专利名称：祖先丝氨酸蛋白酶凝血级联在早期免疫防御中发挥新功能的制作方法
技术领域：
本发明涉及凝血因子XIII (FXIII)，其用于治疗和/或预防由微生物的感染和/或与所述感染相关的症状；药物组合物，其包含药学有效量的所述FXIII ;用于制备药物的方法，所述药物包含药学有效量的所述FXIII ;和治疗方法，其包括向有此需要的患者施用药学有效量的所述FXIII。在本说明书中提及了许多文献，包括专利申请和制造商的手册。这些文献的公开，当不认为对本发明的可专利性有重大关系时，以其整体作为参考而与本文合并。更特别地，所有参考文献以同等程度作为参考而合并，就如同是特别地和单个地指出每单个文献作为参考而合并。
背景技术：
丝氨酸蛋白酶级联在许多病理生理学过程，包括止血、免疫应答和伤口愈合中发挥着重要的作用(关于综述，参见Page和Di Cera, 2008)0它们的激活通常通过受限的蛋白水解而发生，并且凝血和补体可能是人中表征最好的丝氨酸蛋白酶级联。系统发生研究显示，两个系统已发展了 4亿多年了(Davidson等人，2003 ;Nonaka和Kimura, 2006)并且已提出它们从真核生物中的共同祖先起源共进化而来(Krem和Di Cera，2002)。值得注意的是，凝血级联和补体级联与调节例如果蝇(Drosophila)腹背极性(导致Spiitzle, Toll受体的配体的激活)和马蹄蟹血淋巴凝结系统的其他丝氨酸蛋白酶级联享有显著程度的趋同进化(Krem和Di Cera, 2002)。这些发现暗示，早在原口动物和后口动物的分岔之前，就存在某些蛋白水解级联的基本基序(Krem和Di Cera, 2001)。应当注意的是,后两个系统(Spaetzle和马蹄蟹血淋巴凝结系统的激活)是祖先免疫中的关键组分，其在很大程度上，如果不是全部地，依赖于先天免疫系统。认为补体系统是先天免疫系统的一部分已有30多年，但只是最近才领会到凝血也参与早期免疫防御(关于综述，参见Delvaeye和Conway, 2009)。在后续的研究中，主要焦点已集中在凝结级联触发促炎症反应和抗炎症反应，例如细胞因子的释放和蛋白酶激活受体(PAR)的激活的能力上。然而，关于凝血在什么程度上可以积极地贡献于入侵微生物的消灭，还知道得很少。与本发明相关联地，调查了是否凝血系统产生抗微生物活性。特别将焦点放在了因子XIII (FXIII)的作用上，最近发现它的昆虫同源物(转谷氨酰胺酶)在果蝇感染模型中在对抗细菌病原体的免疫应答中发挥保护作用(Wang等人，2010)。在本发明中，采用了化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes),因为该细菌被认为是最重要的人细菌病原体之一，对每年至少1800万例世界范围的严重感染(每年178万新病例)和50多万例死亡负有责任，如WHO所估计的(Carapetis等人，2005)。具有化脓性链球菌的感染一般是表浅的和自我限制性的，但它们也可能发展成严重的和威胁生命的情况，例如与高的发病率和死亡率相关的坏死性筋膜炎和链球菌中毒性休克综合征(STSS)(关于综述，参见Cunningham, 2000)。化脓性链 球菌可以在相同的感染模型中引起局部性和全身性感染的事实使它成为在本发明中要进行研究的理想病原体。而且，通过由增长数目的致病微生物株针对它们所发展的抗性致使许多迄今存在的抗微生物试剂无效。因此，存在对新的抗微生物试剂的强烈需求，理想地，所述新的抗微生物试剂依靠这样的新作用模式，其应当使致病微生物发展抗性和因此逃避控制和最终杀死变得更困难，如果不是不可能的话。从在体外实验中使用经标记的人工底物和标记物分子例如生物素尸胺(B-cad)的机制研究中知道转谷氨酰胺酶或FXIII的活性，如分别存在于正常果蝇血淋巴或人血浆中的，导致血淋巴或血凝块基质中细菌大肠杆菌(E.coli)或金黄色葡萄球菌(S.aureus)的隔绝(Wang等人，2010)。然而，尚未证明可以以这种方式使细菌也在体内固定化。而且，如果通过简单的固定化可以防止入侵一种生物的微生物在那个宿主生物的整个身体内的全身性扩散，已是特别有益的。最后，仍希望的也是最终取得感染宿主生物中微生物的杀死。发明简述令人吃惊地，已发现在啮齿类动物例如小鼠中以及人组织两者中，在体内FXIII都引起在凝块的纤维蛋白网络中细菌的固定化和抗微生物活性的产生。令人吃惊地，还发现当向化脓性链球菌感染的活生物施用时，FXIII诱导这些细菌在纤维蛋白凝块内的固定化，结合有产生自血浆的抗微生物活性的诱导，其导致通过裂解的最终杀死。令人吃惊地，还发现人FXIII的应用防止细菌从感染位点向器官例如肝脏和脾以及进入血流的全身性传播。以前，当试图避开通常能够通过微生物的链激酶(SK)活性溶解血凝块或者能够影响纤溶酶原激活为纤溶酶并因此纤维蛋白溶解的微生物时，用这种作用方式实现已看起来是相当不可能的了。这是因为，知道化脓性链球菌携带链激酶(Kayser, F.H.等人(1989).Medizinische Mikrobiologie:1mmunologie, Bakteriologie, Mykologie, Virologie, Parasitologie,第7版，Thieme, Stuttgart, 143)，其与纤溶酶原形成复合物。所述复合物反过来诱导纤溶酶原转变为纤溶酶，一种影响纤维蛋白切割(纤维蛋白溶解)的内肽酶(Pschyrembel Klinisches WorterblICh (2007).第 261 版，Walter de Gruyter GmbH& C0.KG, Berlin, 602，1505 和 1846)。此外，化脓性链球菌携带一种细胞壁粘附的蛋白质名叫G蛋白相关的Ci2-巨球蛋白结合蛋白(GRAB)，如其名称所暗示的，其与α2-巨球蛋白结合(α2-Μ)(其是一种人蛋白酶抑制剂)结合。已提出α2-Μ被GRAB的结合和因此至细菌表面的结合以两种方式促进通过化脓性链球菌(A族链球菌或GAS)的感染:α 2-Μ的去除降低其抑制活性，由此为细菌通过被入侵宿主的组织的更有效扩散保持了一定水平的蛋白酶活性，而细菌本身仍针对蛋白酶受到保护，因为这时它直接在其表面上携带针对它们的抑制剂(Toppel等人，2003)。然而,应当注意的是,对此存在第三个方面:α 2_Μ是一个也调节纤维蛋白溶解的蛋白酶抑制剂，因为它作为抑制剂对纤溶酶原激活为纤溶酶的步骤起作用(Pschyrembel Klinisches Wortcrbuch (2007).第 261 版，Walter de Gruyter GmbH& C0.KG，Berlin, 602)。当细菌表面蛋白例如GRAB与α 2-M结合并以此降低其血浆浓度时，α 2-Μ对纤溶酶原激活的抑制活性也被降低以至于纤维蛋白溶解将增加。
因此，原则上，化脓性链球菌能够以两种方式干扰纤维蛋白溶解控制机制，即直接通过纤溶酶原激活和间接通过降低纤溶酶原抑制来增强纤维蛋白溶解。因此，已期望化脓性链球菌倾向于逃避俘获在纤维蛋白凝块之中和因此固定化。本发明因此提供(I)凝血因子XIII (FXIII)，用于治疗和/或预防由微生物的感染和/或与所述感染相关的症状；(2)药物组合物，其包含药学有效量的如在(I)下所定义的FXIII以及一种或多种选自下列的物质:人白蛋白、葡萄糖、氯化钠、水和用于调节PH的HCl或NaOH，用于治疗和/或预防由微生物的感染和/或与所述感染相关的症状；(3)用于制造药物的方法，所述药物包含药学有效量的FXIII或如在(2)下所定义的药物组合物，用于治疗和/或预防由微生物的感染和/或与所述感染相关的症状；和(4)治疗方法，其包括向有此需要的患者施用药学有效量的FXIII或如在(2)下所定义的药物组合物，用于治疗和/或预防由微生物的感染和/或与所述感染相关的症状。发明详述在系统发生上保守的丝氨酸蛋白酶级联在无脊椎动物和脊椎动物免疫中发挥着重要的作用。哺乳动物凝血系统可以追溯到大约4亿年前并且它与参与例如昆虫中的Toll受体信号传导和在血淋巴凝结期间抗微生物肽的释放的祖先丝氨酸蛋白酶级联享有同源性。本发明显示细菌引起的凝血诱导导致凝块内微生物的固定化和抗微生物活性的产生。这样，祖先丝氨酸蛋白酶凝血级联在早期免疫防御中产生了新的功能。俘获经由通过因子XIII (FXIII)，一种进化上保守的转谷氨酰胺酶的作用使细菌与纤维蛋白纤维交联而介导。被感染的FXIII+小鼠显示严重的病理学炎症征兆，而用FXIII处理野生型动物抑制了细菌的传播。也在来自具有链球菌坏死性筋膜炎的患者的组织活组织检查中监测了细菌的杀死和与纤维蛋白网络的交联， 支持了凝血是早期先天免疫系统的一部分这样的概念。本发明因此证明了，-凝血的诱导产生细菌固定化和抗微生物活性-因子XIII+的小鼠比野生型动物发展更严重的感染-在被感染的患者的活组织检查中记录到细菌俘获和杀死，和-用FXIII的处理防止感染小鼠中的细菌传播。感知炎症和入侵微生物的快速消除是对感染的早期免疫应答的关键特征。特别地，潜在的微生物进入的部分处于很大的危险中并因此它们需要特别的保护。因此，免疫系统已发展了允许有效清除例如吸入的(例如借助于甘露糖结合凝集素(Eisen，2010 或吞入的(例如通过肠粘蛋白的作用(Dharmani等人，2009))的病原体的机制。伤口具有进入的另一部分并且它们带有促进允许微生物进入循环系统的感染的很大危险。为了防止它们的传播和可能的全身性并发症，非常重要的是，伤口愈合一开始宿主的防御系统就被激活。因此看起来很可能凝血在这些非常早期的过程中发挥着重要的作用。然而，对于免疫的该贡献的程度和背后的机制理解得还很少。在本文中，首次显示，除了其促炎症作用外，凝血还在微生物感染的遏制和消除中发挥着积极的作用。为本发明所获得的数据支持基于两个独立的机制的模型，涉及纤维蛋白网络内微生物的FXIII触发的共价固定化和抗微生物活性的产生。发现凝结通过固有凝血途径(也被称为接触系统或激肽释放酶/激肽系统)在细菌表面被激活。除了细菌(关于综述参见(Frick等人，2007))外，真菌(Rapala-Kozik等人，2008)和病毒(Gershom等人，2010)也被报道与接触系统相互作用，从而支持接触激活服从模式识别原理的观念(Opal和Esmon，2003)。值得注意的是，该系统在数秒内被激活并导致抗微生物肽(Frick等人，2006 ；Nordahl等人，2005)和炎症介质(关于综述参见(Leeb-Lundberg等人，2005))的释放，进一步支持了其在早期先天性免疫中的作用。除了产生归因于固有凝血途径激活的抗微生物肽外，最近还已显示凝血酶的加工释放具有广泛特异性的宿主防御肽(Papareddy等人，2010)。然而，这些肽贡献于在本发明中所见的抗微生物活性的程度还需要澄清。用本发明所给出的体内数据显示，FXIII的缺乏引起通过大量中性粒细胞流向感染位点而说明的病理学炎症反应和如在被感染小鼠中所见的随后的组织破坏。不能使细菌固定化导致在这些动物中固有驱使的凝结时间的剧烈增加，其是感染在敲除小鼠中比在野生型小鼠中更为全身性的标志。人血浆FXIII在小鼠中是完全有活性的(Lauer等人，2002)并且作为人蛋白质施用于小鼠感染模型中的概念的证明。当用人血浆FXIII处理野生型小鼠时，记录到相比于未经处理的小鼠而言，细菌传播显著地降低。这些结果强调FXIII在针对入侵病原体的早期防御中的重要性并且它们暗示FXIII是发展新的抗微生物疗法的令人感兴趣的靶标。 以前已将凝结与无脊椎动物模型的免疫相联系，其中由于缺乏具有适应性效应子机制的丰余性，它的免疫功能是更可见的。最好地被研究的例子之一为马蹄蟹的凝结系统，其由微小量的细菌激发子例如LPS触发，导致抗微生物活性的产生并与其他效应子系统相沟通。类似地，在补体和血液凝结系统之间也可以有“交叉对话”，例如通过纤维胶凝蛋白(ficolin)与纤维蛋白/纤维蛋白原的结合(Endo等人，2009)。从进化比较而显现的图画是，蛋白水解级联和其组成蛋白酶被用作灵活的模块，其可以被内源的以及外源的微生物激发子触发(Bidla等人，2009)。甚至一个和相同的蛋白水解事件可以在不同的背景下被不同的激发子激活。这样的一个例子是果蝇蛋白质Spaetzle的切割，其可以作为在发育期间和在免疫系统中的关键信号起作用。在两种情况下，经切割的Spaetzle与Toll (TLR家族的创建成员)结合。类似地，本文显示血液凝集(其迄今为止大部分在其生理止血功能的背景下被研究)既以效应子机制也通过与免疫系统的其他分支相沟通而在免疫中发挥着关键的作用。这导致快速和有效的即时免疫保护，其保持感染局部化并为待激活的其他效应子机制留出了额外的时间。如由本发明所使用的那样，因子XIII或凝血因子XIII (FXIII)是在血液凝集的最后阶段中使纤维蛋白凝块稳定化的血浆转谷氨酰胺酶。经凝血酶激活的FXIII催化相邻的纤维蛋白单体的Y-谷氨酰基和ε-赖氨酰基残基之间的共价交联物的形成以产生成熟的凝块。FXIII以由2个A-亚基和2个B-亚基组成的异源四聚体在血浆中循环。A-亚基包含酶的活性位点并且其由肝细胞、单核细胞和巨核细胞合成。B-亚基作为血浆中催化性A-亚基的运载体并且由肝脏合成。FXIII A-亚基基因属于转谷氨酰胺酶家族，其包括至少8个组织转谷氨酰胺酶。这些酶使各种不同的蛋白质交联并参与许多生理学和病理学过程，例如止血、伤口愈合、肿瘤生长、皮肤形成和凋亡。与组织转谷氨酰胺酶相似，FXIII参与组织改型和伤口愈合，如可以从在具有遗传性FXIII缺陷的患者中观察到的伤口修复中的缺陷所推断的。FXIII也参与正常怀孕期间胚胎的植入；FXIII缺陷纯合的妇女经历反复的流产。
根据本发明的FXIII的一个来源是FXIII浓缩物，例如Fibrogammin P250/1250(CSL Behring)。FXIII的浓缩物可以是冻干的FXIII，例如粉剂或溶解在水中的FXIII冻干物。FXIII通常从人血浆中分离，但也可以以通过使用本领域中已知的重组DNA技术以重组蛋白质提供。通常，根据本发明的FXIII可以从血浆、胎盘或通过基因工程的方法(重组的或转基因的)来制备。与其目标是为遭受先天性或获得性FXIII缺陷的个体取得正常的、健康的FXIII血浆水平的仅FXIII替代疗法相对比，根据本发明采用FXIII以便治疗和/或预防由微生物的感染，即以抗生素或抗生素活性的诱导物的方式。为此，向患者施用FXIII以便该患者血液血浆中的FXIII浓度增加在健康个体血液血浆中的FXIII浓度之上，即可以向没有遭受先天性或获得性FXIII缺陷的患者施用FXIII。然而，可以由于两个原因或适应症施用根据本发明的FXIII，即为了治疗先天性或获得性FXIII缺陷和同时为了治疗或预防微生物感染；在此类情况下所施用的FXIII总剂量不得不高于在仅单个适应症的情况下。可以向患者全身性地或局部地施用FXIII，优选的是在感染位点的局部施用，如果可以识别该位点的话，以便更有效地和快速地控制和/或完全防止从感染位点的扩散。施用通常通过注射来完成，在全身性应用的情况下，静脉内注射通常是优选的。FXIII的其他施用途径可以是动脉内的、皮下的、肌内的、真皮内的、腹膜内的、皮内的、腰内的或鞘内的。用于根据本发明的FXIII的施用的局部剂量方案需要这样的施用:5-1000国际单位(IU)的FXII I/kg体重，优选地5-500IU的FXII I/kg体重，更优选地5-300IU的FXIII/kg体重，还更优选地5-250IU的FXIII/kg体重，还是更加优选地10-200IU的FXIII/kg体重。优选地，每天施用FXIII—次或多达三次。
FXIII施用具有例如抑制患者体内微生物的全身性传播、固定和/或杀死患者体内微生物的效应。被本发明作为靶标的微生物可以是具有相对高的毒力的，因为它们能够支持或增强纤维蛋白溶解，能够激活纤溶酶原和/或具有下列的激活纤溶酶原的蛋白质:链激酶(溶血性链球菌)、葡萄球菌激酶(金黄色葡萄球菌)、Pla蛋白(鼠疫耶尔森氏菌(Yersinia pestis))、纤维蛋白溶酶、激活纤维蛋白溶解的化合物或例如来自物种伯疏氏螺旋体(Borrelia burgdorferi)、大肠杆菌(Escherichia coli)、具核梭杆菌(Fusobacterium nucleatum)、幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)、发酵支原体(Mycoplasma fermentans)、淋病奈瑟菌(Neisseria gonorrhoeae)、脑膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitidis)、铜绿色假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、肠炎沙门氏菌(Salmonella enteritidis)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)的其他细菌蛋白质。此外或备选地，所述微生物能够通过携带至少一个表面和/或细胞壁蛋白质来支持或增强纤维蛋白溶解，所述表面和/或细胞壁蛋白质能够降低至少一种纤溶酶原激活的抑制剂的血浆浓度，所述蛋白质优选地选自GRAB蛋白(化脓性链球菌)、溶金菌素(金黄色葡萄球菌)、炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)的分泌型中性金属蛋白酶和微小消化链球菌(Peptostreptococcus micros)的分泌型蛋白酶。根据本发明的微生物可以选自细菌、酵母、病毒和多细胞寄生虫。优选地，所述微生物是具有坚固的细胞壁和/或是革兰氏阳性的细菌，更优选地，是好氧和兼性厌氧球杆菌家族的细菌，还更优选地，是链球菌科，还是更优选地，是β -溶血性链球菌，最优选地，所述微生物是化脓性链球菌。感染类型可以选自一种或多种组织:皮肤、呼吸系统、咽喉、肺、脾、肝脏、肾、心血管系统、心脏、中枢神经系统、消化系统、生殖泌尿系统、肌肉和软组织。然而，也可以成功地治疗患者身体的全身性感染。与感染相关的症状是伴随由本发明所靶向的微生物感染的典型症状，例如炎症、头痛、发烧、腹泻、疼痛、意识丧失或它们中的一个或多个的组合。药物组合物包含药学有效量的本发明的FXIII和一种或多种选自人白蛋白、葡萄糖、氯化钠、水和用于调节pH的HCl或NaOH的物质。药物组合物的优选的pH在7.0至7.6之间，更优选地在7.2至7.4之间。药物组合物可以进一步包含本领域中通常已知的药物运载体、赋形剂和助剂。根据本发明的药学有效量是这样的FXII1、其浓缩物或药物组合物的量，其确保在患者血液血浆中的起始FXIII浓度高至其正常水平的10倍，优选地高至其正常水平的5倍。另一方面，患者血液血浆中的FXIII的起始浓度至少为正常FXIII活性的250%。·
一些缩写的意义CFU:集落生成单位0D:光密度0D405:在405nm的波长下测得的光密度图1:细菌表面上接触系统和FXIII的激活(A)将在含有50μΜ ZnClJ^Tris中的API细菌与人的正常的、PK缺陷的或FXIII缺陷的血浆温育30分钟。然后洗涤细菌并重悬在底物溶液中以测量化脓性链球菌表面上的血浆激肽释放酶活性。(B)将在含有50 μ M ZnCl2的Tris中的化脓性链球菌与正常的、凝血酶缺陷的、FXII缺陷的和FXIII缺陷的血浆在CaCl2和磷脂存在下温育30分钟。洗涤细菌并重悬在底物溶液中以测量凝血酶活性。两个图均表示三个独立实验的平均值土SD。(C)将APl细菌在柠檬酸钠单独、正常血浆、FXII缺陷的或FXIII缺陷的(在柠檬酸钠中稀释1/100的血浆)中在ZnCl2XaCl2、磷脂和金标记的针对N- ε - Y -谷氨酰基-赖氨酸抗体存在下温育15分钟并之后通过负染电子显微术进行分析。尺度棒表示lOOnm。图2:凝血酶激活的血浆代替抗微生物活性(A)将APl细菌与凝血酶激活的正常血浆或FXIII缺陷的血浆(1/100稀释的)进行温育。在所指示的时间点后，通过将系列稀释物铺板在血琼脂上来测定细菌数目。与未经激活的正常血浆或FXIII缺陷的血浆温育的细菌作为对照。该图表示三个独立实验的平均值土 SD。(B)将API细菌与正常血浆(左边的图版)、凝血酶激活的正常血浆(中间的图版)或凝血酶激活的FXIII缺陷的血浆(右边的图版)进行温育，如在实验步骤中所描述的那样，并使经历通过负染电子显微术的分析。尺度棒指示I μ m。
(C)将API细菌与正常的或FXII1-缺陷的血浆进行温育并通过添加凝血酶来起始凝结。显示了在于37°C下Ih之前(上面的图版)和之后(下面的图版)的制成薄切片的凝块。在温育后的两个样品中检测到相似量的死细菌。尺度棒指示I μ In。图3:凝块内化脓性链球菌的俘获和固定化扫描电子显微照片显示在细菌缺乏(A，B)或存在(C-F)下从正常血浆(A，C，E)或FXIII缺陷的血浆(B，D, F)产生的凝块的结构。尺度棒分别在A-D中表示10 μ m和在E-F中表示I μ m。透射电子显微照片描绘了化脓性链球菌单独(G)、在暴露于凝血酶激活的血浆后(H)和在暴露于血浆后接着用识别FXIII交联位点的金标记的N- ε - Y-谷氨酰基-赖氨酸抗体免疫染色(J)的化脓性链球菌。尺度棒分别在G和H中相应I μ m，和在J中相应IOOnm0图4:FXIII使链球菌Ml蛋白与纤维蛋白原交联，导致凝块内细菌的固定化⑷电子显微照片显示在FXIII交联前(上面的图版)和后(中间的图版)与rMl-蛋白(延长的)复合的经负染的人纤维蛋白原(以三个结构域为特征)。通过用金标记的针对N- ε -Y-谷氨酰基-赖氨酸的抗体使纤维蛋白原Ml蛋白复合物免疫染色来检测交联(下面的图版)。包括了纤维蛋白原(灰色)和Ml蛋白(黑色)的示意绘图以突出纤维蛋白原与Ml蛋白之间的相互作用。尺度棒表示25nm。(B)将细菌与正常的或FXIII缺陷的血浆进行温育并且通过添加凝血酶来起始凝结。简短地洗涤凝块，用THB培养基覆盖并在37°C下进一步温育。在所指示的时间点后，通过将经系列稀释的上清液铺板在血琼脂上来测定细菌数目。该图表示三个独立实验的平均值土 SD图5:用化脓性链球菌皮下感染野生型和FXIII+小鼠显示了来自未经感染的(A，B)和感染的(24小时；C，D)野生型(A, C)和FXIII+(B，D)小鼠的苏木精/伊红染色的代表性组织切片。尺度棒表示500 μ m。扫描电子显微照片描绘了来自野生型(E)和FXIIli(F)小鼠的活组织检查。尺度棒相应于10 μ m并且在插入图中相应于I μ m。(G)在来自未经感染的和经感染的野生型和FXIII+小鼠(感染后24小时)的血浆中测量的激活的部分促凝血酶原激酶时间(aPTT)。数据以从三个独立实验获得的、从3或5只未经感染的和9只感染的动物获得的血浆样品的平均值土 SD值给出。图6:人活组织检查的免疫组织化学分析组织活组织检查从具有由化脓性链球菌引起的坏死性筋膜炎的患者(上面的图版)和健康志愿者(下面的图版)获得。将活组织检查制成切片并就链球菌Ml蛋白、FXIII和N- ε - Y-谷氨酰基-赖氨酸进行免疫组织化学染色。没有第一抗体的染色为阴性(数据未显不)。尺度棒相应于50 μ m。图7:M1蛋白和FXIII交联的共定位和经FXIII处理的小鼠中的细菌传播(A)将来自具有链球菌坏死性筋膜炎的患者的组织活组织检查制成切片并联合抗N- ε - y -谷氨酰基-赖氨酸(红色)对Ml蛋白(绿色)进行免疫荧光染色。细胞核用DAPI染成蓝色。尺度棒指示10 μ m。(B)扫描电子显微照片显示在来自具有链球菌坏死性筋膜炎的患者的活组织检查中俘获在纤维蛋白网络中的细菌。 尺度棒指示5 μ m。
(C)透射电子显微照片展示了通过金标记的针对N- ε - Y-谷氨酰基-赖氨酸的抗体检测的FXIII介导的细菌表面蛋白质与纤维蛋白网络的交联。尺度棒指示lOOnm。(D)透射电子显微照片显示在来自具有链球菌坏死性筋膜炎的患者的活组织检查中纤维蛋白凝块内的死细菌。尺度棒指示0.5 μ m。(E)使小鼠接受用化脓性链球菌的皮下注射并在感染后3小时用Fibroganiinin P处理小鼠。未经处理的小鼠作为对照。感染24小时后，处死小鼠并测定血液、肝脏和脾中细菌载量。数据以每组 ο只小鼠并从三个独立实验获得的平均值给出。图8:在从小鼠血浆产生的凝块中化脓性链球菌KTL3的FXI11依赖性俘获扫描电子显微照片展示了在从小鼠血浆产生的凝块中化脓性链球菌的FXIII依赖性俘获。将从野生型(A，C)和FXIII+小鼠(B，D)获得的血浆在2xl09CFU化脓性链球菌菌株KTL3不存在或存在下进行温育并通过添加凝血酶来起始凝结。与用人血浆的结果相似，大量的化脓性链球菌被捕获在从野生型(正常)血浆(C)产生的凝块内，而在FXIII缺陷的凝块(D)中只发现几个细菌。对细菌的靠近观察揭示化脓性链球菌的表面与野生型中的纤维蛋白网络的强的相互作用，而在缺乏FXIII的凝块中则没有(C和D中的插入图)。尺度棒分别表示10 μ m和在插入图中Ιμ 。图9:在感染的野生型和FXIII+小鼠中的细菌传播用化脓性链球菌菌株KTL3皮下感染野生型和FXIII+小鼠。接种后24小时，处死小鼠并测定血液、肝脏和脾中的细菌载量。数据以每组10只小鼠并从三个独立实验获得的平均值给出。实施例举例说明了本发明。一般步骤步骤1:细菌菌株和培养条件Ml血清型的化脓性链球菌菌株APl (40/58)最初来自世界卫生组织(WHO)链球菌参考与研究合作中心(Prague, Czech Republic) 化脓性链球菌菌株KTL3 (Ml血清型)起初分离自具有链球菌菌血症的患者的血液(Rasmussen等人，1999)。将储用培养物保持在-70°C并且在 37°C下在 Todd-Hewitt 肉汤(THB, Gibco;Grand Island, NY)中进行培养。在对数期中期收集细菌，用无菌PBS或Tris洗涤两次，稀释至所需要的接种物并通过在稀释和在血琼脂平板上铺板后计数集落生成单位(CFU)来测定存活细菌的数目。步骤2:人血浆从健康供者获得的血浆购买自隆德大学医院(Lund，Sweden)，激肽释放酶(PK)缺陷的、凝血酶缺陷的、FXII缺陷的血浆和从具有FXIII缺陷的患者获得的血浆(FXIII缺陷血楽3 购买自 George King Bio-Medicals Inc.(Overland Park, KS) 步骤3:底物试验如前面所描述的(O ehmcke等人，2009)，通过使用生色底物S-2302 (Chromogenix, Milan, Italy)来测量在暴露于正常的、PK缺陷的或FXIII缺陷的血浆后细菌表面上的血浆激肽释放酶活性。为了测量凝血酶活性，将正常的、凝血酶缺陷的、FXII缺陷的和FXIII缺陷的血浆与IxIOiciCFU化脓性链球菌在补充有50 μ M ZnCl2'2mMCaCl2 和 I μ M 磷脂(Rossix, Molndal, Sweden)的 50mMTris (ρΗ7.5)中进行培养。以1.5mg/ml 的最终浓度添加四妝 Gly-Pro-Arg-Pro (Bachem, Bubendorf, Switzerland)以避免凝结。将样品在37°C下培养30分钟，用Tris洗涤两次并将细胞沉淀重悬在包含50 μ MZnCl2和ImM生色底物S-2238 (Chromogenix)的Tris中，并在37°C下培养30分钟。在离心后，在405nm处测定上清液的吸光度。通过使用识别FXIII交联位点的小鼠抗人金标记的N-ε-Υ-谷氨酰基-赖氨酸[153-81D4]抗体(Gene Tex, Irvine, CA)来测定FXIII活性。使细菌如上面所描述的那样生长过夜并暴露于正常的、凝血酶缺陷的、FXII缺陷的或FXIII缺陷的血浆(均在柠檬酸钠中1/100进行稀释)并补充以50 μ M ZnCl2,2mM CaCl2和I μ M磷脂。将样品在金标记的抗体存在下在37°C下培养15分钟并用负染电子显微术进行分析。步骤4:人血浆中的细菌生长如上面所描述的培养细菌过夜。将人血浆和FXIII缺陷的血浆在12.9mM柠檬酸钠中1:100进行稀释并与500 μ I包含2.5x105CFU的化脓性链球菌溶液相混合。在于37°C进行培养前，添加0.2U人凝血酶(Sigma, St.Louis, MO)。在所指示的时间点将50 μ I的混合物以10倍系列稀释物铺板在血琼脂上，并通过在37°C下培养18小时后计数集落来测定细菌的数目。备选地，也使细菌经历负染电子显微术。步骤5:血浆凝块的产生如上面所描述的培养细菌过夜 。对于电子显微术分析，将50μ I人的或小鼠的血衆(正常的和FXIII缺陷的)在血凝度计(Amelung, Lemgo, Germany)中在37°C下温育60秒。添加2x109CFU在50 μ IPBS中的化脓性链球菌，接着进行60秒温育。然后通过添加100 μ I凝血酶试剂(Technoclone, Vienna, Austria)来起始凝结。通过在没有细菌存在下将凝血酶试剂添加至血浆来产生对照凝块。对于电子显微术分析，将凝块在0.15M包含2.5%的戊二醛的可卡酸盐缓冲液(pH7.2)中进行固定。步骤6:凝块中细菌的交联和固定化在柠檬酸钠中以300 μ g/ml的浓度制备从人血浆纯化中的纤维蛋白原(ICN Biomedicals, Aurora, 0H)并在凝血酶激活的人 FXIII(Enzyme ResearchLaboratories, South Bend, IN)不存在或存在下与lng/ml重组Ml蛋白在37°C下温育30分钟。对于随后的通过电子显微术的可视化，给予反应混合物以金标记的N- ε - Y-谷氨酰基-赖氨酸抗体(Gene Tex)。为了分析细菌的固定化，如上面所描述的那样从正常的和FXIII缺陷的血浆产生凝块，用PBS简短地洗涤并用TH培养基覆盖。在所指示的时间点后，将50 μ I上清液以10倍系列稀释物铺板在血琼脂上并通过在37°C下培养18小时后计数集落来测定细菌的数目步骤7:电子显微术对于场发射扫描电子显微术，将经固定的样品在可卡酸盐缓冲液中进行洗涤。将样品用分等级的乙醇系列进行脱水，用CO2进行临界点干燥并在于5kV加速电压下和以2000的放大率操作的JE0LJSM-350扫描电子显微镜(JEOL Ltd.，Tokyo, Japan)中进行检查前用金进行溅射镀膜。如前面所描述的那样(Bengtsson等人，2009)进行透射电子显微术分析和使用金标记的N- ε - Y -谷氨酰基-赖氨酸抗体的免疫染色。对于负染电子显微术，使样品吸附至400目镀碳铜网格上I分钟，用两滴水简短地洗涤并用两滴0.75%甲酸双氧铀进行染色。通过在空气中在低压下的辉光放电致使网格亲水。将样品在于60kV加速电压下操作的Jeoll200EX电子显微镜中进行观察。步骤8:动物感染模型CBA/CaOlaHsd 野生型小鼠购买自 Harlan(Venray, The Netherlands)而FXIII+小鼠由CSL Behring (Marburg, Germany)提供。小鼠饲养在特殊的无病原体动物设施中。所有实验动物均通过地区的动物实验伦理委员会，Malmo/Lunddjurforsoksetiska namnd, Lund District Court, Lund, Sweden 批准(许可证 M220/08)。在感染前，通过使用电动刮刀从小鼠背上的一个2cm2面积除去皮毛。如前面所描述的那样(Toppel等人，2003)用2.5x108CFU在100 μ I PBS中的化脓性链球菌KTL3皮下感染小鼠。感染24小时后，通过CO2吸入处死小鼠。通过宽的边缘切除法围绕注射位点采集皮肤样品并固定在3.7%甲醛中直至组织学检查。对于血浆分析，在处死的时间从心脏取得柠檬酸化的血液，在5000rpm下离心10分钟并在_80°C冷冻直至使用。为了测定细菌载量，将来自肝脏和脾的血液和组织匀浆以10倍系列稀释物铺板在血琼脂上。在于37°C培养18小时后，计数细菌集落。在一些实验中，在细菌接种3小时后，用200U/kg体重的人FXIII浓缩物(Fibrogammin'K_P,CSL Behring)在注射位点处皮下处理小鼠。步骤9:凝血参数的测量通过分别测量未经感染的和感染的野生型和FXIII+小鼠血浆中的激活的部分促凝血酶原激酶时间(aPTT)和凝血素(PT)来测定凝血的固有(接触激活)和外在途径的激活。为了测量 aPTT,将 50 μ I 高岭土 (Dapttin TC) (Technoclone, Vienna, Austria)与50 μ I小鼠血浆在37°C下温育I分钟。通过添加50ml的25mM CaCl2溶液来起始凝结。通过在37°C下温育50 μ I小鼠血衆I分钟接着添加50 μ I含有I丐以起始凝结的thrombomax试剂(Trinity Biotech, Lemgo, Germany)来测定 PT。步骤10:小鼠皮肤样 品的检查用2.5x108CFU在100 μ I PBS中的化脓性链球菌皮下感染小鼠，并在感染24小时后制备皮肤损伤。将组织样品在3.7%甲醛中进行固定，在乙醇中脱水并包埋于石蜡中，然后切成3 μ m厚的切片。在脱石蜡后，如上面所描述的那样制备用于扫描电子显微术的样品并用苏木精和伊红(Histolab, Gothenburg, Sweden)进行染色以便使用Eclipse80i显微镜(Nikon, Tokyo, Japan)来进行组织学分析。步骤11:人组织的活组织检查的检验从具有由MlTl血清型化脓性链球菌引起的坏死性筋膜炎的两名患者的感染中心区采集快速冷冻的组织活组织检查并与从健康志愿者取得的快速冷冻的钻取活组织检查进行比较。多伦多大学和卡罗林斯卡大学医院的人受试者评论委员会(The HumanSubjects Review Committee)批准了这些研究,并被告知了从患者和志愿者获得的同意。将活组织检查在低温恒温下切片至8 μ m，固定在2%新鲜制备的在PBS中的甲醛中。如前面所描述的那样(Mahnstriim等人，2009)进行免疫组织化学染色。根据前面所描述的(Thulin等人，2006)对Ml蛋白和N-ε - Y -谷氨酰基-赖氨酸进行免疫荧光染色。使用下面的抗体以预先测定的1:250-1:10000范围的最佳稀释进行上面所描述的免疫染色:抗 N-ε - Y -谷氨酰基-赖氨酸(Gene Tex)、抗因子 XIIIa(Acris, Herford, Germany)、特异于Lancefield A组碳水化合物的多克隆兔抗血清(Difco)以及针对Ml的多克隆兔抗血清。将免疫组织化学染色在具有25X/0.55NA油物镜的RXM Leica显微镜下进行评价(Leica, Wetzlar, Germany),同时使用与Leica DMR显微镜联合的Leica共聚焦扫描仪TCSSP II进行可视化。步骤12:统计学分析通过使用Excel2007 (Microsoft Off ice, Microsoft, Redmont, WA)或 Graph PadPrism5 (Graph Pad Software, San Diego, CA)来分析数据。实验组的值之间的显著性通过使用方差分析(t检验)来确定。显著性水平设置在P〈0.05处。实施例1:化脓性链球菌表面的接触激活导致FXI11的诱导以前的工作已显示血浆中化脓性链球菌的存在导致在细菌表面上接触系统的集合和激活(Herwald等人，2003)。这些实验在没有钙和磷脂(其是止血中的重要辅因子)存在下进行并且需要接触系统上游的凝血因子的激活(关于综述参见(Hoffman和Monroe, 2001))。发明者因此想知道钙和磷脂是否触发细菌表面上其余的凝结级联的诱导。为了证实以前的发现，发明者首先测量了在与正常的锌化(zincified)血浆培养时，APl细菌上血浆激肽释放酶活性。血浆激肽释放酶缺陷和FXIII缺陷的血浆作为这些实验中的对照。如在图1A中所描绘的，当将细菌与正常的和FXIII缺陷的血浆进行温育时，但不是当血浆缺乏血浆激肽释放酶时，监测到底物水解。这些发现与以前的报道一致并且因此接下来通过测量凝血酶活性，FXIII的激活物，研究了是否细菌诱导的接触激活导致整个凝血级联的诱导。为此目的，用锌、钙和磷脂重构正常血浆。也给样品补充以四肽(Gly-PiO-Arg-Pix))以避免凝血酶产生的纤维蛋白单体的聚合和随后的凝聚胶形成(关于详细的信息参见实验步骤)。当将该反应混合物添加至正常血浆并与APl细菌温育时，监测到细菌表面上凝血酶活性的增加(图1B)。用FXIII缺陷的，但不是用FXII缺陷的或凝血酶缺陷的血浆也获得了相似的结果，暗示需要细菌表面上接触系统的激活以触发其余凝结因子的激活(图1B)。FXIII是凝血酶的底物之一并且因此测试了是否细菌诱导的凝血酶激活触发FXIII转变成其活性形式。为此目的，发明者使用了针对N-ε - Y-谷氨酰基-赖氨酸的抗体，其特异地识别通过FXIII的作用而共价 交联的氨基酸(el Alaoui等人，1991)。因为Gly-Pro-Arg-Pro在实验中产生温和的细菌抑制效应，因此决定不使用该肽作为抗凝剂。相反，将血浆稀释至这样的浓度(1/100)，其中纤维蛋白浓度太低以至于当被凝血酶激活时不引起其聚合。将细菌与稀释的正常的、凝血酶缺陷的、FXII缺陷的和FXIII缺陷的血浆在金标记的抗体、锌、钙和磷脂存在下进行温育。然后通过负染电子显微术分析样品。图1C显示抗体与用正常血浆处理的化脓性链球菌细菌的表面结合，而当将细菌与FXII缺陷的或FXIII缺陷的血浆进行温育时，仅检测到背景信号(图1C)。用凝血酶缺陷的血浆获得了相似的结果(数据未显示)。总之，这些结果暗示当暴露于血浆时，细菌表面的接触激活可以引发整个凝血级联的诱导并最终能够使FXIII在化脓性链球菌表面蛋白质上起作用。实施例2:链球菌在凝血酶激活的血浆但不在未被激活的血浆中被杀死在接下来的实验系列中，发明者希望研究交联的细菌在激活的但未凝结的，正常的和FXIII缺陷的血浆中的命运。图2A显示在凝血酶激活的正常的和FXIII缺陷的血浆中细菌生长显著受损。该效应是时间依赖的并且当血浆未被激活时则看不到。为了研究是否血浆的激活与抗微生物活性的诱导相结合，使经血浆处理的细菌经历负染电子显微术。图2B(左边的图版)描绘了与未经激活的正常血浆进行温育的完整细菌，并且当将细菌与未经激活的FXIII缺陷的血浆进行温育时，观察到相似的发现(数据未显示)。然而，一旦用凝血酶激活，与正常血浆(图2B，中间的图版)和FXIII缺陷的血浆(图2B，右边的图版)的温育就引起细菌细胞壁的多重破裂并触发胞质内容物的外流，其是细菌杀死的标志(MaImstrOm等人，2009)。值得注意的是，在没有血浆存在下与凝血酶的温育既不损害细菌生长Ik不引起胞质泄漏(数据未显示)。为了测试是否在所形成的凝块内也出现细菌杀死，将APl细菌与未经稀释的血浆混合，接着用凝血酶进行激活。将所形成的凝聚胶温育I小时，制成薄切片并用透射电子显微镜进行分析。图2C展示了大多数在产生自正常的和FXIII缺陷的血浆的凝块内的细菌(下面的图版)没有胞质内含物，暗示细胞膜的实质的破裂和细菌杀死。与此相对照，当紧在添加凝血酶后将凝块制成薄切片时，只看见几个死细菌(上面的图版)。总之，这些数据证明凝血级联带有抗微生物活性，其在激活时暴露，但不依赖于FXIII。实施例3:血浆凝块内的细菌俘获是FXI11依赖的最近体外显示人FXIII使血浆凝块内的金黄色葡萄球菌和大肠杆菌物种的细菌交联和固定化(Wang等人，2010)。为了测试是否这也适用于化脓性链球菌，将APl细菌与正常的和FXIII缺陷的血浆进行温育并用扫描电子显微术分析凝血酶激活的凝块。图3A和3B显示在没有细菌存在下从正常的和FXIII缺陷的血浆形成的凝块。显微照片揭示两种类型的凝块享有相似的形态学，虽然从FXIII缺陷的血浆产生的凝块看起来密度较小。然而，当在APl细菌存在下形成凝块时观察到剧烈的变化。在大载量的细菌被俘获在产生自正常血浆的凝块中时(图3C)，在使用FXIII缺陷的血浆时只发现几个细菌(图3D)。而且，当将细菌与正常血浆温育时纤维蛋白网络形成降低，这在采用FXIII缺陷的血浆时未见到(图3C和3D)。在较高的分辨率下值得注意的是，纤维蛋白纤维和细菌在产生自正常血浆的凝块中紧密靠近，并且甚至看起来纤维来源自细菌表面(图3E)。与此相对照，细菌松散地集合在产生自FXIII缺陷的血浆的凝块中并且检测不到与纤维蛋白纤维的直接相互作用(图3F)。为了证实这些发现，将产生自正常血浆的凝块制成薄切片并使经历电子显微术，这允许在较高分辨率下的分析。图3G-1描绘了在与正常血浆的温育和随后的凝血酶激活之前(图3G)和紧之后(图3H)制成薄切片的APl细菌。在凝块中，细菌沿纤维蛋白纤维收紧并且看起来它们具有多个相互作用位点。使用了针对N- ε - Y -谷氨酰基-赖氨酸的金标记抗体的额外免疫染色以研究细菌与纤维蛋白纤维之间的相互作用方式。检测到纤维蛋白纤维之中的许多交联事件。电子显微术分析揭示了纤维蛋白纤维贪婪地交联至APl细菌的表面(图31)。当将细菌与FXIII缺陷的血浆温育时，未记录到交联活性(数据未显示)。大多数链球菌血清型具有对纤维蛋白原的高亲和性并且已报道Ml蛋白是APl菌株的最重要的纤维蛋白原受体(人kesson等人，1994)。将各自的结合位点作图在Mi蛋白的氨基末端区和片段D，其是纤维蛋白原的末端球形结构域的一部分(人kesson等人，1994)。采用负染电子显微术以研究Ml蛋白与纤维蛋白原在分子水平上的相互作用。结果证明了链球菌表面蛋 白质的一个末端区与纤维蛋白的球形结构域复合(图4A，上面的图版)，其与作图研究很好地相符。当将激活的FXIII与两个蛋白质共温育时，该复合物的性质不改变(图4A，中间的图版)。的确，金标记的针对N- ε - Y -谷氨酰基-赖氨酸的抗体的额外免疫检测揭示了相互作用位点被FXIII共价交联(图4Α，下面的图版)。因为M蛋白是链球菌最丰富的表面蛋白质，因此看起来可信的是，APl细菌的Ml蛋白是主要的相互作用伙伴之一，其通过FXIII的作用共价粘附至纤维蛋白纤维。然而，不能排除其他链球菌表面蛋白质也被FXIII作为靶标。通过测量APl细菌从产生自正常的和FXIII缺陷的血浆的凝块中的逃逸，研究了通过FXIII的细菌交联是否在凝块内具有生理病理学功能。为此目的，将链球菌与未经稀释的正常的或FXIII缺陷的血浆相混合，并通过添加凝血酶诱导凝结。然后，用PBS简短地洗涤凝块并覆盖以生长培养基。在不同的时间点后，从上清液收集样品并测定其细菌载量。如在图4B中所见，FXIII诱导的交联显著减少了细菌从凝块的释放，暗示其在凝块中的固定化和杀死。总之，这些结果显示，通过FXIII的作用，化脓性链球菌细菌被共价地编织进纤维蛋白网络中并且这防止了其从凝块的传播。实施例4:化脓性链球菌感染的FXIII+小鼠比野生型动物具有更多的炎症征兆体外数据暗示凝血是早期先天性免疫应答的一部分，其以协同作用触发凝块内化脓性链球菌的固定化和杀死。发明人因此假定防止细菌传播和其清除可以抑制感染位点处的炎症反应。为了测试此，利用了分别用另一种Ml血清型、KTL3建立的皮肤感染模型(Toppel等人，2003)。用KTL3菌株的攻击通常引起局部感染，其最终从感染焦点传播并导致全身性感染(Toppel等人，2003)。通过采用扫描电子显微术的分析，发现KTL3菌株与凝血酶激活的人正常的或FXIII缺陷的血浆的温育在体外产生具有与用APl细菌所产生的相似的形态学的凝块(数据未显示)。当将小鼠血浆(正常的或FXIII缺陷的)与KTL3细菌进行温育时，也获得了相似的结果(图8)。为了研究对用化脓性链球菌的局部感染的炎症反应，用KTL3菌株皮下感染野生型和FXIII+小鼠。感染24小时后，处死小鼠并以外科手术方式移除来自局部感染病灶的皮肤并用苏木精和伊红进行染色以用于组织病理学分析。来自未经感染的野生型和FXIII+小鼠的皮肤活组织检查的显微术检查揭示没有炎症征兆(图5A+B)，而在来自经感染的野生型动物的活组织检 查中看见水肿形成、中性粒细胞侵入和组织损害(图5C)。值得注意的是，当用显微术分析来自感染的FXIII+小鼠的活组织检查时，这些损伤要严重得多(图5D)。来自野生型和FXIII+小鼠的组织活组织检查的进一步电子显微术检查显示遍及感染位点的严重出血(数据未显示)。然而，发现细菌被俘获和聚簇在感染的野生型小鼠的纤维蛋白网筛之中(图5E)，而当分析来自感染的FXIII+小鼠的皮肤活组织检查时，它们分散遍及凝块中(图5F)。额外的统计学分析揭示了在野生型动物的纤维蛋白网络中大约8个细菌聚簇/100 μ m2，而看见链球菌大部分是以41个细菌/链/100 μ m2的密度的单个细菌或小链。在较高的放大倍数下，看起来细菌是来自感染的野生型小鼠的纤维蛋白网络的组成部分(图5E，插入图)。在来自FXIII+小鼠的活组织检查中未观察到此，在FXIII+小鼠中发现链球菌与网络相关联但不作为网络的组成成分(图5F，插入图)。通过测量固有凝血途径的凝结时间(激活的部分促凝血酶原激酶时间或aPTT)，调查了是否细菌的固定化影响其传播，凝结时间如果增加，是对感染的全身性反应的一个征兆(Oehmcke等人，2009)。为此目的，感染小鼠24小时。其后收回血浆样品并测定固有凝血途径的凝结时间。图5G显示来自感染的野生型小鼠的血浆样品的aPTT适度但明显地增加，而在来自FXIII+小鼠的血浆样品中，凝结时间蹿升。在两组小鼠中，在感染24小时后，凝血酶原时间(PT)保持不变(数据未显示)。肝脏和脾中的细菌载量显示稍微增加的细菌水平，特别是在FXIII+小鼠的脾中，但当与野生型动物相比较，差异则不明显(图9)。总之，这些结果证明了 FXIII的缺乏导致感染位点处增加的炎症反应，结合有全身性反应的诱导。实施例5:在具有由化脓性链球菌引起的坏死性筋膜炎的患者中的FXIII交联为了检测是否从动物研究获得的结果也可应用于临床情形，将来自具有由化脓性链球菌引起的坏死性筋膜炎的患者的活组织检查用免疫组织学的和电子显微的手段进行分析。图6描绘了感染位点处的大量组织坏死并且随后的免疫检测显示在这些位点处对于Ml蛋白和FXIII的阳性染色。这暗示血浆流入至感染病灶并且的确记录到了在这些位点处增加的交联活性(图6，上面一排)。作为对照，使用了来自健康人员的活组织检查，但当使活组织检查经历相同的实验方案时，未记录到免疫染色(图6，下面一排)。将组织切片进一步用共聚焦免疫荧光显微术，使用针对Ml蛋白和N- ε - Y -谷氨酰基-赖氨酸的抗体进行分析。图7Α显示两种抗体的共定位，暗示感染位点处的细菌交联。当用扫描电子显微术进行分析时，记录到感染位点处的大量出血(数据未显示)并且发现细菌聚簇和俘获在纤维蛋白网络中(图7Β)。将样品也制成薄切片并通过免疫透射电子显微术，使用针对N- ε - Y -谷氨酰基-赖氨酸的抗体进行了研究。图7C描绘了在与纤维蛋白纤维相接触的区域中细菌表面的免疫染色。显微照片还揭示了显著部分的俘获细菌不是存活的，如在图7D中所显示的。这些发现与体外和体内实验一致并且它们说明了在来自具有用化脓性链球菌的严重的和侵入性感染的患者的凝块中看见细菌的固定化和抗微生物活性的产生。
实施例6:用FXIII的局部处理抑制了感染小鼠中的全身性细菌扩散为了测试是否用FXIII的处理能够防止感染动物模型中的细菌扩散，用化脓性链球菌皮下感染野生型小鼠。攻击后三个小时，用Fibrogammin⑧P，一种人血浆FXIII浓缩物，处理半数的小鼠，将其注射入感染位点。选择200国际单位(IU)/kg体重的剂量，其是正常血浆水平的大约10倍并且显示这在小鼠中是良好地被耐受的(Lauer等人，2002)。用化脓性链球菌感染但没有Fibrogammin处理的小鼠作为对照。感染后24小时，处死动物并测定血液、肝脏和脾中的细菌载量。如在图7E中所显示的，在三种情况下，在Fibrogammin处理的小鼠中发现显著低的量的细菌，暗示FXIII抑制化脓性链球菌在感染动物中的全身性传播。总之，与本发明相关地给出的结果支持这样的概念，即针对细菌感染的早期防御系统牵涉FXIII介导的凝块内的细菌固定化，结合有血浆产生的抗微生物活性的诱导和随后的细菌杀死。数据暗示这两种机制协同工作并且这可以降低细菌传播并下调炎症反应。参考文献AkcSSOn, P., Schmidt, K.H., Cooney, J., and Bjorck，L.(1994).Ml proteinand protein H:1gGFc-and albumin-binding streptococcal surface proteins encodedby adjacent genes.Biochem J 300，877-886.
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权利要求
1.凝血因子XIII(FXIII)，用于治疗和/或预防由微生物的感染和/或与所述感染相关的症状。
2.根据权利要求1的FXIII，其中所述FXIII以浓缩物来使用或施用。
3.根据权利要求1或2的FXIII，其中所述FXIII从人血浆分离或以重组蛋白质来提供。
4.根据权利要求1至3 中任一项的FXIII，其中所述治疗和/预防包括 (i)向患者施用FXIII，以便使患者血浆中的FXIII浓度增加在健康个体血浆的FXIII浓度之上，和/或 (ii)向患者施用FXIII，以便患者血浆中的起始FXIII浓度高达其正常水平的10倍，和/或 (iii)向未患有先天性或获得性FXIII缺陷的患者施用FXIII。
5.根据权利要求1至4中任一项的FXIII，其中所述治疗和/预防包括向患者全身性地或局部地、优选地向感染区局部地施用FXIII。
6.根据权利要求1至5中任一项的FXIII，其中所述治疗和/预防包括以这样的剂量向患者施用FXIII =5-1000国际单位(IU)/kg体重，优选地5-500IU/kg体重，更优选地，5-300IU/kg体重，还更优选地5-250IU/kg体重，还是更优选地10_200IU/kg体重。
7.根据权利要求1至6中任一项的FXIII，其中所述治疗和/预防是为了抑制患者体内微生物的全身传播、固定和/或杀死患者体内的微生物。
8.根据权利要求1至7中任一项的FXIII，其中所述微生物能够支持或增强纤维蛋白溶解，能够激活纤溶酶原和/或具有选自下列的纤溶酶原激活蛋白:链激酶、葡萄球菌激酶、Pla蛋白、纤维蛋白溶酶、激活纤维蛋白溶解的化合物或其他细菌蛋白质。
9.根据权利要求1至8中任一项的FXIII，其中所述微生物能够通过携带至少一个表面和/或细胞壁蛋白质而支持或增强纤维蛋白溶解，所述表面和/或细胞壁蛋白质能够降低至少一种纤溶酶原激活抑制物的血浆浓度，所述蛋白质优选地选自GRAB蛋白(化脓性链球菌)、溶金菌素(金黄色葡萄球菌)、炭疽芽孢杆菌的分泌型中性金属蛋白酶和微小消化链球菌的分泌型蛋白酶。
10.根据权利要求1至9中任一项的FXIII，其中所述微生物选自细菌、酵母、病毒和多细胞寄生虫，所述细菌优选地由具有坚固的细胞壁和/或是革兰氏阳性的细菌组成，更优选地，由好氧和兼性厌氧球杆菌家族的细菌组成，还更优选地，由链球菌科组成，还是更优选地，由溶血性链球菌组成，最优选地，是化脓性链球菌。
11.根据权利要求1至10中任一项的FXIII，其中所述感染是选自下列的一种或多种组织的感染:皮肤、呼吸系统、咽喉、肺、脾、肝脏、肾、心血管系统、心脏、中枢神经系统、消化系统、生殖泌尿系统、肌肉和软组织；或者是已经进展到患者身体的全身性感染。
12.根据权利要求1至11中任一项的FXIII，其中所述症状选自炎症、头痛、发烧、腹泻、疼痛、意识丧失或者它们中的一个或多个的组合。
13.药物组合物，其包含药学有效量的如在权利要求1至3中任一项所定义的FXIII，和选自一个或多个下列的成分:人白蛋白、葡萄糖、氯化钠、水和用于调节PH的HCl或NaOH，用于治疗和/或预防如在权利要求1和4至12中任一项所定义的由微生物的感染和/或与所述感染相关的症状。
14.用于制备药物的方法，所述药物包含药学有效量的如在权利要求1至3中任一项所定义的FXIII或如在权利要求13中所定义的药物组合物，用于治疗和/或预防如在权利要求I和4至12中任一项所定义的由微生物的感染和/或与所述感染相关的症状。
15.治疗方法，其包括向有此需要的患者施用药学有效量的如在权利要求1至3中任一项所定义的FXIII或如在权利要求13中所定义的药物组合物，用于治疗和/或预防如在权利要求I和4至12中任 一项所定义的由微生物的感染和/或与所述感染相关的症状。
全文摘要
本发明涉及凝血因子XIII(FXIII)，其用于治疗和/或预防由微生物的感染和/或与所述感染相关的症状；药物组合物，其包含药学有效量的所述FXIII；用于制备药物的方法，所述药物包含药学有效量的所述FXIII；和治疗方法，其包括向有此需要的患者施用药学有效量的所述FXIII。
文档编号A61K38/45GK103079588SQ201180035767
公开日2013年5月1日 申请日期2011年7月20日 优先权日2010年7月22日
发明者H·赫瓦德, U·特奥博尔德, T·卢夫, M·默格林, G·迪肯内特 申请人:德国杰特贝林生物制品有限公司, 汉莎医疗股份公司