用于预防及治疗非酒精性脂肪肝疾病的腺病毒ad36e4orf1蛋白的制作方法

专利名称：用于预防及治疗非酒精性脂肪肝疾病的腺病毒ad36e4orf1蛋白的制作方法
技术领域：
本发明系关于治疗或预防非酒精性脂肪肝疾病的症状的方法、减少肝脏中过多脂肪的方法、改善血糖控制的方法、及治疗或预防肝脏功能障碍的方法。
背景技术：
肝脏在脂肪代谢中起主要作用且通常积聚脂质(脂肪)，但仅积聚至「正常含量」。肝细胞中脂质积聚过多导致肝脂肪变性，其在代谢上有害且可由多种肝脏功能障碍引起，诸如脂蛋白的β氧化减少或分泌减少。肝脏的许多功能中的另一种为释放葡萄糖至循环中。在健康个体中，肝细胞定期释放葡萄糖以调节血糖含量。相比的下，在患有糖尿病的个体中，肝细胞不受控制地释放葡萄糖，此使血糖含量增加。因此，减少肝脏细胞(livercell)(肝细胞(hepatocyte))的葡萄糖释放可极有效地控制糖尿病。肝脏中的过多脂质 积聚可助长胰岛素抗性，且因此使血糖控制不良。脂联素(Adiponectin)为一种由脂肪组织(fat tissue/adipose tissue)分泌的蛋白质,其以许多方式改善胰岛素敏感性。脂联素经由脂联素受体AdipoRl及AdipoR2起作用来活化AMPK及PPARa路径(32)、减少全身性及肝胰岛素抗性以及减轻肝脏炎症及纤维化(32)。其为肝脂质含量的强决定性因素，如由脂联素KO或过表现的小鼠模型所示(14，33)。脂联素藉由上调AMPK介导的肝脂质氧化来降低肝脂肪变性(34)。非酒精性脂肪肝疾病(NAFLD)在美国影响多达20%的成人，且包括肝脏中脂肪积聚过多(肝脂肪变性)。其通常与肥胖症及胰岛素抗性有关(1，2)。NAFLD的流行率在患有第2型糖尿病或肥胖症的成人中为约70%至80% (3-5)，在所有儿童中为3%至10%，且在肥胖儿童中高达40%至70%(4)。NAFLD与较高总体及肝脏相关的死亡率有关(6，7)。除脂肪变性的外，可能发生炎症及纤维化且NAFLD可能发展成非酒精性脂肪肝炎(non-alcoholicsteato-hepatitis, NASH)、肝硬化、肝衰竭及肝细胞癌。虽然脂肪变性可能具有可逆性,但一旦其发展成NASH，则不存在确立的治疗，且少数可用的药物治疗显示有限的成功率(8，9)。因此，即时预防及/或治疗肝脂肪变性至关重要。然而，即使对于NAFLD，药物治疗亦仅具有较低成功率(10 )，且减少饮食脂肪摄取及减少肥胖为治疗的主要手段(11)。尽管有明显健康益处，但已证明对于一般人群而言顺应生活方式改变以达成饮食或肥胖的持续改善具有挑战性。虽然过度肥胖或高脂肪(HF)饮食为NAFLD的风险因素，但腺病毒36 (Ad36)即使在持续HF饮食下亦减轻小鼠的肝脂肪变性且不会减少内脏或皮下肥胖。Ad36似乎改造现存脂肪组织的品质以减轻HF饮食诱发的肝脂肪变性。Ad36使脂肪组织代谢品质发生的此改变包括脂肪酸的吸收增加及释放减少，以及更高的脂联素分泌(12，13)。Ad36的此独特能力提供以新颖方式消除过度肥胖或过度饮食脂肪摄取(而无需减少)的有害作用的显著模型。噻唑唳二酮(Thiazolidinediones ;TZD)类药物亦可改善脂肪组织的代谢品质、上调脂联素及改善肝脂肪变性(14-16)。已报导TZD的严重副作用(17-19)。Ad36并未导致动物发病或意外死亡。此外，Ad36似乎具有优于TZD的作用的明显优点，尤其在存在HF饮食下。不同于TZD，Ad36并未增加进食HF饲料的小鼠的肥胖(20，21)。在存在HF饮食下，TZD可改善血糖控制，但其同时促进各种器官(包括肝脏)中的脂质储存(20，22，23)。若不减少脂肪摄取，则此会限制TZD的范围。由于Ad36的作用不具饮食脂肪及肥胖相关性，因此Ad36对多种代谢路径的潜在作用可提供在临床上更具吸引力且因此可能更有效的新颖抗脂肪变性方法。出于有益目的利用病毒的某些性质已创造性地使用若干年，包括使用噬菌体病毒的杀菌性质(27)、突变型腺病毒的溶瘤能力(28)、或使用疱疹单纯型病毒及若干其它病毒单独或与各种协同药物一起(30，31)来治疗癌(29)。因此，与肥胖或饮食脂肪摄取无关的降低肝脂肪变性的药剂将极具吸引力且具有实际益处。

发明内容
本发明系关于以下发现Ad36感染与肝脏病理学及功能障碍的发病率减少有关，且Ad36 E4orfl蛋白可用于改变基因表现及生物化学路径，从而使肝脏功能得到改善。本发明大体系关于治疗或预防个体的非酒精性脂肪肝疾病的症状的方法。在一些态样中，该方法包含向个体给药治疗有效量的腺病毒-36 E4orfl蛋白，其中该个体的症状在给药后改善。本发明亦系关于减少个体肝脏中的过多脂肪的方法。在一些态样中，该方法包含向个体给药治疗有效量的腺病毒-36 E4orfl蛋白，其中肝脏中的脂肪在给药后减少。本发明亦系关于改善个体的血糖控制的方法。在一些态样中，该方法包含向个体给药治疗有效量的Ad36 E4orfl蛋白，其中胰岛素敏感性在给药后增强。本发明亦系关于治疗或预防特征在于脂肪肝及/或胰岛素抗性的肝脏功能障碍的方法。在一些态样中，该方法包含向个体给药治疗有效量的Ad36 E4orfl蛋白，其中肝脏脂肪积聚在给药后改善。肝脏脂肪积聚改善的特征可在于脂质氧化增加或脂质自肝脏的转运增加。本发明亦系关于减少或预防NASH的方法。在一些态样中，该方法包含向个体给药治疗有效量的Ad36 E4orfl蛋白，其中由肝功能障碍引起的高血糖症得以减轻。腺病毒-36 E4orfl蛋白的胺基酸序列可为SEQ ID N0:2或其功能变异体。腺病毒-36 E4orfl的核酸序列可包含SEQ ID NO:1或其功能变异体。个体可为人类。可藉由将编码腺病毒-36 E4orfI蛋白的核酸分子以允许腺病毒-36 E4orfl蛋白表现的方式引入个体来向该个体给药腺病毒-36 E4orfl蛋白。可藉由使用任何适合方法来引入核酸序列。此项技术中习知许多适合方法，诸如电穿孔、DEAE聚葡萄糖转染、磷酸钙转染、阳离子性脂质体融合、原生质体融合、产生活体内电场、经DNA涂布的微弹轰击、注射重组复制缺陷型病毒、同源重组、活体内基因疗法、活体外基因疗法、奈米粒子传递、病毒载体及裸DNA转移。


图1为展示进食普通饲料(chow-fed)的小鼠腹膜后脂肪垫及肝脏的重量的图。图2为展示进食高脂肪(HF)饲料的小鼠的体重的图。图3A为展示进食普通饲料的小鼠的空腹血清葡萄糖的图。图3B为展示进食普通饲料的小鼠的血清胰岛素的图。图3C为展示进食HF饲料的小鼠的空腹血清葡萄糖含量改变的图。图3D为展示进食HF饲料的小鼠的空腹血清胰岛素改变的图。图3E为展示进食HF饲料的小鼠在感染后12周进行葡萄糖耐受性测试的结果的图。图3F为展示进食HF饲料的小鼠在感染后20周自由进食的血清葡萄糖的图。图4A为展示进食HF饲料的小鼠的空腹血清葡萄糖的图。图4B为展示进食HF饲料的小鼠在感染后20周自由进食的血清葡萄糖的图。图5A为展示进食HF饲料的小鼠的骨胳肌中蛋白质丰度的西方墨点图。图5B为展示进食HF饲料的小鼠的脂肪组织中蛋白质丰度的西方墨点图。图5C为展示进食HF饲料的小鼠的肝脏中蛋白质丰度的西方墨点图。 图6A为C57B1/6J小鼠的肝脏组织的一组过碘酸希夫氏染色(Periodicacid-Schiff stain)。深色染色展示肝糖且白色区域指示脂质积聚。进食普通饲料的对照小鼠展示最低脂质积聚。进食 HF饲料的组展示较高脂质积聚。然而，如由较低脂质积聚及较高肝糖所示，Ad36而非Ad2显著减轻HF饮食诱发的脂肪变性(进食HF饲料仿真感染对比进食HF饲料Ad36感染；p〈. 02)。图6B为展示进食HF饲料的小鼠的肝脏切片的肝糖含量的图。图6C为展示进食HF饲料的小鼠的肝脏切片的脂质含量的图。图7为展示使用来自在感染后20周在自由进食状态下处死的进食HF饲料的小鼠的脂肪组织蛋白质所得的西方墨点图。(3只小鼠/组)。图7A =GAPDH为负载对照。相较于仿真组，Ad36组而非Ad2组中磷酸-AKT、Glutl、Glut4及脂联素较高(p〈. 05)。图7B :相较于仿真组，Ad36组而非Ad2组中，在非还原、非变性条件下所分析的各脂联素寡聚物较高(ρ〈· 03)。图8展示使用进食HF饲料的小鼠的肝脏蛋白质获得的西方墨点图。相较于仿真组，Ad36组而非Ad2组中p-AMPK较高且Glut2及G6pase较低(p〈. 05)。图9A及9B为展示进食普通饲料的小鼠在基线时(第O周)及感染后达12周时空腹血糖(A)及空腹血清胰岛素(B)的图。相对于仿真组，*p〈. 05。图1OA至D为展示Ad36、Ad2或仿真组中进食HF饮食的小鼠的感染后血清葡萄糖及胰岛素时程的图。(A)第4周及第8周调节至基线的空腹血清葡萄糖(第O周)。(B)第12周在每公克2. 5毫克后进行的腹膜内葡萄糖耐受性测试。(C):第20周自由进食葡萄糖。(D)自第O周起空腹胰岛素的改变。相较于各别研究的仿真组，*p〈. 05或更小。图1lA至C为展示在3T3-L1 (A)前脂肪细胞、(B)脂肪细胞及(C) C2C12肌母细胞中E4orfl表现使基底2DG葡萄糖吸收显著增加的图。图1lD为展示在基底以及胰岛素刺激条件下在H印G2细胞中E4orfl表现使葡萄糖输出显著减少的图。
具体实施例方式概述本发明系关于以下发现Ad36感染与肝脏病理学及功能障碍的发病率减少有关，且Ad36 E4orfl蛋白可用于改变基因表现及生物化学路径，从而使肝脏功能得到改善。基于此等发现，可藉由将Ad36或经分离或重组Ad36 E4orfl蛋白给药个体来治疗或甚至预防非酒精性脂肪肝疾病(NAFLD)。因此，在此项技术中熟知NAFLD经常因治疗或减少NAFLD的病理性过程而发展成NASH，发展成NASH的进展可减少或预防。因此，本发明亦包括用于减少或预防NASH的方法。虽然许多病毒导致严重肝脏损伤(25，26)，但意外的是Ad36及Ad36E4orfl藉由有利地调节多种代谢路径而保护肝脏，藉此对肝脂肪变性及肝脏功能具有有益作用。如本文所用，「血糖控制」系指身体保持葡萄糖含量处于正常范围内的能力。当胰岛素敏感性增强时血糖控制得到改善。胰岛素抗性对血糖控制具有相反作用。如本文所用，「葡萄糖吸收」系指细胞自其周围获取的葡萄糖的量。一般而言，肌细胞或脂肪细胞(脂肪细胞及前脂肪细胞)的葡萄糖吸收较高为有益的，因为其自循环中清除葡萄糖且改善高血糖症(高于血液中的正常葡萄糖)。已发现在人类的天然Ad36感染与较佳血糖控制及较低肝脂质的间存在关联。在动物模型中进一步研究此关联，且结果证实Ad36感染出乎意料地降低肝脂质含量且改善血糖控制。其它研究揭示Ad36作用由Ad36 E4orf I蛋白介导。如本文所述，所进行研究的结果显示Ad36 E4orfl蛋白增加肝脏中的脂肪氧化、增加脂肪自肝脏的转运及减少自肝脏释放的葡萄糖。因此，本发明 者已发现病毒蛋白质Ad36 E4orf I担负Ad36对NAFLD的保护作用，及对肝脏功能及血糖控制的有益作用。Ad36 E4orfl结构及某些代谢功能描述于作为国际公开案第WO 2007/064836号于2007年6月7日公开的国际申请案第PCT/US2006/045919号中。如本文所示，Ad36的E4orfl蛋白为Ad36病毒对肝脂肪变性的保护作用的介体。经Ad36感染的小鼠甚至在感染后5个月仍继续在其肝脏中表现E4orfl基因。此等肝脏显示显著较低的脂质积聚，及促进脂质氧化及脂质输出的基因的较高表现。此外，Ad36 E4orfl上调脂联素，且以Ad36 E4orfl转染!fepG2细胞(肝细胞细胞株)下调Glut2丰度及葡萄糖释放。不希望受任何特定理论束缚，咸信脂联素为肝脂肪变性的关键效应物且由脂肪组织分泌。单独Ad36 E4orfl蛋白的表现使细胞的脂联素分泌稳固增加。此表明Ad36经由E4orfl介导的脂联素上调来降低肝脂质积聚。此外，Ad36 E4orfl下调Glut2丰度及葡萄糖释放，此可有助于降低肝脏中的脂质积聚。因此，咸信Ad36藉由直接作用于肝细胞及经由藉由脂联素的间接作用来保护肝脏不发生肝脂肪变性，且E4orfI蛋白为此等作用的介体。治疗方法本发明提供用于治疗或预防NAFLD、减少肝脏的过多脂肪、改善血糖控制及治疗或预防肝脏功能障碍的治疗方法。
在一态样中，本发明提供用于治疗及预防非酒精性脂肪肝疾病(NAFLD)的症状的方法。向有需要的个体(例如哺乳动物，诸如人类或其它灵长类动物)给药治疗有效量的Ad36组成物来治疗或预防NAFLD。在一态样中，本发明提供用于预防NASH的方法。向有需要的个体(例如哺乳动物，诸如人类或其它灵长类动物)给药治疗有效量的Ad36组成物以藉由减少由肝功能障碍引起的高血糖症来预防NASH。在一态样中，本发明提供用于减少个体(例如，哺乳动物，诸如人类或其它灵长类动物)肝脏中的过多脂肪的方法。向有需要的个体给药治疗有效量的Ad36组成物来减少个体肝脏中的过多脂肪。在一态样中，本发明提供用于改善个体(例如，哺乳动物，诸如人类或其它灵长类动物)的血糖控制的方法。向有需要的个体给药治疗有效量的Ad36组成物来改善该个体的血糖控制。在一态样中，本发明提供用于治疗或预防特征在于脂肪肝及/或胰岛素抗性的肝脏功能障碍的方法。向有需要的个体(例如哺乳动物，诸如人类或其它灵长类动物)给药治疗有效量的Ad36组成物来治疗或预防特征在于脂肪肝及/或胰岛素抗性的肝脏功能障碍。在本文所述的任何方法的较佳具体实例中，所给药的Ad36组成物为经分离或重组Ad36 E4orfl蛋白或其功能变异体。在本文所述的任何方法的其它具体实例中，所给药的Ad36组成物为编码Ad36 E4orfl蛋白或其功能变异体的经分离或重组核酸。Ad36 组成物根据本发明给药的Ad36组成物可具有多种形式。组成物较佳包含Ε4οι·Π或其功能变异体。举例而言，Ad36组成 物可为Ad36病毒或Ad36的减毒变异体或不活化形式，诸如经热杀死或漂白剂杀死的Ad36或复制缺陷型重组Ad36。Ad36组成物可包含经分离或重组Ad36蛋白，较佳为E4orfl蛋白或其功能变异体。Ad36组成物可包含编码E4orf I蛋白或其功能变异体的核酸。Ad36组成物可包含E4orfl蛋白的类似物，例如化学类似物或结构类似物。蛋白质及肽Ad36组成物可包含经分离或重组Ad36蛋白，较佳为E4orf I蛋白或其功能变异体。本文中称作「经分离」的蛋白质或多肽为以下蛋白质或多肽该等蛋白质或多肽纯化至超过其在受感染哺乳动物细胞中所存在的状态。Ad36蛋白，包括E4orfl及其功能变异体，可使用熟知方法(诸如重组表现及纯化)、化学合成(例如合成肽)或藉由生物及化学方法的组合及经分离的重组蛋白质或多肽来制造。所获得的蛋白质可呈至少约50重量％、较佳至少约75重量％的经分离状态，且更佳呈基本上纯的形式。本文中称作「重组」的蛋白质或多肽为藉由重组核酸的表现所产生的蛋白质或多肽。如本文所用，「Ad36 E4orflJ系指来自腺病毒36的天然产生或内源性E4orfl蛋白、具有与天然产生或内源性相应Ad36 E4orf I蛋白相同的胺基酸序列的蛋白质(例如重组蛋白质)及上述各物的功能变异体(例如经由突变诱发及/或重组技术产生的功能片段及/或突变体)。因此，如本文所定义，该术语包括成熟Ad36 E4orfl、糖基化或未糖基化Ad36E4orfl蛋白、Ad36 E4orfl的多形或对偶基因变异体及其它同功异构物(例如，由替代性拼接或其它细胞过程所产生)，及功能片段。
Ad36 E4orfl的「功能变异体」包括功能片段、功能突变型蛋白质及/或功能融合蛋白。一般而言，本发明所涵盖的Ad36 E4orfl的片段或部分包括相对于成熟Ad36 E4orfl具有胺基酸(亦即一或多个胺基酸)缺失(亦即一或多个缺失)者(诸如N端、C端或内部缺失)。亦设想相对于成熟Ad36E4orn而言仅缺失邻接胺基酸或缺失非邻接胺基酸的片段或部分。一般而言，本发明所涵盖的Ad36 E4orfl的突变体或衍生物包括差异在于添加、缺失及/或取代一或多个邻接或非邻接胺基酸残基的天然或人工变异体，或一或多个残基经修饰的经修饰多肽，及包含一或多个经修饰残基的突变体。较佳突变体为差异在于添加、缺失及/或取代一或多个邻接或非邻接胺基酸残基的Ad36 E4orfl的天然或人工变异体。Ad36 E4orfl的「功能片段或部分」系指经分离及/或重组蛋白质或寡肽，其具有Ad36 E4orfl所特有的至少一种性质、活性及/或功能，诸如减轻肝脂肪变性、增强葡萄糖处置及/或改善血糖控制。一般而言，Ad36 E4orf I或功能变异体具有在变异体的长度范围内与SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO:4至少约85%相似、至少约90%相似、至少约95%相似、至少约96%相似、至少约97%相似、至少约98%相似或至少约99%相似的胺基酸序列。在一些实施例中，例如使用当前可用的重组蛋白质制备，使用SEQ ID NO:1或SEQID N0:3来制备Ad-36E4orfl的经纯化蛋白质。可使用适合胺基酸序列比对算法,诸如CLUSTAL W,使用预设参数来确定 胺基酸序列一致性。(Thompson J. D.等人，Nucleic AcidsRes.22:4673-4680(1994))。核酸及载体Ad36组成物可包含编码Ad36的蛋白质，较佳E4orfl蛋白或其功能变异体的经分离或重组核酸或载体。可给药具有编码Ad36 E4orfl蛋白或其功能变异体的序列的经分离及/或重组(包括例如基本上纯)核酸来原位产生Ad36 E4orfl。本文称作「经分离」的核酸为自原始来源的基因体DNA或细胞RNA (例如，当其存在于细胞或诸如文库的核酸混合物中时)分离出来的核酸，且可已经历进一步处理。「经分离」核酸包括藉由本文所述的方法、类似方法或其它适合方法所获得的核酸，包括基本上纯的核酸、藉由化学合成产生的核酸、藉由生物及化学方法的组合产生的核酸、及经分离的重组核酸。本文称作「重组」的核酸为藉由重组DNA方法所产生的核酸，包括藉由依赖于人工重组方法的程序所产生的核酸，该人工重组方法诸如聚合酶链反应(PCR)及/或使用限制酶选殖至载体中。「重组」核酸亦为由经由细胞的天然机制所进行的重组事件所产生、但在经设计以允许及可能产生所要重组事件的核酸引入细胞后所选择的核酸。满足此等准则的经分离及/或重组核酸包含序列与编码天然产生的Ad36 E4orfl及其部分的序列一致的核酸，或天然产生的序列的功能变异体。该等变异体包括差异在于添加、缺失或取代一或多个残基的突变体、一或多个残基经修饰的经修饰核酸(例如DNA或RNA类似物)及包含一或多个经修饰残基的突变体。序列可经密码子最佳化或密码子去最佳化以供在个体中表现。在一态样中，Ad36 E4orfI或功能变异体具有在变异体的长度范围内与SEQ IDNO:1或SEQ ID NO: 3至少约85%相似、至少约90%相似、至少约95%相似、至少约96%相似、至少约97%相似、至少约98%相似或至少约99%相似的核酸序列。可使用适合核酸序列比对算法，诸如CLUSTAL W，使用预设参数来确定核酸序列一致性。(Thompson J. D.等人，Nucleic Acids Res. 22:4673-4680 (1994))。核酸可呈DNA、RNA形式，且可为单股或双股。一般而言，核酸可操作地连接至表现控制序列，诸如复制起点、激活子及强化子(参见例如Queen,等人，Immunol.Rev. 89:49-68, 1986)。用于在所要细胞中表现重组蛋白质的许多适合载体为此项技术中所熟知及习知。适合载体可含有多种组分，包括(但不限于)以下一或多者复制起点；可选择标记基因；一或多个表现控制组件，诸如转录控制组件(例如激活子、强化子、终止子)，及/或一或多个转译信号；及靶向所选宿主细胞中的分泌路径的信号序列或前导序列。必要时，载体可包括可侦测标记。在某些实施例中，表现载体用于基因疗法中。表现需要在载体中提供适当信号，且其包括来自病毒及哺乳动物来源的驱动所关注基因在宿主细胞中表现的各种调节组件，诸如强化子/激活子。亦已知经设计以最佳化宿主细胞中的信使RNA稳定性及可转译性的组件。存在多种可供将表现载体引入细胞中的方式。在本发明的某些实施例中，表现构筑体包含病毒或来源于病毒基因体的经工程改造的构筑体。某些病毒经由受体介导的内饮作用进入细胞、整合至宿主细胞基因体中及稳定且有效地表现病毒基因的能力使其成为用于将外来基因转移至哺乳动物细胞中的有吸引力的候选者(Ridgeway，1988 ；Nicolas 及 Rubinstein, :Vectors:A survey of molecular cloning vectors and theiruses, Rodriguez及 Denhardt 编，Stoneham:Butterworth,第 494-513 页，1988. ；Baichwal及 Sugden, Baichwal, :Gene Transfer, Kucherlapati R 编，New. York, Plenum Press,第117-148 页，I986· 1986 ；Temin, :Gene Transfer, Kucherlapati, R 编，New York, PlenumPress,第149-188页，1986)。较佳基因疗法载体一般为病毒载体。给药Ad36 E4orf I可能利用多种投药途径，包括(但不必限于)非经肠(例如静脉内、动脉内、肌肉内、皮下注射)、经口(例如饮食)、局部、吸入(例如支气管内、鼻内或经口吸入、鼻内滴剂)或经直肠。可藉由将编码腺病毒-36 E4orfI蛋白的核酸序列以允许腺病毒-36 E4orfl蛋白表现的方式引入哺乳动物体内来给药腺病毒-36 E4orfl蛋白。在该方法中，可藉由选自由以下者所组成的群组的方法引入核酸序列电穿孔、DEAE聚葡萄糖转染、磷酸钙转染、阳离子性脂质体融合、原生质体融合、产生活体内电场、经DNA涂布的微弹轰击、注射重组复制缺陷型病毒、同源重组、活体内基因疗法、活体外基因疗法、病毒载体及裸DNA转移。欲给药的Ad36组成物的调配物将根据所选择的投药途径(例如溶液、乳液、胶囊)及欲治疗的个体而变化。可在生理上可接受的媒剂或载剂中制备包含欲给药的化合物的适当组成物。对于溶液或乳液，适合载剂包括例如水溶液或醇/水溶液、乳液或悬浮液，包括盐水及缓冲介质。非经肠媒剂可包括氯化钠溶液、林格氏右旋糖(Ringer' s dextrose)、右旋糖及氯化钠、乳酸化林格氏溶液( lactated Ringer' s)或不挥发性油。静脉内媒剂可包括各种添加剂、防腐剂或流体、营养素或电解质补充剂(一般而言，参见Remington’sPharmaceutical Science,第16版，Mack编，1980)。对于吸入,将化合物溶解且装载至适合投药分配器中(例如雾化器、喷雾器或加压气雾剂分配器)，或调配成可吸入干粉。
Ad36组成物可以单次剂量或多次剂量给药。给药治疗有效量。治疗有效量为在投药条件下足以产生预期效果的量。举例而言，可给药足以增加脂肪氧化、增加脂肪输出肝脏、降低肝脏中的Glut2丰度、减少肝脏中的G6Pase、提高脂联素及/或Glut4、改善血糖控制及/或改善肝脏功能的量。可由熟习普通技术的临床医师使用此项技术中已知的方法考虑个体的年龄、对药物的敏感性、耐受性药物、疾病严重程度及总体健康状况以及其它因素来确定适当剂量。适合剂量可为每次治疗每公斤体重约O.1mg至约10. Omg0给药Ad36组成物的个体可经由非侵袭性测试(例如使用超音波)筛选以确定治疗是否有效。在一些态样中，将使用超音波筛选个体。在一些态样中，个体将经历肝脏功能测试以量测肝脏酶。 藉此本文引用的所有文献的全部教示内容以引入的方式并入本文中。Ad36 E4orfl 序列Ad-36 E4 orf I DNA 序列(SEQ ID NO.1)ATGGCTGAATCTCTGTATGCTTTCATAGATAGCCCTGGAGGGATCGCTCCCGTCCAGGAAGGGGCTAGCAATAGATATATCTTCTTTTGCCCCGAATCTTTCCACATTCCTCCGCATGGGGTGATATTGCTTCACCTCAGAGTGAGCGTGCTGGTTCCTACTGGATATCAGGGCAGATTTATGGCCTTGAATGACTACCATGCCAGGGGCATACTAACCCAGTCCGATGTGATATTTGCCGGGAGAAGACATGATCTCTCTGTGCTGCTCTTTAACCACACGGACCGATTTTTGTATGTCCGCGAGGGCCACCCAGTGGGAACCCTGCTGCTGGAGAGAGTGATTTTTCCTTCAGTGAGAATAGCCACCCTGGTTTAGAd-36 E4 orf I 蛋白转译(SEQ ID NO. 2)MAESLYAFIDSPGGIAPVQEGASNRYIFFCPESFHIPPHGVILLHLRVSVLVPTGYQGRFMALNDYHARGILTQSDVIFAGRRHDLSVLLFNHTDRFL`YVREGHPVGTLLLERVIFPSVRIATLVAd-36 E4 orf I APDZ DNA 序列(SEQ ID NO. 3)ATGGCTGAATCTCTGTATGCTTTCATAGATAGCCCTGGAGGGATCGCTCCCGTCCAGGAAGGGGCTAGCAATAGATATATCTTCTTTTGCCCCGAATCTTTCCACATTCCTCCGCATGGGGTGATATTGCTTCACCTCAGAGTGAGCGTGCTGGTTCCTACTGGATATCAGGGCAGATTTATGGCCTTGAATGACTACCATGCCAGGGGCATACTAACCCAGTCCGATGTGATATTTGCCGGGAGAAGACATGATCTCTCTGTGCTGCTCTTTAACCACACGGACCGATTTTTGTATGTCCGCGAGGGCCACCCAGTGGGAACCCTGCTGCTGGAGAGAGTGATTTTTCCTTCAGTGAGAATATAGAd-36 E4 orf I APDZ 蛋白转译(SEQ ID NO. 4)MAESLYAFIDSPGGIAPVQEGASNRYIFFCPESFHIPPHGVILLHLRVSVLVPTGYQGRFMALNDYHARGILTQSDVIFAGRRHDLSVLLFNHTDRFLYVREGHPVGTLLLERVIFPSVRI实施例本文揭示的研究结果揭示在人类的Ad36感染与较低肝脂质含量及较佳血糖控制的间存在关联。结果亦表明Ad36 E4orfl蛋白为Ad36病毒的保护作用的介体且该作用可能经由改变若干基因(包括脂联素及Glut2丰度)的表现来介导。因此，本文揭示的此等研究表明Ad36、Ad36 E4orfl及其功能变异体可用于治疗或预防NAFLD、减少哺乳动物肝脏中的过多脂肪、改善血糖控制及治疗或预防肝脏功能障碍。技术及分析病毒制备。Ad-36系获自美国菌种保存中心(American Type Culturecollection) (ATCC目录号VR913)，如先前所描述及使用(45，44)，经溶菌斑纯化且在A549细胞(人类肺癌细胞株)中繁殖。Ad-2亦获自ATCC (目录号VR846)且在A549细胞中繁殖。病毒效价藉由溶菌斑分析(45)测定且接种表述为溶菌斑形成单位(PFU)。b.生物化学分析葡萄糖使用Raichem葡萄糖氧化酶方法(R80038)以96孔板格式量测来自每只小鼠的2yL血清。在500nm下读取吸光度。胰岛素使用超敏感性小鼠胰岛素ELISA套组(Crystal Chem,编号90090)来测定胰岛素。使用Cardiochek脂质组成测试条(Lipidpanel test strip)来测定三酸甘油酯。qRT-PCR 使用RNeasy微型套组根据制造商的说明书(Qiagen，编号74101)自进食高脂肪饲料的小鼠的脂肪组织萃取mRNA。藉由使用扩增级去氧核糖核酸酶I(Invitrogen,编号 18068-015)来去除残余 DNA。使用 iscriptTM cDNA 合成套组(BioRad,编号170-8890)根据制造商的方案将IygS RNA反转录成cDNA。使用PCR核心系统II(Promega,编号M7665)来扩增cDNA。进行定量RT-PCR来检验基因TNF α (肿瘤坏死因子a ,Applied Biosystems,编号Mm00443259_gl)、抵抗素(Resistin)(Applied Biosystems,编号Mm00445641_ml)、MCP-1 (巨噬细胞化学引诱剂蛋白；Applied Biosystems，编号Mm00441243_gl)、CD68 (Applied Biosystems，编号 Mm03047343_ml)、TLR4 (Toll 样受体4 ;Applied Biosystems,编号 Mm00445274_ml)> MCSF (巨卩遼细胞群落刺激因子;AppliedBiosystems编号Mm00432688_ml)及 IL6(介白素6 ;Applied Biosystems,编号Mm00446191_ml)相较于GAPDH (甘油醒3憐酸去氢酶；Applied Biosystems,编号Mm99999915_gl)的相对表现量。藉由T检验比较平均值。显著性设置为p〈0.05。c.证实感染抗体效价藉由『恒定病毒降低血清(constant virus-decreasing serum)』方法(一种用于测定中和抗体的敏感性、特 异性及最高准则分析，如所详细描述(92))来测定血清中中和抗体的存在。简言的，在96孔板中将热不活化测试血清自1:2起连续稀释(两倍)至1:512。向各孔中添加总共100 TCID-50 (组织培养感染剂量50)各别腺病毒工作储备液，随后在37°C下培育I小时后添加A549细胞。一式两份操作各测试血清。各分析中包括血清对照(血清及细胞，但无病毒)、细胞对照(单独细胞，无病毒，无血清)及病毒对照(细胞及病毒，无血清)。将各板在37°C下培育13天且记录CPE (细胞病变效应)的存在。稀释度为1:8或更高的无CPE的血清样品视为对于针对各别病毒的中和抗体的存在为阳性，及先前受到该病毒感染的证据。效价低于1:8的样品视为关于病毒抗体的存在为阴性。在各分析中进行病毒反滴定作为品质检查。 筛选病毒DNA及RNA DNA分离使用QIAMP DNA微型套组(编号51306)分离DNA。针对Ad36、Ad2的E4基因以及小鼠β-肌动蛋白设计引子。藉由PCR扩增DNA。引子序列如下Ad36 前置引子5' -GGCATACTAACCCAGTCCGATG-3'，Ad36 反置引子5' -TCACTCTCAGCAGCAGCAGG-3'；Ad2 前置引子5' -CCTAGGCAGGAGGGTTTTTC-3'，Ad2 反置引子5' -ATAGCCCGGGGGAATACATA-3'；小鼠β_ 肌动蛋白前置引子5' -GATCTTCATGGTGCTAGGAG-3'，
小鼠β -肌动蛋白反置引子5' -ACGTTGACATCCGTAAAGAC-3'。阴性PCR对照水。阳性PCR对照来自经Ad36或Ad2感染的A549细胞的DNA。在95 °C下使DNA变性2分钟且经受35个PCR循环(94°C下I分钟，55 °C下I分钟，72 °C下2分钟随后在72°C下培育5分钟)。使用RNeasy微型套组根据制造商的说明书(Qiagen，编号74101)萃取RNA。藉由使用扩增级去氧核糖核酸酶I (Invitrogen，编号18068-015)来去除残余DNA。使用iscriptTM cDNA合成套组(BioRad，编号170-8890)根据制造商的方案将IygS RNA反转录成cDNA。使用PCR核心系统II (Promega,编号M7665)来扩增cDNA。d.葡萄糖耐受性测试在16小时空腹的后，向神智清醒的小鼠腹膜内注射D-葡萄糖(每公克体重2. 5mg)。在注射葡萄糖的前(时间O)及注射后10分钟、20分钟、30分钟、60分钟、120分钟及150分钟自尾静脉收集血液。使用血糖计(Contour, Bayer)测定血糖。e.西方墨点分析免疫沉淀为进行IR、IRSl及IRS2的免疫沉淀，将组织样品在含有50mM HEPES(pH7. 4)、2mM原钒酸钠、IOmM氟化钠、2mM EDTA、1%NP_40、0. 25%去氧胆酸钠及蛋白酶抑制剂的缓冲液中均质化。随后用3μ g —级抗体对匀浆(250 μ g)进行免疫沉淀。样品使用4-20%梯度凝胶进行SDS-PAGE并转移至PVDF膜。用抗磷酸抗体对该等膜进行免疫墨点法。使用针对磷酸化-tyr-1322-1r-β (Millipore,编号 04-300)及总 IR-β 受体(Millipore,编号 05-1104)、总 IRSl (Santacruz,编号 Sc-559)及 pIRSl-(tyr_989) (Santacruz,编号Sc-17200)、pIRSl-(ser307) (Cell signaling，编号 2381 )、IRS2 (Milipore，编号 06-506)及 P-1RS2 (tyr-612) (Santacruz,编号 Sc-17195-R)的抗体。西方墨点法藉由二辛可宁酸(bicinchoninic acid)分析对蛋白质浓度进行定量且以相等量负载至4%-20% 或聚丙烯醢胺凝胶。随后将蛋白质转移至PVDF膜。将膜在含有3%BSA的PBS Tween-20中阻断且与分别识别总AKT (Cell signaling，编号4691 )、p-AKT(ser-473) (Cell signaling,编号 9271)、 Ras (Cell signaling,编号 3965)、Glutl (Abeam,编号 35826)、Glut4 (Abeam,编号 14683)、Glut2 (Santacruz,编号 9117)、葡萄糖 6-磷酸酶(Santacruz,编号 7291)、总 AMPK a (Cell signaling,编号 2603)、p-AMPK a (Thr-172) (Cell signaling,编号 2535)及瘦素(leptin)(Abcam,编号 2095)抗体的多株或单株抗体一起培育。在与辣根过氧化酶(horse reddish peroxidase)结合的二级抗体后，藉由增强型化学发光(enhanced chemiluminiscence)侦测信号。使用AlphaEaseFC分析器软件以扫描光密度测定法对特定频带进行定量且藉由针对GAPDH (Ambion，编号4300)丰度进行正规化来评估相等负载。分析脂联素的不同寡聚物形式用不含DTT、β -巯基乙醇的5Χ非还原缓冲液处理30yg自脂肪组织分离的蛋白质且在室温下培育I小时。样品在4%-20%Tris-甘胺酸SDS-PAGE凝胶上电泳且转移至PVDF膜。使用脂联素的抗球蛋白域抗体(Millipore，编号MAB3608, Temmecula, CA)进行西方墨点法。f.组织化学对3只小鼠(各来自Ad36、Ad2及仿真感染的进食高脂肪饲料的小鼠)及一只如所报导(41)作为对照的仿真感染的进食普通饲料的小鼠的急骤冷冻肝脏样品进行肝糖染色。将组织样品嵌入OCT固定介质中且以8 μ m厚度切片。使用过碘酸希夫氏染色(periodicacid-schiff stain ;PAS)对肝糖进行染色。在4°C下固定肝脏样品10分钟以提高肝糖保存且帮助防止人工产物流至卡诺依氏固定液(Carnoy’s fixative) (6份乙醇、3份氯仿及I份冰乙酸)。固定后，切片在蒸馏水中经由冲洗数次进行洗涤，且随后在室温下在1%过碘酸溶液中培育5分钟。在用蒸馏水洗涤后，添加希夫氏试剂(Schiff' s reagent)且培育11分钟。所有载玻片在冷的流动自来水中冲洗10分钟。将载玻片风干且使用permount施加盖玻片。肝糖染色使切片呈洋红色，其中较深的染色指示较多肝糖。在固定期间脂质离开样品，且因此载玻片上的白色空白区域指示脂质小滴(96)。用Zeiss Axioskop 40FL产生影像。使用影像J来分析每份样品的三份试样及每份试样的三个影像以便定量肝糖及脂质。将影像转换成8位，且仅可见肝糖特异性染色时确定临限值，且在此临限值下肝糖的量计算为像素2。自总面积中减去此数值以获得空白空间的面积，从而定量脂质，如所报导(96)。实施例1Ad36 及人类针对Ad36抗体作为既往感染的指示筛选来自四个群组的血清样品。该等群组为A) HERITAGE家庭研究(49) (n=671，白人及黑人男性及女性);B) PBRC (彭宁顿生物医学研究中心(Pennington Biomedical Research Center))研究(206名白人及黑人男性及女性)；C)MET研究(50，51) (n=45，青春期前白人及黑人男孩及女孩)；D)VIVA LA家族研究(52)(585名西班牙男孩及女孩)。Ad36抗体的出现率在HERITAGE、PBRC、MET及Viva La家族研究中分别为13%、18%、22%及7%。较佳血糖控制的各种指针(包括胰岛素敏感性或素因指数)与此等群组中的Ad36感染显著相关，而与年龄、性别、种族及肥胖无关(例如表I及表2展示PBRC及MET群组)。重要的是，Ad36与较佳血糖控制的关联在超过1，500名个体的不同年龄组及种族的此等群组中显著一致。此等资料表明Ad36感染可改善人类的血糖控制。
权利要求
1.一种治疗或预防个体的非酒精性脂肪肝疾病的症状的方法，所述方法包含向所述患者给药治疗有效量的腺病毒-36E4orf蛋白或其功能变异体，或编码腺病毒_36E4orfl或其功能变异体的核酸，或腺病毒_36E4orf的类似物，其中所述患者的症状在所述给药后改
2.根据权利要求第I项所述的方法，其中给药腺病毒-36E4orfl蛋白，且所述腺病毒-36E4orfl蛋白的胺基酸序列为SEQ ID NO:2或其功能变异体。
3.根据权利要求第I项所述的方法，其中藉由将编码所述腺病毒-36E4orfl蛋白的核酸序列以允许所述腺病毒-36E4orfl蛋白表现的方式引入所述哺乳动物体内来给药编码腺病毒_36E4orfl蛋白的核酸。
4.根据权利要求第3项的方法，其中藉由选自由以下者所组成的群组的方法引入所述核酸序列电穿孔、DEAE聚葡萄糖转染、磷酸钙转染、阳离子性脂质体融合、原生质体融合、产生活体内电场、经DNA涂布的微弹轰击、注射重组复制缺陷型病毒、同源重组、活体内基因疗法、活体外基因疗法、病毒载体及裸DNA转移。
5.根据权利要求第3项的方法，其中所述核酸序列包含SEQID NO:1或其功能变异体。
6.根据权利要求第I项的方法，其中所述个体为人类。
7.一种减少个体的肝脏中的过多脂肪的方法，所述方法包含向所述患者给药治疗有效量的腺病毒-36E4orfl蛋白或其功能变异体，其中所述肝脏中的所述脂肪在所述给药后减少。
8.根据权利要求第7项的方法，其中所述腺病毒_36E4orf7蛋白的胺基酸序列为SEQID NO:2或其功能变异体。
9.根据权利要求第7项的方法，其中藉由将编码所述腺病毒-36E4orf7蛋白的核酸序列以允许所述腺病毒-36E4orf7蛋白表现的方式引入所述哺乳动物体内来给药所述腺病毒-36E4orf7 蛋白。
10.根据权利要求第9项的方法，其中藉由选自由以下者所组成的群组的方法引入所述核酸序列电穿孔、DEAE聚葡萄糖转染、磷酸钙转染、阳离子性脂质体融合、原生质体融合、产生活体内电场、经DNA涂布的微弹轰击、注射重组复制缺陷型病毒、同源重组、活体内基因疗法、活体外基因疗法、病毒载体及裸DNA转移。
11.根据权利要求第9项的方法，其中所述核酸序列包含SEQID NO:1或其功能变异体。
12.根据权利要求第7项的方法，其中所述个体为人类。
13.一种改善个体的血糖控制的方法，所述方法包含向所述患者给药治疗有效量的Ad36E4orfl蛋白或其功能变异体，其中胰岛素敏感性在所述给药后增加。
14.根据权利要求第13项的方法，其中给药腺病毒_36E4orfl蛋白且所述腺病毒-36E4orfl蛋白的胺基酸序列为SEQ ID NO:2或其功能变异体。
15.根据权利要求第13项的方法，其中藉由将编码所述腺病毒-36E4orfl蛋白的核酸序列以允许所述腺病毒-36E4orfl蛋白表现的方式引入所述哺乳动物体内 来给药编码腺病毒_36E4orfl蛋白的核酸。
16.根据权利要求第15项的方法，其中藉由选自由以下者所组成的群组的方法引入所述核酸序列电穿孔、DEAE聚葡萄糖转染、磷酸钙转染、阳离子性脂质体融合、原生质体融合、产生活体内电场、经DNA涂布的微弹轰击、注射重组复制缺陷型病毒、同源重组、活体内基因疗法、活体外基因疗法、病毒载体及裸DNA转移。
17.根据权利要求第15项的方法，其中所述核酸序列包含SEQID NO:1或其功能变异体。
18.根据权利要求第13项的方法，其中所述个体为人类。
19.一种治疗或预防特征在于脂肪肝及胰岛素抗性的肝脏功能障碍的方法，所述方法包含向所述患者给药治疗有效量的Ad36E4orfl蛋白或其功能变异体，其中肝脏脂肪积聚在所述给药后得到改善。
20.根据权利要求第19项的方法，其中所述肝脏脂肪积聚改善的特征在于脂质氧化增加或脂质自肝脏的转运增加。
21.根据权利要求第19项的方法，其中给药腺病毒_36E4orfl蛋白且所述腺病毒-36E4orfl蛋白的胺基酸序列为SEQ ID NO:2或其功能变异体。
22.根据权利要求第19项的方法，其中藉由将编码所述腺病毒-36E4orfl蛋白的核酸序列以允许所述腺病毒-36E4orfl蛋白表现的方式引入所述哺乳动物体内 来给药编码腺病毒_36E4orfl蛋白的核酸。
23.根据权利要求第22项的方法，其中藉由选自由以下者所组成的群组的方法引入所述核酸序列电穿孔、DEAE聚葡萄糖转染、磷酸钙转染、阳离子性脂质体融合、原生质体融合、产生活体内电场、经DNA涂布的微弹轰击、注射重组复制缺陷型病毒、同源重组、活体内基因疗法、活体外基因疗法、病毒载体及裸DNA转移。
24.根据权利要求第22项的方法，其中所述核酸序列包含SEQID NO:1或其功能变异体。
25.根据权利要求第19项的方法，其中所述个体为人类。
26.一种减少或预防非酒精性脂肪肝炎(NASH)的方法，所述方法包含向所述患者给药治疗有效量的Ad36E4orfl蛋白或其功能变异体，其中NASH的发生减少或得到预防。
27.根据权利要求第26项的方法，其中所述个体的由肝功能障碍引起的高血糖症减少。
28.根据权利要求第26项的方法，其中给药腺病毒_36E4orfl蛋白且所述腺病毒-36E4orfl蛋白的胺基酸序列为SEQ ID NO:2或其功能变异体。
29.根据权利要求第26项的方法，其中藉由将编码所述腺病毒_36E4orfl蛋白的核酸序列以允许所述腺病毒-36E4orfl蛋白表现的方式引入所述哺乳动物体内 来给药编码腺病毒_36E4orfI蛋白的核酸。
30.根据权利要求第28项的方法，其中藉由选自由以下者所组成的群组的方法引入所述核酸序列电穿孔、DEAE聚葡萄糖转染、磷酸钙转染、阳离子性脂质体融合、原生质体融合、产生活体内电场、经DNA涂布的微弹轰击、注射重组复制缺陷型病毒、同源重组、活体内基因疗法、活体外基因疗法、病毒载体及裸DNA转移。
31.根据权利要求第28项的方法，其中所述核酸序列包含SEQID NO:1或其功能变异体。
32.根据权利要求第26项的方法，其中所述个体为人类。
全文摘要
本发明大体系关于治疗或预防非酒精性脂肪肝疾病的症状的方法、减少肝脏中过多脂肪的方法、改善血糖控制的方法、及治疗或预防肝脏功能障碍的方法，其包含给药治疗有效量的腺病毒36 E4orf1蛋白或其功能变异体。
文档编号A61P3/08GK103052397SQ201180033866
公开日2013年4月17日 申请日期2011年7月8日 优先权日2010年7月8日
发明者N·杜源德哈 申请人:路易斯安那州立大学及农业和机械学院监事会