋白所述蛋白与枯草芽孢杆菌代谢物转运蛋白YfnA蛋白(登录号D69814)具有64%序列相似性，并与酿脓链球菌的假定氨基酸通透酶(登录号AAK33157) { Ferretti 2001, Kunst 1997 }具有81%相似性。在#访终止密码子以后226 bp处发现与#访的前481 bp (提议的具有79%同一性的序列(图I)。该序列也显示出与# 瓜沒廣D基因的72%同一性。在汾串列一侧，1332-bp ORF(其与唾液链球菌基因(登录号P30299){ Gagnon 1992 }具有73%序列相似性)位于/7AM基因上游253 bp处(图I)。与在全基因组序列(登录号AAK75285)中发现的基因相比，该基因在我们测序的TIGR4菌株中呈现移码。无功能的ORF位于2个基因对的下游紧邻处。实施例2
ph t基因的转录构成
Pht基因的基因组构成提示串列基因可能被同等地转录。因而进行了进一步研究来检查该假设。首先，鉴别了基因的假定启动子和核糖体结合位点。在#访基因上的5’ -RACE允许鉴别出它的转录起点，从所述转录起点推论出启动子区域。发现转录起始位点(+1)位于PhtE翻译起始位点上游96碱基处，位于典型的肺炎链球菌-10和-35 RNA聚合酶结合位点的下游{ Morrison 1990 }和核糖体结合位点的上游(图2a)。在phtA、phtB和基因的上游发现了类似的序列构成，这指示假定启动子的存在(图2b、c和e)。但是，由于基因的紧密接近(7 bp)，没有鉴别出#切基因的启动子序列。另一个方面，与其它基因的-35序列相同的序列位于基因的上游(图2d)。在所有起始密码子上游的5-7 bp处观察到核糖体结合位点。还鉴别了和邻近基因的转录终止位点。预测的mRNA 二级结构的计算机分析提示，茎-环终止子样结构在基因的3’末端处的存在。可以形成发夹结构，其对于#妨、
和而言分别具有-9.4、- 27.0、- 16. 8和-21.6 kcal πιοΓ1的计算解离自由能(AG),这通过Turner等人(1988)的方法{ Turner 1988 }测得(图3)。实际上,鉴别的#切基因的终止子与TIGR网站报道的ORF SP1003的终止子相同，所述ORF SP1003与M切基因同系物对应(WWW, tigr. org)。TIGR组没有鉴别出其它或周边基因的转录终止子，这可能反映了两项研究使用的算法的差异。大多数发夹以一段T残基结束，正如在 原核转录终止子中常见的{ Rosenberg 1979 },并位于终止密码子下游70 bp以内(图3)。令人感兴趣地，#访终止子序列(AG为-4.7 kcal πιοΓ1)位于它的终止密码子和基因下游1867 bp处，后一个含有框架内终止密码子的ORF会阻止它的翻译(图3a)。在和Imb基因的下游没有鉴别出终止子序列。所述基因组构成提示，可以是由瓜和ρΑ /7基因组成的操纵子的一部分。尽管如此，5’ -RACE (图2a)和终止子鉴别(图3a)指示，#访是在双顺反子信息(由#访和基因组成)上转录的第一个基因，这得到RT-PCR的证实。通过RT-PCR扩增了 #访至# #区域(图4a，泳道4和6 )，而使用对基因ph tD和ph tE之间的区域特异性的引物对，没有得到扩增产物(图4a，泳道5)，这指示在#切下游的转录终止(图 3c)。如图4a (泳道1-3)所示,RT-PCR扩增了至/ 切区域。此外，Loisel等>1 {Loisel 2008 }已经证实,该/ 切转录物除了编码和/ 切以外，还编码在上游的2个基因(涉入细胞色素c的生物起源的ccdA和表现出与硫氧还蛋白的相似性的spr0904\令人感兴趣地，在Imb基因上游的假定启动子的鉴别(图2d)提示PhtD和Imb基因的转录偶联。得到的#妨和#M基因的结果证实它们被转录为单顺反子mRNA，正如启动子(图2b和c)和终止子位点鉴别(图3b和d)所提示的。使用phtB特异性的引物通过RT-PCR对/AM和的转录构成的分析揭示了特异性的扩增子(图4a，泳道7)。使用扩增PhtA和phtB之间的区域的引物，通过RT-PCR没有得到扩增产物(图4a，泳道8)，这指示PhtA和#妨基因的单顺反子构成。终止子位点鉴别(图3e)指示，被转录为单顺反子信息，其也证实不是多顺反子转录物的一部分。实施例3
Pht突变体的构建和用途 突变体的表征
构建了突变体PhtA' PhtB' PhtD' PhtE—和四重突变体PhtABDE'为了评估重组的准确度，纯化出突变株的基因组DNA，并对重组区域测序(数据未显示)。此外，使用小鼠多克隆抗-PhtD抗体，通过免疫印迹法在表型方面表征所述突变体(图5)。所有4个Pht同种型都被该抗体识别。但是，PhtE带较模糊，这证实了来自另外3个菌株的该Pht的最大趋异(divergence)。各种离子对细菌生长的影响
与野生型菌株的生长和不同的Pht单个突变体的生长相比，Pht四重突变体在MS培养基中的生长急剧下降(图6a)。当给所述培养基补充最多200 1^的？62+、2112+或胞2+时，野生型的生长和PhtD-缺陷型突变体的生长稍有改善(相对于单独的MS的生长速率96-130%)。相比之下，四重突变体的表现是惊人的。尽管200 μ M Fe2+向单独MS中的加入仅诱导了
25.3%的生长增加(图6d)，但是相同浓度的Zn2+或Mn2+恢复了四重突变体的生长能力(图6b、c)。这代表生长速率的最多92. 3%增加(与在单独的MS中得到的结果相比)。但是，生长速率的这种恢复被延迟，仅在过夜温育以后可见到，在培养的前几小时内不可见到提高。200μΜ的Mg2+的加入没有完全恢复生长，Zn2+或Mn2+也是如此，但是当将I mg / ml Mg2+加 入MS中时，得到生长速率的类似增加(数据未显示)。高浓度的Cu2+的加入对于野生型和突变株而言是有毒的(数据未显示)。实施例4
锌耗尽对ph t表达的影响
当将锌螯合剂TPEN加入培养基中时，Pht蛋白的表达水平增加，这通过流式细胞术实验测得(图7a、b、c)。作为对照，在相同的锌耗尽条件下，使用抗-3型多糖抗体没有观察到平均荧光的迁移(图7d)。在RNA水平，我们通过RT-PCR可以测量到在锌耗尽条件下phtE转录水平的最多25倍增加(数据未显示)。另外，使用从在THB或THB+ 25 μ M TPEN中生长的肺炎球菌分离物(D39菌株)纯化的mRNA进行q-RT-PCR实验。添加到培养基中的螯合剂浓度是亚最适的，如预实验测定的，这意味着TPEN不会阻止生长(如当TPEN浓度高至足以螯合培养基中的所有离子时观察到的)，但是会延迟生长(数据未显示)。将TPEN添加到培养基中引起#切mRNA表达水平4. 84倍增加。用25 μ M的ZnSO4补充ΤΗΒ+ΤΡΕΝ \1klphtD mRNA表达至与在仅培养基中观察到的类似水平，这表明在可被TPEN螯合的所有离子(Zn、Mn、Cd、Co、Ni、Cu、Mg、Ca)中，Zn %phtD表达水平具有主要影响。实施例5
Pht在肺炎球菌中的出现
共研究了 74个菌株(包括23个PMEN和内部菌株)。在该组代表性的菌株中，代表了 18个克隆谱系，46个具有27个不同ST的菌株(61%)属于3个主要的克隆组(I、11和23);存在56个不同的ST，在它们中，更有代表性的是81、90、124、156、162和199 (22个菌株)；并存在27个不同的血清型，在它们中，更有代表性的是19F、6B、3和23F(占所有菌株的47%)。通过对基因组DNA的PCR，我们分别在100%、97%、81%和62%的菌株中发现了PhtD、PhtE、PhtB和PhtA的基因。发现54%的菌株在它们的基因组中携带所述4个基因。使用针对PhtD产生的多克隆抗体进行免疫印迹，我们可以在所有菌株中检测到PhtD。同样地，通过免疫印迹法，在携带它们各自的基因的所有菌株中发现了其它Pht。值得注意的是，由于最高的遗传趋异，使用针对PhtE特异性地产生的多克隆抗体，更好地检测到PhtE (图8)。发现了一些特殊的Pht，诸如在6个分离物中的更小尺寸(小于ΙΟ-kDa)的PhtE，和在8个菌株中甚至更小尺寸(小于20-kDa)的PhtE。同样地，发现4个菌株会产生截短的PhtA(图8)，该基因通过PCR没有检测到。令人感兴趣地，这4个菌株也表达20-kDa截短的PhtE。至少，phtB阴性菌株的基因座的测序已经揭示呈现在该基因座中的唯一基因是和#妨之间或/7AM和/A切基因之间的杂交物。令人感兴趣地，序列分析已经证实由基因编码的信号序列对每个Pht家族成员是特异性的。实际上，Pht家族成员的特异性的信号序列与另一个Pht家族成员的信号序列至少在一个位置不同(参见表I)。接着，尝试确定是否可以在Pht表达谱和分离物基因型/血清型之间建立联系。在分析的菌株中，所有血清型2、4、14、6Β和7F分离物具有4种Pht，且所有血清型3、9、19F和22F分离物缺少PhtA，或携带更小的PhtA。·关于MLST基因型和Pht表达谱之间的潜在联系，可以测定下述特征10-kDa_截短的PhtE主要存在于基因型ST 199组中。这些菌株的血清型是19F、19A、15A、1和6A。在8种分离物中观察到20-kDa-截短的PhtE，所述分离物都属于同一克隆谱系(组1)，但是携带不同的血清型(9、19A、19F、14)。最后，在不同的克隆谱系中观察到缺少PhtA的菌株。因此，没有鉴别出PhtA的缺少和基因型之间的主要联系。实施例6 PhtD保守
在Pht出现研究中，发现PhtD存在于测试的所有肺炎球菌菌株中，这指示它是在Pht家族中的最好疫苗候选物。在这方面，发现必要的是测定在肺炎球菌菌株中的序列保守水平。为此，进行了 DNA测序。从107个菌株的分析(基于MLST分类)，确定了 PhtD长度在831-853个氨基酸之间变化，具有约100 kDa的分子量。发现PhtD在107个测试菌株中是高度保守的，仅I个序列表现出作为截短蛋白的停止(菌株4/75)。所有菌株的富含脯氨酸的区域含有13-15个脯氨酸(在7个菌株中，仅11-13个脯氨酸)。在PhtD的序列中发现了〈4个氨基酸的有限变异性段。讨论
所述Pht蛋白是有希望的并入针对肺炎球菌感染性疾病的疫苗中的候选物。在这方面，研究如何调节这些蛋白的表达看起来是至关重要的，以便更好地定义它们在肺炎球菌发病机制中的作用。基因组分析显示四个基因同源物以串联排列。也证实了基因家族的第5个成员(尽管是截短的)在#访基因下游的存在，这证实了在以前的研究中的发现{ Adamou2001 }。该截短物看起来是保守的，因为在肺炎链球菌菌株R6基因组(登录号AAK99714)中发现了相同的构成{ Hoskins 2001 }。我们的研究证实，基因的串联构成与双顺反子转录没有关联。在测试的条件下，这些基因都不会与它们的相关相邻基因共转录。启动子和终止子分析与传统的RT-PCR研究较好地关联。我们证实，#妨、/AM和#访基因都具有各自的假定启动子，并且mRNA转录可能在对应的终止密码子以后不久就结束。另一个方面，观察到#切基因的特性。实际上，在计算机芯片中(in-silico)没有鉴别出#切的启动子。相反，鉴别出Imb和基因(ML千PhtD的上游的2个基因)的启动子，但是没有鉴别出转录终止子，这倾向于指示那些基因被组装在操纵子系统中。这确证了最近的发现，即#切可能与4个上游基因一起在大操纵子系统中表达{ Loisel 2008 }。尽管如此，鉴别出和的启动子的事实指示转录可能在这些位置开始，这意味着可能生成不同长度的含有#切的转录物。另外，在基因的上游鉴别出adcR结合位点{ Loisel 2008, Panina 2003 }，这倾向于表明也可能存在锌调节的含有和#切的双顺反子转录物，这已经被其它作者提出。Spellerberg等人的研究{ Spellerberg 1999 }证实，B群链球菌(GBS) 基因与这样的基因共转录，所述基因的产物与基因产物(登录号AF062533)的前225个(#访)和前22私^iphtA、phtD取phtB)氨基酸具有67%序列相似性。在A群链球菌(GAS)基因组中也观察到相当的基因组排列{ Ferretti 2001 }。此外,提出了和/ 切的共转录可能指示功能联系，后一个基因产物涉及肺炎球菌附着和侵入{ Panina 2003 }。有兴趣的是，注意到#切基因可以与2个其它基因廣(它们可能分别涉及运输和特异性结合活性)一起转录为多顺反子信息。实际上，认为在肺炎链球菌中的YfnA{ Hoskins 2001 }以及在枯草芽抱杆菌{ Yamamoto 1997 }、酿胺链球菌{ Ferretti2001 }和变异链球菌{ Ajdic 2002 }中的同源蛋白是氨基酸转运蛋白，即通透酶超家族 的成员。至于Lmb蛋白，已经将它描述为ABC转运蛋白-样锌结合蛋白{ Loisel 2008 }和假定的层粘连蛋白结合蛋白{ Spellerberg 1999 }。实际上,该蛋白表现出与粘附素家族(称作Lral，最初在口腔链球菌中发现)的相似性{ Jenkinson 1994 }，但是此后在其它链球菌和属中发现{ Cockayne 1998 }。表明LraI-样蛋白涉及链球菌对人上皮的定殖(colonization)和随后它们向血流中的侵入{ Elsner 2002 }。不清楚为什么_7乃^、7 办和#切在操纵子系统中相关联。一种看起来合理的假设是，在细菌周期(cyclus)的同一时刻需要这3种蛋白用于侵入或生长，例如不一定在它们的功能方面相关联。但是，Pht蛋白的作用的确定可能给出该基因组关联的一些线索。我们可以推测物种内Pht蛋白之间的相似性会指示可互换的作用。还可能是蛋白通过它们的同源区域而具有类似的功能，并同时产生不同的活性(甚至在细菌的不同发育阶段)。我们使用蛋白提取物(来自我们已经生产的各种Pht-缺陷型突变体)已经在免疫印迹法中得到的结果倾向于证实不存在通过增加剩余的基因产物的表达水平来补偿基因损失。最近，使用RT-PCR，也在RNA水平描述了该特征{ Ogunniyi 2009 }。如已经提及的，所有Pht蛋白共有组氨酸三联体基序{ Adamou 2001, Hamel2004，Zhang 2001 }，所述基序被认为会参与金属结合。令人感兴趣地，已经推测，这些基序可能参与锌结合，特别是产生构象上有功能的Pht蛋白{ Panina 2003 }。相同的作者还假定，锌限制的环境会诱导Pht蛋白的表达，并有利于链球菌定殖和侵入。在该背景下，我们进行了实验，其中在不同的离子耗尽和补充条件下培养野生型和Pht-缺陷型菌株。在基本合成培养基中，野生型和PhtD-缺陷型菌株比在富集的LB培养基中更缓慢地生长，但是在基本培养基中几乎没有观察到四重Pht-缺陷型突变体的生长。惊人的是，当加入Zn2+或Mn2+时，在20-200 μ M范围的浓度，特别明显的是四重突变体的生长恢复至野生型的生长。但是，我们的结果表明，与野生型相比，四重突变体的生长发生延迟。这些观察结果除了证实细菌生长对Zn2+和Mn2+的需要以外，还支持了 Pht家族在Zn2+和Mn2+摄入中的关键作用。如我们已经观察到的，Zn2+去除会诱导Pht家族蛋白的从头合成的事实是支持Pht和Zn2+之间的紧密联系的另一个论据。该调节可能通过AdcR蛋白而发生，所述AdcR蛋白调节肺炎链球菌中的锌摄入。实际上，^kMphtA、phtB取phtE基因的上游和操纵子的上游发现了 AdcR蛋白的假定结合位点{ Panina 2003 }。在高Zn2+浓度条件下诱导的AdcR的结合会抑制依赖于它的基因的转录。在直接或间接的锌饥饿(由此导致该金属的细胞内浓度的降低)条件下，会缓解AdcR的抑制{ Brenot 2007,Claverys 2001 }。与此相反，且与我们在本发明的研究中已经观察到的结果相反，最近公开了在培养基中加入锌会引起Pht产生{ Ogunniyi 2009 }。但是，使用的2种方法在下述方面是不同的在本发明的工作中，从富含锌的培养基中去除锌，而Ogunniyi攀_乂将锌加入少锌的培养基中。合理地估计，在给定的锌浓度范围内，以钟形方式调节Pht生产。另外,Ogunniyi等人{ Ogunniyi 2009 }观察到的高锌浓度效应(导致增加的Pht表达)可能不具有体内关联性，因为在人宿主中可利用的游离锌浓度非常低。在1997年，Dintilhac等人{ Dintilhac 1997a }在他们的研究中得出结论除了 Psa (被描述为ABC-型Mn2+通透酶)和Adc (ABC-型Zn2+通透酶)以外，还应当存在能够运输Zn2+和Mn2+的第三种转运蛋白。Pht蛋白或层粘连蛋白结合蛋白看起来可作为实现该功能的候选物。我们的结果指示Pht的不同作用。实际上，野生型和PhtD-缺陷型菌株 能够在不含Zn2+和Mn2+的基本培养基中生长的事实是吸引人的。另外，当将Zn2+或Mn2+加入基本培养基中时会延迟地挽救四重突变体生长的观察结果也是吸引人的。如果我们认为Pht蛋白起Zn2+和Mn2+清除剂的作用，具有储存和浓缩那些二价阳离子的功能，可以解释这些观察结果。当将野生型和PhtD-缺陷型突变株放入基本培养基中时，由于当细菌处于更富集的培养基中时在Pht蛋白内预先储存的离子，它们能够立即开始生长。相比之下，当放入有利的条件中时，四重Pht-突变体不能储存那些离子，然后当放入贫瘠培养基中时，则不能生长。当将过量的Zn2+或Mn2+加入基本培养基中时，在所述离子被特异性的金属通透酶捕获之前，需要一些时间，因为在没有Pht蛋白帮助下，它们必须在培养基中随机地找到所述离子。这可能解释四重Pht突变体在这样的条件下开始生长所需的延迟。此外，Pht蛋白的可能的清扫作用与5-6个阳离子-结合域的存在相一致。这种推测的贮存机理如果得到证实，可以视作细菌调节锌和可能的锰体内稳态的方式。诸如锌和锰等金属离子是必需的痕量元素。但是，它们当过量时可能对细菌有害，因为它们可能与作为一些关键酶的辅因子的其它元素进行竞争。因此，它是细菌调节金属体内稳态所必需的，并且我们表明这是Pht家族的主要作用。当面临离子限制环境时，例如在人鼻咽中的定殖过程的初始阶段中，这样的调节系统会允许肺炎链球菌存活{ Bunker1984， Harlyk 1997 }。Lmb (LraI家族成员)和YfnA需要Zn2+或Mn2+以发挥它们的功能可能解释含有PhtD的多顺反子转录物的存在。为了部分地支持该命题，已经表明LraI家族蛋白的附着(毒力的一个关键特征)需要Mn2+ { Dintilhac 1997b, Papp-Wallace 2006 }。另外，在其它背景下已经证实，层粘连蛋白会结合Zn2+，以促进层粘连蛋白和层粘连蛋白结合蛋白之间的高亲和力结合{ Ancsin 1996, Bandyopadhyay 2002 }。因此,我们可以假定当Lmb遇到层粘连蛋白(这增强与宿主组织的结合)时，Lmb需要PhtD来确保Zn2+的存在。Pht对锌体内稳态的调节也可以解释为什么这些蛋白已经与C3b的抑制相关联(Hostetter, 1999 41/id; Ogunniyi, 2009 98 /id)。实际上，在有因子H存在下，因子I对C3b的裂解受锌调节{ Blom 2003 }。通过控制细菌环境中的锌浓度，Pht因而可能在有些情况下促进C3b抑制，这需要进一步研究。因此，通过靶向Pht蛋白家族，免疫系统可能阻碍细菌储存和使用离子的可能性，所述储存和使用对于侵入过程而言看起来是关键性的。因此，我们的结果证实Pht蛋白是针对肺炎球菌感染的真正疫苗候选物。已经评价了 Pht家族的不同成员用作肺炎球菌疫苗抗原的潜力{ Adamou 2001, Hamel 2004, Ogunniyi 2007, Zhang 2001 }。在它们的发现以后，检查了 PhtA、PhtB和PhtD保护小鼠免于肺炎球菌分离物亚组的能力{ Adamou 2001}。发现PhtD是会提供最宽保护的Pht蛋白，而PhtA免疫接种针对较少数目的受测菌株有效。这与本研究结果相一致，在所述研究中证实PhtA在62%的肺炎球菌菌株中表达，而PhtD存在于100%的肺炎球菌菌株中。尽管成功地用于2个研究中，尚不清楚PhtB的引起交叉保护的潜力，因为仅针对单一菌株评价了它{ Adamou 2001, Zhang 2001 }。但是，由于我们在81%的菌株中发现了它，可以预见到，它的菌株间覆盖度可能不是最佳的。关于PhtE，在97%的菌株中发现了该蛋白，这可能指示宽广的交叉保护。但是，该Pht与其它3种Pht仅具有32%同一性，且它的C-端部分(具有最高免疫原性的且保守的部分)是PhtE-特异性的。PhtE与其它Pht共有的区域是抗体不可接近的{ Adamou 2001，Hamel 2004 }。因 此，PhtD (其存在于所有受测菌株中，具有在肺炎球菌中高度保守的氨基酸序列，且也表现出与PhtA和PhtB的交叉反应性)代表一种更好的选择。实施例7
Ph t蛋白免疫接种会在小鼠肺炎球菌致命鼻内攻击模型中提供保护为了评价Pht家族成员在小鼠肺炎球菌鼻内攻击中提供的保护，在第O和14天，使用用AS02佐剂系统配制的Mg PhtD、PhtA、PhtB或PhtE，肌肉内地(i.m.)免疫OFl雌性小鼠(4周龄；n=20/组)，所述AS02佐剂系统由补充了 3-0-去酰基-4’-单磷酰基脂质A(MPL)和 QS21 的水包油乳剂组成(Garcon 等人 Expert Rev. Vaccines 6; 723-739(2007))。对照动物仅注射AS02。在第28天，用3/43型肺炎球菌菌株(IO5 cfu，50μ1)鼻内地攻击小鼠。记录攻击后10天的死亡率。在其它实验中，将IPg PhtD疫苗接种与IOPg PspA和l(^g CbpA进行对比。用佐剂系统AS04配制所有抗原，所述AS04由含有MPL的铝盐组成(Garcon等人Expert Rev.Vaccines 6; 723-739 (2007)。在第O、14和28天进行肌肉内免疫接种。对照动物仅接种佐剂。在第 42 天，用 50μ1 肺炎链球菌 4/CDC 型(5xl06 cfu)、2/D39 型(2xl05 cfu)或 3/43型(IO5 cfu)鼻内地攻击小鼠。记录攻击后10天的死亡率。使用时序检验(logrank test)(Mantel-Haenszel )，分析存活数据。结果指示使用任一种Pht蛋白的疫苗接种会实现大约60%的小鼠存活，而在对照组中仅20%的动物存活(图10)。在以后的实验中，给其它动物组接种3种不同的肺炎球菌抗原PspA、CbpA和Pht家族的一种蛋白即PhtD。评价体液应答的程度，并在最后一次免疫接种后2周，用3种不同的肺炎球菌菌株攻击动物。记录所有抗原/菌株组合的小鼠存活率。得到的抗体水平是抗原依赖性的(图11A)。与IOPg CbpA或PspA疫苗接种相比，Mg PhtD疫苗接种会引起更高的抗体滴度。尽管如此，3种抗原针对2/D39菌株(从它衍生出CbpA和PspA)的鼻内致命攻击的保护水平是类似的，具有约70%的存活率(图12A)。当使用其它菌株时，证实了所述抗原之间的差异。实际上，PhtD疫苗接种分别允许60%和80%的小鼠幸免于3/43和4/CDC菌株的攻击。相比之下，CbpA和PspA没有提供或提供非常微弱的针对3型和4型攻击的保护。PhtD因而是能够实现针对3种菌株的保护的唯一抗原。实施例8
Pht蛋白免疫接种保护小鼠免于肺炎链球菌鼻咽定殖
使用鼻咽定殖试验来评估针对PhtD的免疫接种预防中耳炎的能力。几项研究已经证实了鼻咽定殖和中耳炎之间的联系。Bogaert等人Lancet Infect. Dis. 4(3); 144-154
(2004)证实，在呼吸道感染和中耳炎期间，定殖率倾向于更高。实际上，在没有同源菌株的进行中的和/或并发的鼻咽定殖存在下，不会发生肺炎球菌疾病(Grey等人J. Infect.Dis. 142; 923-933 (1980), Syrjanea等人Paediatr. Infect. Dis. J. 24; 801-806
(2005))。
在第O、14和28天，通过鼻内途径用5Pg PhtD、PhtA、PhtB或PhtE (除了最后一次免疫接种以外，它们补充了 O. 2Pg大肠杆菌不稳定毒素(LT)作为佐剂)免疫Balb/c小鼠(4周龄；n=10/组)。使用相同方案(时间表和剂量)的另一个实验将PhtD与CbpA、PsaA和PspA进行了对比。对照小鼠仅注射LT。在第42天，使用7xl04 cfu的6B/⑶C型菌株、4/⑶C型或2/D39型鼻内地攻击小鼠。使用小细菌接种物体积(10μ1 )，进行攻击。在攻击后2和6天收集的鼻洗出液中，计数细菌菌落。通过用500μ1 PBS在麻醉的小鼠的鼻腔内冲洗，得到鼻洗出液。接着，为了计数细菌菌落，在Todd Hewitt培养基中稀释ΙΟΟμΙ鼻洗出液10倍。从其中取10μ1铺板在Difco 血琼脂基质上,所述基质补充了去纤维的(definibrated)无菌的绵羊血液和庆大霉素(3Pg/ml)。将培养皿(Peri dish)倾斜以铺开样品，在37°C温育过夜以后，计数菌落。在标准化以后，用ANOVA对比所有菌落计数数据，当发现ANOVA是显著的时，随后进行Dunnett后检验。为了评估疫苗接种对鼻咽管(naso-pharyngeal carriage)的保护活性,用不同的Pht蛋白鼻内地免疫Balb/c小鼠，然后用2/D39菌株通过相同的途径攻击它们。如图13所示，尽管仅用PhtD或PhtE的疫苗接种会提供针对2型菌株攻击的显著保护，但是Pht家族的所有成员能够减少接种疫苗的动物的鼻咽中的细菌载荷。由于PhtD在该模型中的更佳表现，选择Pht家族的该成员用于进一步实验，将PhtD与其它肺炎球菌蛋白进行对比。因此，用不同的肺炎球菌抗原(包括PhtD)免疫小鼠，随后用2型、4型或6B型菌株攻击。如在全身免疫接种以后观察到的，在鼻内免疫接种以后引起的体液应答是抗原依赖性的(图11B)。具体地，与PspA和PhtD相比，CbpA引起更低的抗体滴度。但是，由CbpA提供的针对进化枝-同源的2/D39菌株的保护水平与PspA和PhtD类似(图14A)。当使用4/⑶C型进行攻击时，仅PhtD免疫接种会保护动物免于鼻咽定殖，而CbpA、PsaA或PspA免疫接种不可在统计上与LT对照相区分(图14B)。最后,无论用CbpA、PspA还是用PhtD免疫动物，6B/CDC型攻击在攻击后第2天都没有显示任何保护差异(图14C)。仅PsaA看起来在这方面是更低效的。在攻击后第6天，在所有组之间没有统计差异。但是，对PhtD结果的仔细检查揭示大多数动物被保护免于鼻咽定殖，并且不利的统计结论可能仅仅是由于2个离群值的存在。综上所述，PhtD是能够在该鼻咽定殖模型中提供针对3种菌株的一定保护的唯一抗原。实施例9
Ph tD免疫接种保护小鼠免于肺炎链球菌肺定殖该模型从 Briles 等人 J. Infect. Dis. 188; 339-348 (2003)改进而来。在第 0、14和28天，使用用AS02佐剂化的3gg PhtD肌肉内地免疫CBA/J雌性小鼠(4周龄；30只/组)。在第42天，用2xl07 cfu/δθμ 肺炎链球菌19F/2737鼻内地攻击小鼠。对照小鼠仅注射佐剂。通过菌落计数，测量在攻击后3、4和5天收集的肺中的细菌载荷。在标准化以后，用ANOVA对比所有菌落计数数据，当发现ANOVA是显著的时，随后进行Dunnett后检验。用PhtD免疫CBA/J小鼠(易于肺炎球菌感染的品系)，然后用中等毒力的19F细菌菌株攻击它们。这样的方案允许诱导局部肺炎，没有全身性的脓毒症。攻击以后，在第3、4和5天评价在肺中的活细菌的数目。经证实，与安慰剂相比，PhtD疫苗接种会在极大程度上(超过95%)减少在肺中的细菌载荷(图15a)。当分析未定殖的小鼠的数目时，PhtD疫苗接种的效力是特别明显的，因为与对照组中的10%相比，最多80%的接种疫苗的小鼠在第5天保持没有细菌(图15b)。参考文献
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权利要求
1.一种治疗或预防肺炎链球菌感染的方法，其中所述肺炎链球菌感染发生在这样的环 >境中其中游离的Zn2+和/或Mn2+浓度低至足以上调至少一种PhtX蛋白在肺炎链球菌中的表达；所述方法包括下述步骤给人患者施用药学有效量的PhtX蛋白。
2.根据权利要求I所述的治疗方法，其中所述PhtX蛋白选自PhtA、PhtB,PhtD和PhtE0
3.根据权利要求I所述的方法，其中所述PhtX蛋白是PhtD。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述肺炎链球菌感染发生在血液中。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述游离的Zn2+在血液中的浓度小于10nM、lnM、IOOpM或ΙΟρΜ，这从血清测得。
6.根据权利要求4所述的方法，其中所述结合的和游离的Zn2+在血液中的浓度小于2或lmg/1或小于20 μ Μ,这从血清测得。
7.根据权利要求4所述的方法，其中所述游离的Mn2+在血液中的浓度小于10ηΜ、1ηΜ、IOOpM或ΙΟρΜ，这从血清测得。
8.根据权利要求4所述的方法，其中所述结合的和游离的Mn2+在血液中的浓度小于2或lmg/1或小于20 μ Μ,这从血清测得。
9.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述肺炎链球菌感染发生在肺中。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述游离的Zn2+在肺中的浓度小于300、200、100、50或10 μ g/kg，这从支气管灌洗液测得。
11.根据权利要求9所述的方法，其中所述游离的Mn2+在肺中的浓度小于300、200、100、50或10 μ g/kg，这从支气管灌洗液测得。
12.根据权利要求9所述的方法，其中所述Zn2+在肺组织中的浓度小于20、15、10、5、2 或 I μ g/g 或 300、200、150、100、50、20 或 10 μ M，这从肺组织测得。
13.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述肺炎链球菌感染发生在中耳中。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述Zn2+在中耳中的浓度小于300、200、150、100、50、20、10、5、2、1、0·5、0· 2 或 O. I μ Μ。
15.根据权利要求13所述的方法，其中所述Mn2+在中耳中的浓度小于300、200、150、100、50、20、10、5、2、1、0·5、0· 2 或 O. I μ Μ。
16.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述肺炎链球菌感染发生在脑膜中。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述Zn2+在脑脊液中的浓度小于I.5、1、0. 75、0.5、0. 25 或 O. I 4皿或小于100、75、50、25或10 μ g/L。
18.根据权利要求16或17所述的方法，其中所述Mn2+在脑脊液中的浓度小于2.5、2、1.5、I 或 O. 5 μ g/L 或小于 50、25、10 或 5nM。
19.任一项前述权利要求所述的方法，其中所述人患者具有降低的Zn2+和/或Mn2+水平，这通过支气管灌洗液和/或血清实验测得。
20.任一项前述权利要求所述的方法，其中所述人患者是Zn2+和/或Mn2+缺少的。
21.任一项前述权利要求所述的方法，其中所述人患者是处于应激中。
22.任一项前述权利要求所述的方法，其中所述人患者具有多种细菌感染。
23.任一项前述权利要求所述的方法，其中所述人患者具有慢性细菌感染。
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述慢性细菌感染是肺炎球菌感染。
25.任一项前述权利要求所述的方法，其中所述肺炎链球菌感染是败血病、菌血症、脑膜炎、中耳炎或肺炎。
26.一种用于治疗或预防肺炎链球菌感染的免疫原性组合物，其包含药学有效量的分离的PhtX蛋白，其中所述肺炎链球菌感染发生在处于下述环境的人患者中其中游离的Zn2+和/或Mn2+浓度低至足以上调至少一种PhtX蛋白在肺炎链球菌中的表达。
27.根据权利要求26所述的免疫原性组合物，其中所述PhtX蛋白选自PhtA、PhtB,PhtD 和 PhtE。
28.根据权利要求26所述的免疫原性组合物，其中所述PhtX蛋白是PhtD。
29.根据权利要求26-28中任一项所述的免疫原性组合物，其中所述肺炎链球菌感染发生在血液中。
30.根据权利要求29所述的免疫原性组合物，其中所述游离的Zn2+在血液中的浓度小于10nM、lnM、100pM或ΙΟρΜ，这从血清测得。
31.根据权利要求29所述的免疫原性组合物，其中所述结合的和游离的Zn2+在血液中的浓度小于2或lmg/1或小于20 μ Μ，这从血清测得。
32.根据权利要求29所述的免疫原性组合物，其中所述游离的Mn2+在血液中的浓度小于10ηΜ、1ηΜ、100ρΜ或ΙΟρΜ，这从血清测得。
33.根据权利要求29所述的免疫原性组合物，其中所述结合的和游离的Mn2+在血液中的浓度小于2或lmg/1或小于20 μ Μ，这从血清测得。
34.根据权利要求26-33中任一项所述的免疫原性组合物，其中所述肺炎链球菌感染发生在肺中。
35.根据权利要求34所述的免疫原性组合物，其中所述Zn2+在肺中的浓度小于300、200、100、50或10 μ g/kg，这从支气管灌洗液测得。
36.根据权利要求34所述的免疫原性组合物，其中所述Zn2+在肺组织中的浓度小于20、15、10、5、2 或 I μ g/g 或 300、200、150、100、50、20 或 10 μ M，这从肺组织测得。
37.根据权利要求34所述的免疫原性组合物，其中所述Mn2+在肺中的浓度小于300、200、100、50或10 μ g/kg，这从支气管灌洗液测得。
38.根据权利要求26-30中任一项所述的免疫原性组合物，其中所述肺炎链球菌感染发生在中耳中。
39.根据权利要求38所述的免疫原性组合物，其中所述Zn2+在中耳中的浓度小于300、200、150、100、50、20、10、5、2、1、0· 5、0· 2 或 O. I μ M。
40.根据权利要求38或39所述的免疫原性组合物，其中所述Mn2+在中耳中的浓度小于 300、200、150、100、50、20、10、5、2、1、0· 5、0·2 或 O.I μ Μ。
41.根据权利要求1-3中任一项所述的免疫原性组合物，其中所述肺炎链球菌感染发生在脑I吴中。
42.根据权利要求41所述的免疫原性组合物，其中所述Zn2+在脑脊液中的浓度小于I. 5、1、0· 75、0· 5、0· 25 或 O. I μ M 或小于 100、75、50、25 或 10 μ g/L。
43.根据权利要求41或42所述的免疫原性组合物，其中所述Mn2+在脑脊液中的浓度小于 2· 5、2、1· 5、1 或 O. 5 48/1或小于50、25、10或511]\1。
44.根据权利要求26-43中任一项所述的免疫原性组合物，其中所述人患者具有降低的Zn2+和/或Mn2+水平，这通过支气管灌洗液和/或血液测试测得。
45.根据权利要求26-44中任一项所述的免疫原性组合物，其中所述人患者是Zn2+和/或Mn2+缺少的。
46.根据权利要求26-45中任一项所述的免疫原性组合物，其中所述人患者是处于应激中。
47.根据权利要求26-46中任一项所述的免疫原性组合物，其中所述人患者具有多种细菌感染。
48.根据权利要求26-47中任一项所述的免疫原性组合物，其中所述人患者具有慢性细菌感染。
49.根据权利要求48所述的免疫原性组合物，其中所述慢性细菌感染是肺炎球菌感染。
50.根据权利要求26-49中任一项所述的免疫原性组合物，其中所述肺炎链球菌感染是败血病、菌血症、脑膜炎、中耳炎或肺炎。
51.药学有效量的分离的PhtX蛋白在制备药物中的用途，所述药物用于治疗或预防肺炎链球菌感染，其中所述肺炎链球菌感染发生在处于下述环境的人患者中其中Zn2+和/或Mn2+的浓度低至足以上调至少一种PhtX蛋白在肺炎链球菌中的表达。
52.根据权利要求51所述的用途，其中所述PhtX蛋白选自PhtA、PhtB、PhtD和PhtE。
53.根据权利要求51所述的用途，其中所述PhtX蛋白是PhtD。
54.根据权利要求51-53中任一项所述的用途，其中所述肺炎链球菌感染发生在血液中。
55.根据权利要求54所述的用途，其中所述游离的Zn2+在血液中的浓度小于ΙΟηΜ、InM、IOOpM或ΙΟρΜ，这从血清测得。
56.根据权利要求54所述的用途，其中所述结合的和游离的Zn2+在血液中的浓度小于2或lmg/1或小于20 μ Μ,这从血清测得。
57.根据权利要求54所述的用途，其中所述游离的Mn2+在血液中的浓度小于ΙΟηΜ、InM、IOOpM或ΙΟρΜ，这从血清测得。
58.根据权利要求54所述的用途，其中所述结合的和游离的Mn2+在血液中的浓度小于2或lmg/1或小于20、15、10、8、5或2 μ M，这从血清测得。
59.根据权利要求51-58中任一项所述的用途，其中所述肺炎链球菌感染发生在肺中。
60.根据权利要求59所述的用途，其中所述Zn2+在肺中的浓度小于300、200、100、50或10 μ g/kg,这从支气管灌洗液测得。
61.根据权利要求59所述的用途，其中所述Zn2+在肺组织中的浓度小于20、15、10、5、2 或 I μ g/g 或 300、200、150、100、50、20 或 10 μ M，这从肺组织测得。
62.根据权利要求59所述的用途，其中所述Mn2+在肺中的浓度小于300、200、100、50或10 μ g/kg,这从支气管灌洗液测得。
63.根据权利要求51-58中任一项所述的用途，其中所述肺炎链球菌感染发生在中耳中。
64.根据权利要求63所述的用途，其中所述Zn2+在中耳中的浓度小于300、200、150、100、50、20、10、5、2、1、0·5、0· 2 或 O. I μ M。
65.根据权利要求63所述的用途，其中所述Mn2+在中耳中的浓度小于300、200、150、100、50、20、10、5、2、1、0·5、0· 2 或 O. I μ Μ。
66.根据权利要求51-58中任一项所述的用途，其中所述肺炎链球菌感染发生在脑膜中。
67.根据权利要求66所述的用途，其中所述Zn2+在脑脊液中的浓度小于I.5、1、0. 75、0.5、0. 25 或 O. I 4皿或小于100、75、50、25或10 μ g/L。
68.根据权利要求66或67所述的用途，其中所述Mn2+在脑脊液中的浓度小于2.5、2、1.5、I 或 O. 5 μ g/L 或小于 50、25、10 或 5nM。
69.根据权利要求51-68中任一项所述的用途，其中所述人患者具有降低的Zn2+和/或Mn2+水平，这通过支气管灌洗液和/或血液测试测得。
70.根据权利要求51-69中任一项所述的用途，其中所述人患者是Zn2+和/或Mn2+缺少的。
71.根据权利要求51-70中任一项所述的用途，其中所述人患者是处于应激中。
72.根据权利要求51-71中任一项所述的用途，其中所述人患者具有多种细菌感染。
73.根据权利要求51-72中任一项所述的用途，其中所述人患者具有慢性细菌感染。
74.根据权利要求73所述的用途，其中所述慢性细菌感染是肺炎球菌感染。
75.根据权利要求51-74中任一项所述的用途，其中所述肺炎链球菌感染是败血病、菌血症、脑膜炎、中耳炎或肺炎。
全文摘要
本发明公开了一种治疗或预防肺炎链球菌感染的方法，其中所述肺炎链球菌感染发生在这样的环境中其中游离Zn2+和/或Mn2+的浓度低至足以上调至少一种PhtX蛋白(例如PhtD)在肺炎链球菌中的表达；所述方法包括下述步骤给人患者施用药学有效量的PhtX蛋白。
文档编号A61K39/09GK102869376SQ201180023320
公开日2013年1月9日 申请日期2011年3月8日 优先权日2010年3月9日
发明者P·德诺尔, P·V·赫曼德, S·拉贝, J·普尔曼, S·里奥克斯 申请人:葛兰素史密丝克莱恩生物有限公司