新型免疫佐剂化合物及其用途的制作方法

专利名称：新型免疫佐剂化合物及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及用作免疫佐剂的环β葡聚糖化合物和包含其的疫苗组合物。
背景技术：
在全球公共卫生中，安全和有效的疫苗的研发仍然是一个主要的目标。现今的大部分疫苗由两种主要成分组成:(i)治疗目标的靶抗原和(ii)针对所述抗原刺激和/或诱导免疫原性的免疫佐剂。已知免疫佐剂的性质变化很大，但特别包括矿物油、细菌提取物、活的和减毒的生物体和氢氧化铝金属的悬浮液。即使免疫佐剂提供了增强的免疫应答，它们的使用也可引起不良副作用，尤其与它们的给药途径有关。因此，经批准并在人类中有效的免疫佐剂的数量仍然相对有限。因此需要可用作免疫佐剂而不引发不良副作用(例如内毒素性副作用)的新型化合物。针对细菌感染的免疫应答依赖于先天和适应性免疫系统的联合作用。树突状细胞(DC)是最有效的专职抗原呈递细胞APC，其在免疫应答的引发和调节中起重要作用。DC是检测、捕获、和处理抗原(例如入侵细菌和病毒)的关键识别物，并具有从外周组织向二级淋巴器官迁移以引起原发T细胞应答的能力。暴露于微生物刺激之后，DC经历成熟过程，特征为MHC-肽复合物的形成增加、共刺激分子(CD86、CD40和CD80)的上调和细胞因子的生成。此外，DC成熟过程的其它特点为促进向区域淋巴结(CCR7)移动的趋化因子受体的诱导和活化T细胞的能力增加。DC通过高度保守受体模式-识别受体(PRR)识别微生物刺激,也称为病原体相关的分子模式(PAMP)。最有名和有特点的PRR类别为Toll样受体(TLR)和C型凝集素受体(CLR)。例如，脂蛋白和肽聚糖通过TLR2来识别、dsRNA通过TLR3来识别、LPS通过TLR4来识别、CpG通过TLR9来识别、鞭毛蛋白通过TLR5来识别、ssRNA通过TLR7/8来识别、CpG通过TLR9来识别、含甘露糖的分子通过DC-SIGN来识别以及线性β -葡聚糖通过Dectin-1来识别。当引发这些受体时，下游信号级联被激活，用于诱导炎症反应。TLR接合之后激活的信号通路可变化，取决于是否募集MyD88。TLR3和TLR4所独有的MyD88非依赖性通路导致干扰素调节因子3的表达，而MyD88依赖性信号通路(存在于除TLR3之外的全部TLR上)集中在MAPK和NF- K B诱导上以良好地发挥它们的生物学效应。渗透调节的周质葡聚糖(OPG)是革兰氏阴性细菌包膜周质空间的常规成分(22)。它们已经在全部的待测变形菌中发现。不同种类的OPG具有非常不同的结构，但它们共有几个共同的特点:(i)它们是由有限数量的单元(5-24个)构成的低聚糖；(ii)D-葡萄糖是唯一的构成糖；(iii)葡萄糖单元通过 β_糖苷键至少部分地连接；(iv)周质中葡聚糖的浓度响应环境渗透压的减少而增加。OPG似乎具有关键的生物学功能，因为OPG合成缺失的突变体呈现高度多效表型(例如趋化性、运动性、减少的外膜稳定性和胞外多糖的合成以及在低渗介质中的缺陷生长)(22)。此外，它们不能与真核宿主建立成功的致病或共生关系⑴。
布鲁氏菌(Brucella)是被视作哺乳动物(包括人类)的兼性细胞内病原体的α-变形菌。所造成的人畜共患病(称为普鲁氏菌病)的发病机理主要与专职和非专职的吞噬宿主细胞中布鲁氏菌生存和细胞内复制的能力有关。在布鲁氏菌属中环β葡聚糖(C^G)由聚合度为17-25的环骨架组成，其中全部的葡萄糖单元通过β-1，2键连接(布鲁氏菌Ci3G) (2)。已经描述了环葡聚糖的存在对于完全流产布鲁氏菌(B.abortus)毒性是必需的(I)。此外,Arel Iano-Reynoso等(3)测定了调节脂质微区组织的布鲁氏菌C β G对于防止溶酶体融合和允许布鲁氏菌到达其复制小生境是必须的。Ci3G大量表达，代表1-5%的细菌干重(ref)。因此，考虑到如果单个细菌的内容物释放在含布鲁氏菌的液泡(其体积为约10毫微微升)中，液泡中Ci3G的浓度将为mM范围。这意味着当数千个细菌由凋亡的细胞死亡释放时，外部介质中释放的C β G可被估算为在μ M范围内并且这可能在免疫系统上具有某些重要的结果。葡聚糖且特别是线性β葡聚糖作为宿主-病原体相互作用中涉及的重要PAMP的作用(4、5)已被广泛地描述。有趣的是，已经认可线性(1—3) β-葡聚糖的免疫调节性能，因为它们已经显示出 具有抗肿瘤(6)和针对细菌(7)、病毒(8)、真菌(9)、和原生动物感染的抗感染性能。然而，时至今日，未有报道环形β_葡聚糖作为免疫系统调节剂的性能。发明概述发明人现证明了布鲁氏菌环β葡聚糖(Ci3G)具有如本文实施例中所阐明的免疫佐剂活性。根据本发明还表明，这些新型佐剂化合物特别代表了一类新的树突状细胞活化分子。发明人首次证明了布鲁氏菌Ci3G是TLR4激动剂和小鼠和人DC的有效活化剂，因为其能够诱导树突状细胞成熟、促炎细胞因子分泌以及CD4和CD8T细胞的活化和增殖。因此，本发明所述新型环β葡聚糖化合物特别用作免疫佐剂，以诱导和/或增强
免疫应答。因此，本发明涉及一种包含至少一种环β葡聚糖化合物的免疫佐剂化合物。本发明也涉及一种包含如上所定义的免疫佐剂化合物、一种或多种抗原、以及任选的一种或多种药学可接受的赋形剂的疫苗组合物。本发明也涉及如上所定义的免疫佐剂化合物用作药剂(特别用于诱导和/或增强佐剂活性)。本发明也涉及根据本发明的免疫佐剂化合物在制备特别用于诱导和/或用于增强针对一种或多种抗原的免疫应答的疫苗组合物中的用途。本发明也涉及一种试剂盒，包含:-根据本发明的免疫佐剂化合物，-至少一种抗原；作为用于同时、分别或相继使用的联合制剂，从而诱导针对例如病原体的保护性免疫应答、或有效地保护受试者或动物免受感染。本发明进一步的目的涉及环β葡聚糖化合物用于诱导需要其的受试者中树突状细胞(DC)的成熟的治疗方法。本发明另一个进一步的目的涉及环β葡聚糖化合物用作免疫佐剂，其中所述化合物用于诱导需要其的受试者中树突状细胞(DC)的成熟。发明详述发明人已经研究了布鲁氏菌环β葡聚糖(Ci3G)和其它环葡聚糖在DC成熟，在细胞因子的产生、MHC-1I和共刺激分子的表面表达、基因表达、在人类和小鼠DC上的毒性和抗体应答方面的效果。他们已经证明了布鲁氏菌Ci3G是小鼠和人DC的有效活化剂。此夕卜，具有不同结构的环葡聚糖不诱导相同的活化反应，显示了具有不同结构的Ci3 G可具有不同的活化性能。发明人也已经证明了 Ci3G代表了一类新型TLR4激动剂。确实证明了所述环β葡聚糖具有TLR4-介导的佐剂性能，具有体内促炎效果，但在全身性注射之后不显示任何显著的全身性内毒素性副作用。本文实施例中所包含的结果显示了所述环β葡聚糖不显示显著的内在抗原作用，即目标分子防止或削弱了引发环β葡聚糖抗体显著地进入血清的效力。因此，发明人证明了 Ci3 G可代表下一类免疫佐剂。因此，本发明的第一方面涉及一种包含至少一种环β葡聚糖(Ci3G)化合物的免疫佐剂化合物。本发明也涉及一种用作免疫佐剂的环β葡聚糖化合物。如本文所用，术语“免疫佐剂”是指当施用于受试者或动物时可诱导和/或增强针对抗原的免疫应答的化合物。其也意指通常作为促进、延长、或增强针对特定抗原的特定免疫应答的质量的物质。在本发明的上下文中，术语“免疫佐剂”是指通过影响先天免疫应答的瞬态反应增强先天免疫应答和通过抗原呈递细胞(APC)特别是树突状细胞(DC)的活化和成熟增强适应性免疫应答的更长期效果的化合物。因此本发明进一步的目的涉及环β葡聚糖化合`物用于诱导需要其的受试者中树突状细胞(DC)的成熟的治疗方法。本发明的另一个进一步的目的涉及环β葡聚糖化合物用作免疫佐剂，其中所述化合物用于诱导需要其的受试者中树突状细胞(DC)的成熟。如本文所用，术语“抗原”是指如果通过MHC分子处理和呈递，能够通过抗体或通过T细胞受体(TCR)特异性结合的分子。如本文所用，术语“抗原”也包括T-细胞表位。抗原还能够通过免疫系统识别和/或能够诱导体液免疫应答和/或细胞免疫应答，导致B-和/或T-淋巴细胞的活化。抗原可具有一种或多种表位或抗原位点(B-和T-表位)。如本文所用，术语“环β葡聚糖化合物”或“Ci3 G化合物”是指具有包含17-25个仅通过β_(1，2)糖苷键连接的己糖残基的环状骨架的低分子量细胞表面碳水化合物。己糖残基可选自天然存在的己糖单元以及结合非天然存在的己糖、己糖类似物和模拟物的结构变异体。本领域技术人员知道或能够确定何种结构构成功能上相同的己糖类似物和己糖模拟物。优选地，天然存在的己糖单元可选自可形成环结构的己醛糖，如阿洛糖、阿卓糖、半乳糖、葡萄糖、古洛糖、艾杜糖、甘露糖和塔罗糖。优选地，天然存在的己糖单元为葡萄糖。在某些实施方案中，多种分子可通过使用位于己糖单元上的游离羟基共价连接、和/或通过显示接受分子的约IOA空隙的炸面圈样环的形状产生的电荷相互作用非共价连接至本发明的环β葡聚糖化合物(11)。这种分子可选自多肽、碳水化合物、核酸或脂质(如胆固醇)。在某些实施方案中，己糖残基可被至少一种天然取代基残基取代。术语“天然取代基残基”可指琥珀酰(Suc)残基(如流产布鲁氏菌Ci3 G和草木樨中华根瘤菌(Sinorhizobium melitoti) C β G中)、憐酸甘油残基(P-Gro)(如大肠杆菌C β G和草木禪中华根瘤菌Ci3G中)；磷酸乙醇胺(P-Etn)残基(如大肠杆菌Ci3G中)；胆碱磷酸残基(P-Cho)(如慢生型大豆根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum) C β G 中);乙酰(Ace)残基(如浑球红细菌(R.sphaeroides) C β G中);甲基丙二酰(MeMal)残基(如草木樨中华根瘤菌Ci3G中)。在优选的实施方案中，天然取代基残基为琥珀酰残基。这种取代天然发生于其它细菌种类如流产布鲁氏菌的环β葡聚糖中(O-琥珀酰残基)。可将其它取代引入不改变Ci3 G的免疫佐剂活性的位置。典型地，环β葡聚糖化合物上的取代基键优选由己糖羟基上O-酯键构成。在某些实施方案中，天然取代基残基的数目为0-25个。在优选的实施方案中，天然取代基残疾的数目为0-3个。通过测量细胞因子的产生(例如IL-12p和TNF- α的产生)和树突状细胞上表面标记(例如CD80、CD40和CD86)的表达来测试所述化合物是否诱导树突状细胞的成熟，本领域技术人员可容易地评估根据本发明的具有免疫佐剂性能的Ci3 G化合物。在第二步骤中，也可测试⑶8+Τ细胞增殖和活化的诱导。或者，也可测定TLR4的激动活性。典型地，可用于测试Ci3 G化合物的免疫佐剂活性的测试描述于实施例中。本发明的环β葡聚糖化合物可通过细菌，更优选布鲁氏菌的纯化、或通过用于化学或低聚糖合成的任何一种方法获得，其为本领域技术人员所熟知。例如，目标环β葡聚糖化合物可由培养基或细菌细胞溶菌液回收。典型地，本发明的CP G化合物分离自布鲁氏菌。例如，本发明的CP G化合物可分离自野生型布鲁氏菌细胞或分离自布鲁氏菌菌株例如羊种布鲁氏菌(Brucella melitensis) 16M(美国模式培养物保藏所23456;有毒菌株，生物型I)、流产布鲁氏菌2308 (12)。目标环β葡聚糖的产生中所使用的细菌可通过多种物理或化学手段裂解，例如冷冻-解冻循环、超声波降解、机械裂解、或细胞溶解剂。可能需要由细菌纯化目标环β葡聚糖。实施例中所描述的过程是示例性的用于由羊种布鲁氏菌或流产布鲁氏菌的上清液纯化Ci3 G的合适过程。以下过程是示例性的环β葡聚糖化合物的合适纯化过程:通过离子交换柱上的分馏；乙醇沉淀(如实施例中所用);反相HPLC ;二氧化硅或阳离子交换树脂例如DEAE上的色谱；色谱聚焦；SDS-PAGE ;硫酸铵沉淀；使用例如Sephadex G-75的凝胶过滤；蛋白质A琼脂糖柱以去除污染物；和金属螯合柱以结合目标环β葡聚糖的表位-标记形式。可使用低聚糖纯化的多种方法并且这类方法如三氯乙酸处理和凝胶渗透色谱为本领域已知并描述于例如(21)中。所选择的纯化步骤将取决于例如所使用的制备方法和所制备的特定环β葡聚糖化合物的性质。通过培养细菌(农杆菌或根瘤菌)、和由培养溶液收集标题化合物制备和产生环β葡聚糖化合物，特别是具有β_1，2键的环β葡聚糖化合物也描述于JP 61040799和JP61070994 中。在某些实施方案中，本发 明的环β葡聚糖化合物可通过化学合成的常规技术合成。例如，国际专利申请WO 0216384描述了用于在例如通过向固定在固相颗粒上的终端亚基添加亚基而形成的固体载体上有效合成低聚糖的低聚糖自动化合成的设备和方法。本发明的环β葡聚糖化合物也可通过使用昆布多糖酶16Α糖苷合成酶合成(23)。
本发明进一步的目的涉及一种疫苗组合物，包含根据本发明的作为免疫佐剂的C^G化合物和任选的一种或多种药学可接受的赋形剂。更特别地，本发明涉及一种疫苗组合物，包含如上所定义的免疫佐剂化合物以及一种或多种抗原。一旦将“疫苗组合物”施用于受试者或动物，其引发针对本文所包含的所述一种或多种抗原的保护性免疫应答。因此，一旦将本发明的疫苗组合物施用于受试者或动物，其诱导针对例如微生物的保护性免疫应答、或有效地保护受试者或动物免受感染。多种物质可用作免疫原或疫苗型化合物或制剂中的抗原。例如，衰减和灭活的病毒及细菌病原体、纯化的大分子、聚糖、类毒素、重组抗原、含有来自病原体的外源基因的有机体、合成肽、聚核酸、抗体和肿瘤细胞可用于制备(i)用于在个体中诱导免疫应答的免疫原组合物或(ii)用于治疗病理状态的疫苗。因此，本发明的环β葡聚糖化合物可与多种抗原结合以制备用于在个体中诱导免疫应答的疫苗组合物。本领域技术人员将能够选择适于治疗特定病理状态的抗原并将知道如何确定分离的抗原是否在具体疫苗制剂中有利。本领域技术人员也将能够确定是否将本发明的免疫佐剂共价连接、或非共价连接至所述一种或多种抗原是优选的。因此，在本发明的进一步方面中，本发明涉及根据本发明的连接至至少一种抗原的环β葡聚糖化合物。可使用本领域所熟知的多种方法制备分离的抗原。可使用本领域所熟知并描述于例如 Sambrook 等，Molecular cloning:A 实验室 Manual, Cold Spring Harbor 实验室，NewYork(1992)和 Ansubel 等，Current 治疗方案 s in Molecular Biology, John Wiley andSons, Baltimore, MD(1998)中的重组方法在例如细菌、酵母、昆虫、爬虫类或哺乳动物细胞中分离和克隆编码任何免疫 原多肽的基因。已经成功克隆并表达了许多由病毒、细菌和原生动物病原体编码表面抗原的基因，并在疫苗开发中作为抗原使用。例如，乙肝病毒的主要表面抗原(HbsAg)、霍乱毒素的P亚基、大肠杆菌的肠毒素、疟疾寄生虫的环子孢子蛋白质、和来自Epstein-Barr病毒的糖蛋白膜抗原、以及肿瘤细胞抗原已经在多种熟知的载体/宿主体系中表达、纯化并用于疫苗。也可用于根据本发明的疫苗组合物中的病理异常细胞可由任何来源获得，例如一个或多个具有病理状态的个体或获自一个或多个这种个体的体外或离体培养细胞，所述个体包括待用所得疫苗治疗的特定个体。在特定实施方案中，疫苗组合物的抗原可为“肿瘤相关抗原”。如本文所用，术语“肿瘤相关抗原”是指特征是肿瘤组织的抗原。通过肿瘤组织表达的肿瘤相关抗原的实例可为抗原前列腺酸性磷酸酶(参见WO 2004026238)或MART肽T (黑素瘤抗原)。根据本发明的疫苗组合物可含有至少一种其它免疫佐剂。多种免疫佐剂可适于改变个体的免疫应答。所需的改变类型将确定选择以与本发明所述环β葡聚糖化合物结合的免疫佐剂的类型。例如，为了增强先天免疫应答，本发明的疫苗组合物可包含另一种促进先天免疫应答的免疫佐剂，例如已知或疑似诱导先天免疫应答的其它PAMP或保守区。已知多种PAMP刺激Toll样受体家族不同成员的活性。可结合这种PAMP以刺激诱导有益细胞因子特征的Toll样受体的特定结合。例如，可结合PAMP以刺激诱导Thl或Th2免疫应答的细胞因子特征。促进体液或细胞-介导免疫应答的其它类型免疫佐剂可与本发明的环β葡聚糖化合物结合。例如，可施用细胞因子以改变Thl和Th2免疫应答的平衡。本领域技术人员将知道如何确定用于在对于特定病理状态的免疫应答中获得有益改变的合适的细胞因子。在另一个特定实施方案中，根据本发明疫苗组合物进一步包含一种或多种选自表面活性剂、吸收促进剂、吸水聚合物、抑制酶降解的物质、醇、有机溶剂、油、PH控制剂、防腐剂、渗透压控制剂、推进剂、水和其混合物的成分。根据本发明的疫苗组合物可进一步包含药学可接受的载体。载体的量将取决于其它成分所选择的量、所需抗原浓度、给药途径的选择(口服或肠胃外)等。载体可在任何便利的时间加入到疫苗中。在冻干疫苗的情况下，载体可例如就在给药之前加入。或者，可用载体制备最终产品。合适载体的实例包括，但不限于，无菌水、盐水、缓冲液、磷酸盐缓冲盐水、缓冲氯化钠、植物油、最低基础培养基(MEM)、含有HEPES缓冲液的MEM等。任选地，本发明的疫苗组合物可含有取决于该佐剂和所需的结果的变化量的常规二级佐剂。通常的量为约0.02重量约20重量％，取决于其它成分和所需的效果。为了本发明的目的，本文将这些佐剂确定为“二级”仅仅为了与上述免疫佐剂化合物(其是疫苗组合物为其效果与抗原物质相结合以显著增加针对抗原物质的体液免疫应答的必要成分)相对比。该二级佐剂作为加工助剂主要包括于疫苗制剂中，虽然某些佐剂确实在一定程度上具有免疫增强性能并具有双重目的。合适的二级佐剂的实例包括，但不限于，稳定剂；乳化剂；氢氧化铝；磷酸铝；pH调节剂例如氢氧化钠、盐酸等；表面活性剂例如Tween.RTM.80 (聚山梨醇酯80，商购于Sigma Chemical C0.，St.Louis, M0.);脂质体；免疫刺激复合物佐剂；合成糖肽例如胞壁酰二肽；添加剂例如右旋糖苷或右旋糖苷组合，例如，与磷酸铝的组合；羧基聚亚甲基；细菌细胞壁例如分支杆菌细胞 壁提取物；它们的衍生物例如短小棒状杆菌(Corynebacteriumparvum);座疮丙酸杆菌(Propionibacterium acne);牛分支杆菌(Mycobacteriumbovis)，例如，牛卡介苗(BCG);牛痘或动物痘病毒蛋白质；亚病毒颗粒佐剂例如环状病毒；霍乱毒素；N，N- 二十八烷基-N'，N'-双(2-羟乙基)_丙二胺(吡啶)；单磷酰基脂质A ; 二甲基二十八烷基溴化铵(DDA，商购于Kodak，Roch酯，N.Y.);合成材料和其混合物。理想地，氢氧化招与其它二级佐剂或免疫佐剂例如Quil A混合。合适的稳定剂的实例包括，但不限于，蔗糖、凝胶、蛋白胨、消化的蛋白质提取物例如NZ-胺或NZ-胺AS。乳化剂的实例包括，但不限于，矿物油、植物油、花生油和其它用于可注射或鼻内疫苗组合物的标准的、可代谢的、无毒油。可以约0.0001重量％ -约0.1重量％的有效量将常规防腐剂加入到疫苗组合物中。取决于制剂中所用的防腐剂，可使用低于或高于该范围的量。典型的防腐剂包括，例如，山梨酸钾、偏亚硫酸氢钠、苯酚、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、噻汞撒等。本发明的疫苗组合物可与药学可接受的介质一起配制成溶液或悬浮液。这种药学可接受的介质可为，例如，水、磷酸盐缓冲盐水、生理盐水或其它生理学缓冲盐水、或其它溶剂或载体例如乙二醇、甘油、和油例如橄榄油或可注射有机酯。药学可接受的介质也可含有脂质体或胶束，并可含有通过将多肽或肽抗原与洗涤剂和糖苷(例如Quil A)混合而制备的免疫刺激复合物。
用于本发明疫苗组合物的口服给药的液体剂型包括药学可接受的乳剂、微乳剂、溶液、悬浮液、糖浆和酏剂。除了活性成分，该液体剂型可含有本领域常用的惰性稀释液，例如，水或其它溶剂、增溶剂和乳化剂，例如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苯甲酯、丙二醇、1，3-丁二醇、油(特别地，棉籽油、花生油、玉米油、胚芽油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油)、甘油、四氢糠醇、聚乙二醇和山梨聚糖的脂肪酸酯、和其混合物。除了惰性稀释液，口服组合物也可包括助剂例如润湿剂、乳化剂和悬浮剂、甜味剂、调味剂、着色剂、芳香剂和防腐剂。除了活性成分，悬浮液可含有悬浮剂，例如，乙氧基化的异硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇和山梨聚糖酯、微晶纤维素、氢氧化铝氧化物、斑脱土、琼脂和黄芪胶、和其混合物。用于直肠或阴道给药的本发明疫苗组合物制剂可作为栓剂存在，其可通过将活性成分与一种或多种合适的非刺激性赋形剂或载体(包括，例如，可可油、聚乙二醇、栓剂蜡或水杨酸盐)混合而制备，且其在室温下为固体，但在体温下为液体，因此将熔融于直肠或阴道腔并释放活性成分。合适于阴道给药的本发明制剂也包括含有本领域已知合适的这种载体的阴道栓剂、棉球、霜剂、凝胶、糊剂、泡沫剂或喷雾制剂。合适于肠胃外给药的本发明疫苗组合物包含活性成分以及一种或多种药学可接受的无菌等渗水性或非水性溶液、分散体、悬浮液或乳剂、或可就在使用之前重组成无菌可注射溶液或分散体中的无菌粉末，其可含有抗氧化剂、缓冲剂、致使该制剂与预期接受者的血液等渗的溶质或悬浮剂或增稠剂。可用于本发明疫苗组合物的合适的水性和非水性载体的实例包括水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)、和其合适的混合物、植物油(例如橄榄油)、和可注射有机酯(例如油酸乙酯)。例如，通过使用包衣材料(例如卵磷脂)、在分散体的情况下通过维持所需的粒径、和通过使用表面活性剂，`可维持适当的流动性。这些组合物也可含有助剂，例如润湿剂、乳化剂和分散剂。在组合物中包括等渗齐U，例如糖类、氯化钠等也是有利的。另外，可通过延迟吸收的试剂例如单硬脂酸铝和凝胶产生可注射药物形式的延长吸收。可注射贮库形式通过在生物可降解聚合物例如聚交酯-聚乙醇酸交酯中形成活性成分的微胶囊基质来制备。取决于活性成分对聚合物的比例、和所用特定聚合物的性质，可控制活性成分的释放速率。其它生物可降解聚合物的实例包括聚(原酸酯)和聚(酐)。通过将活性成分捕获入可与机体组织相容得脂质体或微乳剂中也制备了贮库可注射药剂。可注射材料可例如过滤通过细菌-截留过滤器来灭菌。制剂可以单位-剂量或多-剂量密封容器存在，例如，安瓿和小瓶，并可储存于冻干条件中，仅需要就在使用之前加入无菌液体载体(例如，注射用水)。临时注射溶液和悬浮液可由上述类型的无菌粉末、颗粒和片剂制备。考虑到如特定抗原、年龄、性别、重量、物种、和特定动物或患者的病况、和给药途径这些因素，通过药学领域技术人员所熟知的技术测定根据本发明的疫苗组合物中抗原和免疫佐剂化合物的量。虽然疫苗组合物的剂量显著地取决于抗原、接种疫苗或待接种疫苗的宿主的物种等，疫苗组合物的药理学有效量的剂量将通常为约0.01 μ g-约500 μ g(并特别地为50 μ g-约500 μ g)的本发明免疫佐剂化合物每剂量。
虽然在组合中特定抗原物质的量将影响根据本发明的免疫佐剂化合物用以改善免疫应答所必需的量，预期从业者能够容易地通过途径测试调节免疫佐剂化合物的有效剂量以满足特定环境。在本领域所熟知的多种临床前毒理学和安全性研究中测试根据本发明的疫苗组合物。例如，这种疫苗组合物可在动物模型中评估，其中已发现抗原为免疫原性并可通过为人类临床测试提出的相同途径可再生地免疫。例如，根据本发明的疫苗组合物可例如通过由生物制品评价和研究中心(theCenter for Biologies Evaluation and Research) / 食品和药品管理局(Food and DrugAdministration)和国家过敏和传染病研究所(National Institute of Allergy andInfectious Diseases)提出的方法测试(13)。对于特定疫苗组合物，本领域技术人员将知道如何确定适当抗原的有效载荷、免疫途径、剂量体积、抗原纯度、和治疗特定动物物种的特定病理状态的接种方案。在接种疫苗的方案中，依照最初/扩大模式，疫苗可有利地作为单剂量或优选的几次(例如，以周或月时间间隔两次、三次或四次)给药。合适剂量取决于多种参数。作为一般规则，本发明的疫苗组合物为便利地口服、肠胃外(皮下、肌肉内、静脉内、皮内或腹膜内)、口腔内、鼻内、 或经皮、淋巴管内、瘤内、膀胱内、腹膜内和大脑内给药。通过本发明预期的给药途径取决于抗原。本发明涉及一种包含如上所定义的免疫佐剂化合物(即根据本发明的Ci3G化合物)和至少一种抗原的试剂盒。更特别地，本发明涉及一种试剂盒，包含:-如上所定义的免疫佐剂化合物，-至少一种如上所定义的抗原；作为联合制剂用于同时、分别或相继使用以诱导针对例如病原体的保护性免疫应答、或有效地保护受试者或动物免受感染。CP G化合物可在施用至少一种抗原之前、同时、或之后向受试者施用以诱导针对例如病原体的保护性免疫应答、或有效地保护受试者或动物免受感染。将C β G化合物和抗原顺序并在时间间隔内施用于受试者以使Ci3 G化合物可与抗原一起作用以提供与如果将它们以其他方式给药相比，针对所述抗原增强的免疫应答。优选地，Ci3G化合物和抗原同时施用于受试者。也优选地，将分子同时并每天施用于所述患者。本发明的进一步方面涉及一种接种需要其的受试者的方法，包括施用药理学有效量的抗原和药理学有效量的根据本发明的免疫佐剂化合物。如本文所用，术语“受试者”表示哺乳动物，例如啮齿动物、猫科动物、犬科动物、和灵长类动物。优选地，根据本发明的受试者为人。药理学有效量的根据本发明的免疫佐剂化合物可例如，口服、肠胃外或其它方式，与施用抗原同时、继施用抗原之后或施用抗原之后立即给予以加强、促进或扩大抗原的免疫原性。疫苗组合物的剂量将显著地取决于所选的抗原、给药途径、物种和其它标准因素。预期本领域技术人员可容易地和方便地滴定测量每种抗原对于免疫原应答的合适剂量以实现给药的有效免疫量和方法。 本发明也涉及一种TLR4激动剂，其由根据本发明的C β G化合物组成。如本文所用，TLR4激动剂是指能够充分地诱导、促进或增强TLR4生物学活性或TLR4受体活化或信号化的试剂。本发明的进一步目标涉及一种用于诱导需要其的受试者中树突状细胞(DC)的成熟的方法，包括施用药理学有效量的根据本发明的免疫佐剂化合物。本发明将通过以下附图和实施例来进一步阐明。然而，这些实施例和附图不应以任何方式解释为对本发明范围的限制。


图1.mDC成熟的诱导取决于环葡聚糖的结构。用介质(neg)、相等浓度0.25mM的大肠杆菌LPS或羊种布鲁氏菌C β G、流产布鲁氏菌C β G、青枯菌(Ralstonia) C β G和M β⑶刺激小鼠DC 8h和24h。通过流式细胞计测量MHC-11、⑶80、⑶40和⑶86的表面水平，和通过ELISA (B)测定培养上清液中TNF-α水平。数据代表至少三次独立实验。*与阴性相比，P < 0.05。图2Β.羊种布鲁氏菌C β G人DC增强⑶4+和⑶8+Τ细胞应答。Α)用介质(neg)、10ng/ml的大肠杆菌LPS和0.2 μ Μ、2 μ M和20 μ M的羊种布鲁氏菌C β G刺激源自人单核细胞的DC 24h并通过FACS分析HLA-DR、HLA-ABC, CD80、CD40、CD83和CD86表面水平。B)用20mg/ml CP G刺激血液mDC 24h。通过Luminex测量培养上清液中的细胞因子。图3通过羊种布鲁氏菌CP G诱导的IL-12产生和⑶80、⑶40和⑶86表面表达取决于TLR4。用介质(neg)、CpG、Poly1:C、Pam2CSK4和羊种布鲁氏菌CPG刺激来自WT(A，B和 C)、MyD88K0 (A)、TRIFKO (A)、TLR2K0 (B)和 TLR4K0 (B 和 C)小鼠的 DC 24h。A 和 B)通过ELISA测定培养上清液中IL-12浓度。C)通过流式细胞计测量⑶80、⑶40和⑶86的表面水平。作为阳性对照:Pam2CSK4(100ng/ml)、LPS (100ng/ml)、CpG(I μ Μ)和 Poly1:C(lmg/ml)。数据代表三次独立实验。*与WT小鼠相比，P < 0.05。图4B.流产布鲁氏菌CP G对抗三色矛头蝮的毒液的佐剂活性。A:相对于单独注射入藻酸钙混合物中的毒液，混合物毒液+藻酸钙+Ci3 G中的(**)显示P <0.001的值。B.免疫后21天，CP G对抗三色矛头蝮的毒液的佐剂活性。10只小鼠每组的血清池(共30只小鼠)。SD小于5%。实施例1:细菌β 1，2环葡聚糖为新型树突状细胞活化剂材料和方法:杭体和试剂。针对⑶8、⑶45.2、⑶44、⑶25、和⑶62L的荧光色素-共轭抗体购自BDBiosciences 或 eBiosciences。

卵清蛋白(OVA)购自EndoGrade，纯度> 98%和内毒素浓度< lEU/mg。羧基二乙酸荧光素琥珀酰亚胺酯(CFSE)订购自Invitrogen。
使用用于405η刺激的Aqua Dead Cell Stain (Invitrogen)来检测用于流式细胞计实验的死亡细胞。SI INFEKL 肽购自 Schafer-N。环葡聚糖提取、纯化和表征环葡聚糖分子获自羊种布鲁氏菌16M(美国典型培养物保藏中心23456 ;有毒菌株，生物型I)、流产布鲁氏菌2308 (12)和爺科雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum,来自爺科雷尔氏菌的纯化CPG赠予自Dr.JPBohin，CNRS UMR8576，里尔，法国)。在布鲁氏菌菌株的情况下，在生物安全水平3级的房间中，在36°C和35% 02饱和度下，使菌株生长于发酵罐中(14)并用苯酚灭活(0.5%，36°C下灭活48h)。将细菌重悬于蒸馏水中(IOOml中20g湿重)并于120°C下加热30分钟。去除细胞碎片(4°C下，30分钟，8，OOOg)并于_20°C下用三倍体积的乙醇沉淀提取物过夜。去除沉淀(10分钟，5，OOOg)并用两倍体积的乙醇混合上清液。收集该新沉淀(10分钟，5，OOOg)，将其悬浮于175mM NaCU0.05% NaN3和0.1MTris-HCl, pH 7.0 中，首先用核酸酶(50mg DNase-1I 型 V 和 RNase-A(Sigma-Aldrich)每ml)于37°C下消化18h，然后用蛋白酶K(50mg/ml ；Merck)于55°C下消化lh，随后于25°C下消化24h。于70°C下用一倍体积的苯酚提取液体30分钟，然后使混合物冷冻和离心((TC下，15分钟，8，OOOg)，收集水相并用苯酚使用相同条件再次提取。将水相透析、通过短暂离心澄清并冻干。环葡聚糖的特征通过如Aragon和同事所描述的13C-核磁共振谱、高效液相色谱和高效薄层色谱(TLC)来证实。不存在聚糖和脂多糖或其它污染物通过紫外分光光谱、SDS-PAGE、凝胶免疫沉淀反应和3-脱氧-D-甘露-2-辛酮糖酸测定来证明(14)。小鼠和细朐将HEK 293细胞维持在补充有10% FCS的DMEM中。将野生型C57BL/6 小鼠和 TLR2-/-、TLR4-/-、MyD88_/-、TRIF-/-基因敲除(KO)小鼠供养于Centre d’Immun ologie Marseille-Luminy (CIML)(马赛，法国)处。通过CaetanoReis y Souza实验室(伦敦，英国)提供双重(MyD88/TRIF-/_)KO细胞。如先前所述，由7-8 周大雌性 C57BL/6 小鼠或 TLR2-/-、TLR4-/-、MyD88-/-、TRIF-/-基因敲除(KO)小鼠制备源自小鼠骨髓的DC(15)。简言之，去除小鼠的大腿骨和胫骨并去除肌肉和腱。将骨置于70%乙醇中2分钟并随后在PBS中洗涤。切断骨两端，用RPMI 1640介质冲洗出骨髓。用补充有小鼠GM-CSF(mGM-CSF)的完全RPMI 1640(5% FCS和50 μ M β -巯基乙醇)将细胞接种于24孔板中。在第3天，改变介质和在第6天进行实验。以与源自骨髓的DC相同的方式由7-8周大雌性C57BL/6小鼠的大腿骨制备源自小鼠骨髓的巨噬细胞。将细胞接种于补充有M-CSF的完全DMEM(2Mm L-谷氨酰胺，10% FCS)中。在第5和第6天改变介质和在第7天进行实验。由来自健康志愿者的Ficoll-分离的外周血液单核细胞(PBMC)产生源自人单核细胞的DC (16)。通过粘附富集单核细胞并将其培养于完全RPMI介质(补充有粒细胞-单核细胞菌落-刺激因子(GM-CSF)和IL-4中6天时间，或GM-CSF和IFN中3天时间。使用FACS aria (BD Biosciences, CA)由 PBMC 分选血髓 DC(mDC:HLA-DR+CDllc+CD123_Lin-)。通过 FACS-分选纯化Na'ive ⑶4+ 和 CD8+T 细胞(CD45RA+CD45R0-)(纯度> 99.2% )。将来自Jackson实验室的C57Bl/6Ly5.1小鼠和饲养于CML动物设备中的C57B1/6后台上的OT-1 TCR转基因Ly5.2小鼠用于实验。免疫荧光显微术和流式细胞计对于免疫荧光显微术，于37°C下，将经刺激DC在3%多聚甲醛中固定15分钟并如先前所述对其进行免疫荧光标记处理(17)。将针对鼠科动物I_A(18)的兔rivoli抗体和小鼠抗体FK2 (Biomol)用作主要抗体。染色后，在Leica DMRBE落射荧光显微镜或Zeiss LSM 510激光扫描共焦显微镜上测试样品用于图像采集。然后使用Adobe Photoshop 7.0汇编102431024像素的图像。始终通过在4个独立实验中计数至少100个细胞，总计为至少400个分析的宿主细胞来完成量化。对于流式细胞计，收集经刺激DC并染色。由Pharmingen获得针对⑶80和⑶40的FITC-共轭抗体、针对⑶83和IA-1E (MHC II类)的PE-共轭抗体和针对⑶Ilc的APC-共轭抗体。使用合适的同型抗体作为对照。染色后，在FACScalibur血细胞计数器(BectonDickinson)上分析之前，用PBS洗涤细胞并将其固定于3%的多聚甲醛中。细胞始终门控于CDllc上用以分析并由每个样品收集10，000个门控事件。使用Flowjo软件分析数据。绘得柱状图并在门控群体上测定荧光强度中位数值。继CFSE-标记的T细胞增殖和活化之后，免疫后3天收集引流淋巴结(DLN)并使其经受胶原酶I型消化。将细胞染色用以使用不同突光色素-共轭抗体通过流式细胞计分析。在FACSCanto II (BDBiosciences)上收集至少100.000个事件。使用FlowJo软件进行流式细胞计分析。细胞因子浓度的测暈依照厂商说明(Abcys)，通过夹心酶联免疫吸附法(ELISA)在经刺激DC的培养上清液中量化总小鼠IL-12和TNF-α。按照厂商方案，人细胞因子和趋化因子(包括IL_lb、TNFaJP IL_12p40)使用 BeadLyte 细胞因子试验试剂盒(Upstate, MA)。人CD4+和CD8+T细朐应答将5x103血液mDC与CFSE-标记的异源nai’ve⑶4+T细胞(1-2x105)共同培养。在第6天，通过测量CFSE-稀释液测试细胞增殖。⑶8+T细胞在IL-2 (20单位s/ml)的存在下培养8-10天。37°C下，用 0.2m.0.1.(感染的多样性)热灭活的流感病毒(PR8)装载来自HLA-A0201+健康捐赠者的5x103血液mDC 2h。混合自体同源CD8+T细胞(1-2x105)并在20单位s/ml IL-2的存在下培养7天。然后用抗CD8抗体和四聚物(HLA-A*0201-Flu M158-66)染色细胞。与装载有IOmM MART-126-35(27L)肽的mDC共同培养之后，测量MART-1-特异性⑶8+T细胞应答。OT-1 T细朐的讨继转移和免疮。使用来自0VA、对H_2Db受限⑶8+T细胞表位特异性表达TCR的OT-1转基因细胞。收获淋巴结OT-1 Ly5.2小鼠并于37°C下用胶原酶I型(Sigma)消化30分钟。然后，通过使用小鼠CD8阴性分离试剂盒(Dynal)对CD8+T细胞进行阴性分选。常规地，所得细胞为>90%。通过流式细胞计测定⑶8百分数。37°C下，用10μΜ CFSE标记⑶8+T细胞10分钟。将⑶8+Ly5.2CFSE+T细胞静脉内(1.V.)过继转移入未经试验的同类C57Bl/6Ly5.1受体小鼠(200000个细胞/小鼠)。OT-1过继转移后24小时，用单独于内毒素中的30 μ g OVA (不含PBS)或混有200 μ g环葡聚糖的30 μ g OVA或混有50 μ g poly I/C的30 μ g OVA或用IFA乳化的30 μ g OVA将受体小鼠皮下(s.c.)免疫(体积/体积)。T细朐增葙和活化。始终将活细胞门控于⑶8+⑶45.2+群体上，且发明人分析与细胞分裂相关的CFSE标记的减少。为了研究细胞活化水平，发明人观察活化标记物例如CD25、D44和CD62L的表
达。 HEK 293细胞荧光素酶报告试验如先前所述，使用指示质粒进行HEK 293细胞报告试验。通过来自由源自骨髓的巨噬细胞制备的全部RNA的逆转录酶PCR并于P⑶NA3.1表达载体(Promega)中亚克隆来扩增小鼠TLRs、MD2和CD14 cDNA。依照厂商说明，使用Fugene(Roche)瞬时转染HEK 293细胞，用于总计0.4μ g的DNA(由50ng的受体质粒、200ng的pBIIXLuc报告质粒、5ng的对照海肾萤光素酶(pRL-nulI,Promega)组成)。转染24h之后，用所述激动剂刺激细胞6h并随后溶解细胞和使用Dual-Glo荧光素酶试验系统(Promega)测量荧光素酶活性。结果:布鲁氏菌Cg G是小鼠DC成熟的调节剂小鼠DC成熟的特征在于其中许多形态功能改变、细胞表面共刺激和MHC II类分子的上调、形态改变和大的细胞溶质的树突状细胞聚集体样诱导结构(称为DALIS，其由有缺陷的新合成的泛素化蛋白质制得)的形成。为了初始确定羊种布鲁氏菌Ci3 G是否是小鼠DC成熟的活化剂，用不同浓度的羊种布鲁氏菌Cg G培养细胞。8和24h之后，通过共聚焦显微镜分析表面表达MHC II类分子和DALIS的形成。作为DC活化的对照，使用0.25mM的大肠杆菌LPS。用羊种布鲁氏菌Ci3 G或大肠杆菌LPS处理小鼠DC，但不使布鲁氏菌LPS经历成熟，因为它们显示MHC II表面定位和DALIS形成。然而，在未处理的DC和用布鲁氏菌LPS处理的DC中，MHC II分子大部分保持在细胞内且未观察到DALIS。用各自的刺激培养8h和24h之后含DALIS的DC的百分数。在大肠杆菌LPS的情况下，8小时后，80%的细胞含有大的和众多DALIS，而仅20 %的未处理细胞含有DALIS。0.025 μ M的羊种布鲁氏菌C β G已经在45 %的细胞中诱导DALIS的形成并且在0.25 μ M和2.5 μ M时，细胞的数目分别增加至79%和72%，达到用0.25 μ M大肠杆菌LPS所获得的水平。24h时，DALIS的数目开始降低，这与之前观察到的相一致，因为DC成熟过程中DALIS表达为瞬现事件。为了获得对DC成熟过程中羊种布鲁氏菌Ci3 G作用的进一步洞察，发明人接着在⑶Ilc-阳性小鼠DC中通过流式细胞计分析了传统成熟标记物(⑶80、⑶86、⑶40和MHC II类分子)的表面表达。荧光中位数的分析显示通过羊种布鲁氏菌Ci3G的全部共刺激和MHCII类分子的清晰的剂量依赖性诱导。这与显微镜观察(大部分的MHC II类分子存在于细胞表面上)相一致。这些观察表明羊种布鲁氏菌C β G促进DC成熟。然后，发明人研究了羊种布鲁氏菌Ci3 G刺激后细胞因子通过小鼠DC的分泌是否也被诱导。测定刺激小鼠DC的上清液中IL-12和TNF-α的水平。结果显示羊种布鲁氏菌Cβ G以剂量依赖性方式诱导细胞因子的分泌。刺激后8h以及24h观察到该作用在两个时间点之间无显著差异。总之，这些数据证实了羊种布鲁氏菌Ci3 G为小鼠DC的有效活化分子。通过不同环葡聚糖结构调节小鼠DC成熟然后，通过用来自不同来源的多种CP G培养DC，发明人研究了环葡聚糖结构和DC活化之间的可能关系。羊种布鲁氏菌Ci3 G由含有17-25个通过β-1，2键连接的葡萄糖残基的环骨架组成(22)。在流产布鲁氏菌C β G的情况下，环β -1，2-葡聚糖的一部分用O-琥珀酰残基取代(19)。青枯菌Ci3 G由具有13个葡萄糖的环骨架组成。一个键为α-1，6，而所有其它葡萄糖残基通过β_1，2连接(22)。合成的甲基-环糊精(Μβ⑶)由通过β-1，4-键连接且含有O-甲基取代基的7个葡萄糖环骨架组成，其作为利用其性质以提取膜胆固醇的脂筏破坏剂也是生物学家已知的(22)。首先，发明人分析了成熟标记物的表面表达。在用流产布鲁氏菌Ci3 G培养的细胞中，大肠杆菌LPS、羊种布鲁氏菌、和流产布鲁氏菌CP G诱导了⑶80、⑶86、⑶40和MHC II类分子的强烈表达，虽然处于略低水平。相反，青枯菌C β G和M β⑶未能显著活化DC。细胞因子分泌的分析确证了表面标记物表达。羊种布鲁氏菌和流产布鲁氏菌Ci3 G诱导TNF-α和IL-12分泌。响应青枯菌C a G，DC几乎不产生TNF-α和IL-1 ;响应M β CD，未分泌一种细胞因子。以上数据首先表明环葡聚糖-依赖的DC活化极大地取决于分子结构，其次表明胆固醇提取对DC中的免疫系统应答没有任何效果。通讨C β G的DC-活化需要TLR4、MvD88和TRIF,伯与CD14无关我们分析了 TLR和适配子对C β G识别的贡献。MyD88和TRIF为TLR信号化中涉及的适配子分子。TLR1、2、4、5、7、8、9、IL-1R和IL-18R通路中涉及MyD88，而TRIF对TLR3和 TLR4 是唯一的。用 CP G 处理源自 TLR4、TLR2、MyD88、TRIF、TRIF/MyD88 和 CD14K0 小鼠的BMDC。在TLR4、Myd88、Myd88/TRIF和TRIF KO小鼠来源的BMDC (通过大肠杆菌LPS或羊种布鲁氏菌Ci3 G刺激)中未能观察到活化，如通过测量促炎细胞因子例如IL-12、IL-6和TNF-α的共刺激分子和分泌的表面表达所显示的(图2A和B)。这些结果显示了羊种布鲁氏菌Ci3 G诱导经由TLR4通路活化的DC成熟。`为了描述通过羊种布鲁氏菌诱导的DC成熟所涉及的途径，在源自MyD88K0、TRIFKO和双重MyD88/TRIFK0小鼠的BMDC中测试C β G活化。类似于大肠杆菌LPS，通过羊种布鲁氏菌C β G的IL-12诱导在源自MyD88-K0和TRIF-KO小鼠的BMDC中受阻,与用可得然胶(curdlan,—种来自粪产碱菌(Alcaligenes faecalis)的线性^-1，3葡聚糖)处理的DC相比，当用布鲁氏菌Ci3G培养细胞时，在双重MyD88/TRIFKO中未观察到IL-12分泌。已知在MyD88/TRIF非依赖性方式中，凝胶多糖与关键β -葡聚糖受体Dectin-1相互作用。LPS识别包括LPS-结合蛋白质(LBP)、⑶14和TLR4/MD2复合物。在大肠杆菌LPS-处理的⑶14 KO BMDC中，促炎细胞因子例如IL-12的分泌、以及共刺激分子MHC-1I的细胞表面表达被完全破坏。相反，C β G-处理的BMDC的活化与⑶14无关。C β G不需要⑶14以活化TLR4通路的事实强调了与LPS不同的识别机制。总之，这些结果表明Cβ G为一种新型TLR4激动剂。有效生物学诱导剂例如LPS显示高毒性和免疫原性，这些性能阻碍了这些分子作为佐剂的用途。因此相应地在纯化的布鲁氏菌Ci3 G制剂中研究这些性能。与大肠杆菌LPS相比，布鲁氏菌C β G对细胞培养物或动物是无毒的(表I)，并不在小鼠、兔或天然感染的牛中诱导抗体的产生(未显示)。这些结果确证了先前的结果，显示了在细胞培养物中即使在非常高的浓度(IOmM)下，⑶G也是无毒的。因此，⑶G是一种不具有LPS毒性的TLR4激动剂。
布鲁氐菌CPG在体内诱导CD8应答发明人研究了环葡聚糖诱导CD8+T细胞针对无外源性抗原的应答的能力。发明人将CD8+Ly5.2CFSE+0T-1 T细胞转移入C57Bl/6Ly5.1小鼠，然后用单独的PBS(组I)、单独的OVA(组2)、具有环葡聚糖的OVA(组3)或具有已知佐剂例如Poly Ι/C的OVA(组4)或IFA (组5)将小鼠免疫(s.C.)。免疫后3天，发明人能够在除用PBS对照免疫外的所有组的小鼠的引流淋巴结中观察到OT-1 T细胞增殖。然后我们研究了活化标记物在CD8+CD45.2+群体中的表面表达。发明人通过流式细胞计分析了⑶25、⑶44表达的上调和⑶62L的下调，这与T细胞从淋巴结向感染位点的迁移有关。在仅接种PBS或接种含OVA的PBS的小鼠中无细胞活化。然而，在用OVA和环葡聚糖免疫的组中，发明人能够观察到CD25和CD44的上调、以及⑶62L表达的强烈下调，这比用已知佐剂如Poly:1C免疫的组中的高。这些数据显示CP G能够诱导体内⑶8+T细胞增殖和活化。布鲁氏菌Cg G诱导人DC的成熟发明人研究了羊种布鲁氏菌Ci3 G是否也为源自人单核细胞的DC的刺激物。人DC由人外周血液获得的单核细胞分化6天(在GM-CSF和IL-4存在下)或3天(在GM-CSF和IFN存在下)。因此，发明人测试了多种浓度的羊种布鲁氏菌C β G在DC成熟上的作用。在IFN-分化的DC中，在用羊种布鲁氏菌CP G处理24h之后检测到了⑶80、⑶83、⑶40、HLA-DR、HLA-ABC和⑶86在细胞表面上以剂量依赖性方式的上调(图2A)。如在小鼠DC中，所使用的较低浓度(0.2μΜ)未能诱导该DC显型。在IL-4-分化的人类DC呈现出相同结果。发明人进一步证明了 Ci3G有效地活化了人血液mDC，形成大量IL-lb、TNFa、和IL-12，如在小鼠DC中所观察到的。特别地，对于来自血液mDC的IL-1b的诱导，Ci3 G比大肠杆菌LPS更有效(图2B)。使用C β G的mDC活化导致增强的异源na’ive⑶4+T细胞增殖。其也导致增强的Flu Ml-特异性⑶8+T细胞应答以及MART-1特异性⑶8+T细胞应答。虽然对于⑶4+T细胞增殖，C β G比大肠杆菌LPS更有效，但C β G和大肠杆菌LPS均导致相似水平的Flu Ml-特异性CD8+T细胞应答，如交叉递呈试验中所示。总之，这些结果表明布鲁氏菌Ci3 G是一种DC和巨噬细胞的泛活化剂。在体内和体外，布鲁氏菌Cg G不是内毒素因为Ci3 G能够引发强烈的活化并因为似乎介导的活化依赖于TLR4通路，发明人观察了可能在体外和在体内产生的内毒素性。使用不同试验，尤其是鲎变形细胞裂解液试验、注射有多种激动剂的瑞士小鼠中的DL50和如通过铬释放测量的巨噬细胞中的毒性。表I显示与大肠杆菌LPS和布鲁氏菌LPS相比，C β G根本无毒。正如预期地，与布鲁氏菌LPS相比，大肠杆菌LPS能够以非常低的浓度诱导内毒素性休克。表1: 羊种布鲁氏菌Ci3 G缺乏内毒素性
权利要求
1.一种免疫佐剂化合物，包含至少一种环β葡聚糖(Ci3G)化合物。
2.根据权利要求1任一项的免疫佐剂化合物，其中至少一种Cβ G可被至少一种天然取代基残基取代。
3.根据权利要求1-2任一项的免疫佐剂化合物，其中所述至少一种天然取代基残基为琥珀酰残基。
4.根据权利要求1-3任一项的免疫佐剂化合物，其中天然取代基残基的数目为0-25个，优选0-3个。
5.根据权利要求1-4任一项的免疫佐剂化合物,其中至少一种CPG为由羊种布鲁氏菌和/或流产布鲁氏菌获得的C β G。
6.一种疫苗组合物,包含根据权利要求1-5任一项的免疫佐剂化合物、以及一种或多种抗原。
7.根据权利要求1-5任一项的免疫佐剂化合物，用作药物。
8.根据权利要求1-5任一项的免疫佐剂化合物在制备疫苗组合物中的用途。
9.一种试剂盒,包含: -根据权利要求1-5任一项的免疫佐剂化合物 -至少一种抗原。
10.一种环β葡聚糖( CPG)化合物用于诱导需要其的受试者中树突状细胞(DC)的成熟的治疗方法。
全文摘要
本发明涉及用作免疫佐剂的环β葡聚糖化合物和包含它的疫苗组合物。这些新型佐剂化合物特别代表了一类新的树突状细胞活化分子。
文档编号A61K39/39GK103096923SQ201180027729
公开日2013年5月8日 申请日期2011年6月6日 优先权日2010年6月4日
发明者J-P·戈韦尔, A·克勒谢弗斯凯, A·马蒂罗斯彦, J·班彻雷奥, S·奥 申请人:国家医疗保健研究所, 国家科学研究中心, 埃克斯-马赛大学