专利名称：蛋白质的选择性修饰的制作方法
技术领域：
本发明涉及将取代基选择性引入蛋白质的方法、靶定试剂及其在所述方法中的用途、以及可由所述方法获得的蛋白质。
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背景技术：
用于制药目的的蛋白质的选择性修饰为日益重要的领域。通过选择性修饰蛋白质，例如通过加入聚乙二醇(PEG)，可改进蛋白质的药理学特征和半寿期。具体而言，需要产生蛋白质的长效变体以用作药物。已开发许多技术以选择性修饰蛋白质的特定区。对于诸如因子VIII和Von Willebrand因子(vWF)等大型蛋白质而言，选择性修饰尤其困难。可通过使其与非选择性试剂反应来修饰蛋白质，所述非选择性试剂能够与蛋白质上的残基形成键。通过这类方法将形成大范围的不同产物，因为所述试剂可与蛋白质上任何合适的残基反应。此技术的扩展包括使用配体封闭蛋白质上的特定位点，所述配体与这些位点结合。然后向非选择性试剂中加入配体/蛋白质缀合物，所述非选择性试剂与蛋白质上未封闭的位点反应，留下封闭的位点不被修饰。亦已研究蛋白质的选择性修饰。用于选择性修饰蛋白质的一项技术涉及在蛋白质中预先确定的位点上引入半胱氨酸残基作为突变。然后可使突变的蛋白质与以下试剂反应，所述试剂选择性地与半胱氨酸残基反应以得到选择性修饰的蛋白质。另一项技术涉及，通过使蛋白质与以下复合物反应来直接向蛋白质中加入大型取代基(通常为PEG)，所述复合物包含大型取代基和与蛋白质选择性结合的配体。Dawson 等，Journal of Thrombosis and Haemostasis, 5，iY 似你阐述了利用靶向配体和光致交联反应将标记引入凝血酶的技术。因此需要更有效且更具选择性的技术用于修饰蛋白质、尤其是大型蛋白质。发明概沭
本发明人设计了在邻近因子VIII上归巢肽(homing peptide)的结合位点处，将取代基选择性引入因子VIII的新方法。此方法具有普遍适用性，并且可用于将取代基选择性引入任何蛋白质，但是对于大型蛋白质而言尤其有用。本发明方法的一个应用为提供具有增加的血浆半寿期的修饰蛋白质。这类长效修饰的蛋白质有可能用作药物，因为增加的血浆半寿期可允许减小的剂量和/或减少的给药频率。因此，本发明提供在邻近蛋白质上归巢肽⑵的结合位点处，将取代基(G)选择性引入蛋白质的方法，所述方法包括
(a)使蛋白质与式(I)化合物(“靶定试剂”)接触以使靶定试剂与蛋白质结合
权利要求
1.一种在邻近蛋白质上归巢肽(P)的结合位点处将取代基(G)选择性引入蛋白质的方法，所述方法包括(a)使蛋白质与式(I)化合物(“靶定试剂”)接触以使靶定试剂与蛋白质结合
2.根据权利要求I的方法，其中所述归巢肽不含携带未取代ε-氨基的任何赖氨酸残基，并且其中所述靶蛋白包含表面暴露的赖氨酸，以及其中所述靶定试剂的总质量不超过3000 Da0
3.根据权利要求I或权利要求2的方法，其中所述蛋白质为因子VII、因子Vila、因子VIIKVon Willebrand因子(vWF)、组织因子(TF)、细胞因子、生长激素、抗体或其抗原结合片段。
4.根据权利要求3的方法，其中所述蛋白质为因子VIII。
5.根据权利要求4的方法，其中所述归巢肽(P)包含以下氨基酸序列(SEQID NO1-44)之一
6.根据上述权利要求中任一项的方法，其中所述接头L为式(II)基团
7.根据上述权利要求中任一项的方法，其中至少一个所述取代基G为能够后续修饰的取代基(G1)。
8.根据权利要求7的方法，其中G1包含醛、酮、缩醛、半缩醛、叠氮化物、炔、吡啶基二硫化物、烷氧基胺或其任何衍生物。
9.根据权利要求7或8中任一项的方法，所述方法还包括(c)使在邻近所述结合位点处携带取代基G1的所得蛋白质与包含取代基R的修饰试剂反应，从而提供携带所述取代基R的蛋白质。
10.根据权利要求9的方法，其中所述取代基R为能够增加蛋白质的血浆半寿期的取代基。
11.根据权利要求9或10的方法，其中R包含二膦酸盐、与血小板或内皮细胞结合的取代基、抗体、亲水聚合物、白蛋白或白蛋白结合剂。
12.根据权利要求11的方法，其中所述亲水聚合物为聚乙二醇(PEG)。
13.一种蛋白质，所述蛋白质在邻近蛋白质上归巢肽的结合位点处被取代并且所述蛋白质可通过上述权利要求中任一项的方法获得。
14.一种药物组合物，所述药物组合物包含如在权利要求13中定义的蛋白质以及药学上可接受的稀释剂或载体。
全文摘要
本发明公开了一种在邻近蛋白质上归巢肽的结合位点处将取代基选择性引入蛋白质的方法，所述方法包括(a)使蛋白质与包含归巢肽的化合物接触，所述归巢肽具有与蛋白质的结合位点结合的能力；和(b)允许蛋白质上邻近该结合位点的部分与包含归巢肽的化合物反应，从而将取代基G转移到蛋白质上。
文档编号A61K38/37GK102939110SQ201180030715
公开日2013年2月20日 申请日期2011年4月12日 优先权日2010年4月21日
发明者M.科福德-汉森, H.R.施滕尼克, S.奥斯特加尔德, H.奥斯特加尔德 申请人:诺沃—诺迪斯克有限公司