用于改善的器官移植物保存和接受性的组合物及方法

专利名称：用于改善的器官移植物保存和接受性的组合物及方法
用于改善的器官移植物保存和接受性的组合物及方法直量本发明涉及器官及组织的移植。更具体而言，其涉及移植物供者的预处理、将移植物从供者取得后的移植物保存、以及为使来自移植物的益处最大化而对移植物受者的处理。移植的含义是将器官或组织从某个身体取出并将其植入另一个身体内，目的是为了代替严重损坏或缺失的器官或组织。对于主要器官移植物例如心脏、肺、肾脏、肝脏或胰脏的受者而言，考虑到潜在疾病或损害的严重性，移植通常是中期或长期存活仅有的现实机会。目前，据估计每年进行至少数万例的主要器官移植。最频繁移植的器官是肾脏，仅在美国每年就进行大约25，000例移植，其次是肝脏、心脏、肺和胰脏。在以往的数十年中这些延长寿命的方法的成功率已经显著提升。例如，目前对于心脏移植受者的五年存活率约为男性73%及女性67%。对于肾脏，进行移植的典型患者将比持续透析的患者寿命长10至15年。对于肝脏移植，受者具有58%的机会可以存活15年。同时，仍然有大量的失败的移植。移植失败的原因通常与以下有关(a)供者预先存在的疾病或器官在移植前的损伤，(b)移植物取得后的损伤，例如在运输或储存过程中的损伤，和/或(C)受者免疫系统的移植排斥。脑死亡被认为是异体移植物移植前损伤的主要原因之一。根据损伤假说，移植前损伤对移植的结果具有实质性的影响。尤其是在肾脏移植中，从脑死亡供者取得的移植物实际上与那些从活体供者取得的相比显示出降低的长期存活率。在脑死亡供者中移植物的损伤可能是通过几种途径产生，其一是涉及血液动力学事件，另一个是涉及器官(包括肾脏)的免疫应答。`最近，已经显示在取得肾脏前用低剂量的多巴胺对供者进行预处理可对移植物的功能具有有利的影响(Schnuelle P 等人，Effects of donor pre-treatment withdopamine on graft function after kidney transplantation:a randomized controlledtrial. JAM. 2009年9月9日;302 (10) : 1067-75)。但是，在脑死亡供者体内改变的儿荼酚胺消除率使施用多巴胺变得困难，并且可以导致高血压和心动过速。此外，已经建议使用化学修饰的多巴胺类，特别是N-辛酰基多巴胺(NOD)，可以比多巴胺自身更好地适用于供者的预处理，并且还可以有利地应用于器官保存溶液中(Losel RM 等人，N-octanoyl dopamine, a non-haemodynamic dopamine derivative, forcell protection during hypothermic organ preservation. PLoS One. 2010 年 3 月 16日；5(3):e9713;也参见W02009/015752A2)。这些衍生物的优点是它们表现出强的还原能力，但同时它们在很大程度上缺乏血液动力学活性，并且由于它们高于多巴胺的亲脂性，其具有实质上提闻的细胞摄取的潜能。然而，很难有效地递送亲脂性多巴胺衍生物。它们是化学不稳定的，易于氧化，并且很难溶于水性介质。作为混悬液，其不能注射或静脉输注，并且当加入器官保存溶液中时，它们将沉淀并导致不可靠的效果。
虽然W02009/015752涉及使用增溶赋形剂或胶体系统来配制亲脂性多巴胺衍生物的一般可能性，但其未公开任何使用此类赋形剂的多巴胺衍生物的具体组合物。其它提到NOD的文献也未描述关于该化合物的可用的配制技术，例如Schnetze U等人，J.Cryobiol. vol. 53 (3), p. 375, 2006 和 Tsagogiorgas C 等人,Transplantation 卷 90 的增刊(2s), 2115, p. 37，2010。在运输和储存过程中，器官和组织的保存通常是通过将其存放在保存溶液中并将其冷却至仅高于凝固点来完成。普通的保存溶液是基于组氨酸-色氨酸-酮戊二酸(HTK)，目的是通过去除细胞外的钠和钙并且用组氨酸/组氨酸盐酸化物进行细胞外空间的充分缓冲，使得器官功能失活，从而延长器官耐受含氧血中断的时期。可选择的溶液是Euro-Collins(EC)溶液和威斯康辛大学(UW)溶液。后者模拟细胞内液的特性，但还包含防止水肿的聚合物(羟乙基淀粉)，以及用于清除自由基的添加剂。如上文提到的，还建议向该器官灌注和保存混合物中加入多巴胺或亲脂性多巴胺衍生物，以减少冷藏保存的损伤。移植排斥是移植失败的另一个主要原因。通常，受者的免疫系统将移植物作为体内的异物进行攻击并试图破坏 它。通过仔细地对供者和受者进行血清分型以确定最适合的配型，可以在某种程度上降低移植排斥的严重性和发生率。然而，一些排斥的偶发事件仍然发生在许多(如果不是大多数)移植物受者身上，并且免疫应答的严重性仅能够通过使用免疫抑制药物来控制。受者的免疫反应可以划分为超急性、急性和慢性排斥。超急性排斥是受者与预存在于供者的抗体的补体介导的应答。此类反应可以在数分钟内发生，并且移植物必须马上移除以防止严重的系统免疫应答和血液的广泛凝集。超急性排斥的风险尤其是与肾脏移植相关。急性排斥涉及移植物中的T细胞和其它免疫细胞的浸润。所述T细胞通过多种机制，引发移植组织中的细胞裂解，或产生导致组织坏死的细胞因子。由于在此类反应发生前T细胞必须首先分化，因此急性排斥通常仅在移植后潜伏一周或数周后开始出现。急性排斥的最高风险是在最初三个月。急性排斥的严重性不一定都是很严重的；排斥从某种程度上是可以通过适当的免疫抑制疗法控制的。急性排斥事件的复发和难以控制可以最终导致慢性移植排斥的出现，其综合了大多数形式的对抗移植组织的慢性炎症和免疫应答。相关的病症是慢性异体移植物血管病变，其描述了与移植组织的脉管系统纤维化相关的器官功能的长期丧失。慢性抑制排斥是不可逆的且不能被有效治疗。有效控制急性排斥反应的免疫抑制药物包括皮质类固醇类、钙神经素抑制剂、mTOR抑制剂、抗增殖药物和抗T细胞或B细胞的抗体，其中部分是靶向于特定的表面蛋白质(例如CD20、CD25)。在预防和控制移植排斥中特别重要的是作为钙神经素抑制剂起作用的大环内酯类免疫抑制剂，例如环孢素A和他克莫司，或者mTOR抑制剂，例如西罗莫司和依维莫司。实际上，第一批大环内酯类药物的出现为移植物受者带来了实质性的治疗益处，特别是环孢素，其次是他克莫司。随后，具有相关结构和活性的化合物包括吡美莫司、依维莫司、西罗莫司、Deforolimus、依维莫司、坦罗莫司(temsirolimus)和佐他莫司(zotarolimus)。大多数(如果不是全部)用于免疫抑制的大环内酯类药物都是具有有问题的生物利用度的难以溶解的化合物。其使用与实质的不良反应相关联。例如，环孢素A不仅表现出显著的肾毒性和肝毒性，还可能导致牙龈增生、惊厥、消化性溃疡、胰腺炎、发烧、呕吐、腹泻、意识错乱、高胆固醇血症、呼吸困难、麻木和麻刺感(特别是嘴唇)、瘙痒、高血压和增强的(与所有免疫抑制剂类似的)对条件性真菌和病毒感染的易感性。他克莫司可以引发心肌损害、高血压、视力模糊、肝和肾脏问题发作、震颤、高钾血症、低镁血症、高血糖、糖尿病、瘙痒、失眠和神经学问题，例如随后可逆的脑病综合征意识混乱、食欲缺乏、虚弱、抑郁、抽筋和神经病。此外，有证据证明免疫抑制剂例如环孢素、他克莫司等与移植物受者体内的恶性肿瘤(例如非霍奇金淋巴瘤和黑素瘤)的风险提高有关。该风险显示与给药方案和治疗持续时间有关。为了进一步增强异体移植物的生理功能并降低移植失败的风险，需要改善供体的预处理以减少冷藏的局部缺血损害。此外，为了进一步降低冷藏保存损伤的风险，需要改善移植物的保存直至移植。最后，为了将来自移植物的益处最大化并将严重排斥反应的风险最小化，还需要移植物受者更加有效且更好耐受的药物治疗。本发明满足了这些需要，其目的在于提供供体预处理、异体移植物保存和受者处理的改进，这些改进克服了现有技术方法和组合物的一种或多种缺点。其它的目的根据本说明书和专利权利要求中所述也能够得到理解。发明简沭本发明提供了包含有效量的N-辛酰基多巴胺、生理学上可接受的水性溶剂以及生理学可接受的两亲的赋形剂的药物组合物。在所述组合物中，N-辛酰基多巴胺是以分子或胶体的分散状态存在。在本发明的组合物中，N-辛酰基多巴胺是以溶解的形式引入。例如，其可以配制为胶束溶液、胶体脂质体分散体系、或者微乳剂。在胶束溶液的情况下，优选地通过非离子型表面活性剂例如聚山梨酯来溶解。同时，配制该组合物以保护N-辛酰基多巴胺防止降解。虽然所述化合物与许多增溶赋形剂很难相容，但发明者已经发现，实际上某些非离子型表面活性剂以及某些形成囊的两亲性脂类可以用于将N-辛酰基多巴胺配制到溶解的且稳定的水性制剂中。所述组合物优选地适用于胃肠外给药。其可以向移植物供者全身性或局部给药进行预处理并防止局部缺血损害。根据其它实施方案，其在体外使用以保存异体移植物，从而将冷藏保存损伤最小化。对于此目的，例如可以将其加入常规器官保存介质中。在另一项实施方案中，将N-辛酰基多巴胺向异体移植物受者施用，例如经静脉注射施用。通常情况下，所述受者是用至少一种免疫抑制药物(例如钙神经素抑制剂，例如环孢素)联合治疗的患者。附图简沭


图1显示了与未处理的和常规(多巴胺)处理的细胞相比的用实施例1的组合物影响下的8小时冷储存后心肌细胞中ATP损失的减轻。图2显示了与未处理的和常规(多巴胺)处理的细胞相比的在实施例1的组合物存在下的8小时冷储存后LDH释放的抑制。发明详沭
根据本发明，其提供了包含有效量的N-辛酰基多巴胺、生理学可接受的水性溶剂和生理学可接受的两亲性赋形剂的药物组合物。在该组合物中，N-辛酰基多巴胺是以分子或胶体的分散状态存在。发明人已经发现，该组合物中的N-辛酰基多巴胺是以溶解的形式存在，提供了迄今为止已知的更加有效地使用该化合物的方式。令人吃惊地是，本发明的溶解的制剂不仅使得所述化合物可以通过多种胃肠外途径(包括静脉注射或输注)施用，而且还增强了其保护活性。同时，所述组合物同时克服了源自N-辛酰基多巴胺特性的挑战，所述特性使得配制和施用该化合物变得困难，特别是其弱水溶性和其显著的化学不稳定性。N-辛酰基多巴胺，也称为N-辛酰基-4-(2-氨基乙基)苯_1，2_ 二醇或N-辛酰基-4-2-(3，4-二羟基苯基)乙基胺，是儿茶酚胺神经递质多巴胺的亲脂性酰基衍生物。如本文所用的术语N-辛酰基多巴胺还包括其任何盐、异构体和N-辛酰基多巴胺的溶剂化物。有效量的含义是适合实现预期用途的效果的量。N-辛酰基多巴胺的有效量可以例如在器官保存溶液和供者预处理注射液两者之间不同。生理学可接受的水性溶剂是水或化合物特别是药物赋形剂的水溶液，该赋形剂就其引入的量和预期用途方面而言被认为是安全的。例如，该水性溶剂可以是无菌的等渗氯化钠溶液，或无菌的缓冲溶液。类似地，生理学可接受的两亲性赋形剂是两亲性化合物，特别是表面活性剂，其可以用作药物赋形剂，条件是在考虑到给药途径和频率时，其至少在引入的水平和预期用途方面是安全且良好耐受的。分子分散状态是指真实的分子溶液。在液体溶液中，溶质的分子以个体溶解并被溶剂分子包围。相反，胶体分散状态的含义是物质(此处是N-辛酰基多巴胺)以胶体大小的结构存在，即它们实质上比各自的分子大，但小到肉眼看不见。胶体通常具有大约I至500 纳米的直径。(H. Strieker, Physikalische Pharmazie,第 3版，第 440 页)。因此,胶体结构实际上在光学显微镜 下看不见，且不会导致该溶液浑浊，但会导致乳光。多种类型的胶体结构已知存在于不同的胶体液体类型中。在各向同性的胶体溶液中，该溶液的特性不论检测的方向如何都是相同的。换言之，在各向同性状态中，所有方向都是互相没有区别的。例如，胶束溶液可以是各向同性的。在各向异性胶体溶液中，分子的朝向和/或排列导致该溶液的物理特性在不同检测方向上不同。该各向异性溶液被称作液晶或液态结晶相，或中间相。在一项优选的实施方案中，本发明的组合物包含以该胶体分散状态的N-辛酰基多巴胺。分散于水性溶剂中的胶体颗粒通常包含两亲性赋形剂和活性成分。如本文所用的，胶体分散体系还可以指作胶体溶液。根据其它优选的实施方案，该组合物包含选自非离子型表面活性剂的两亲性赋形剂。可药用的非离子型表面活性剂包括，例如泰洛沙泊，泊洛沙姆类例如泊洛沙姆188、泊洛沙姆407，普流尼克F68LF或Lutrol F68、普流尼克F127、普流尼克L-G2LF和普流尼克L62D，聚山梨酯类例如聚山梨酯20、聚山梨酯60和聚山梨酯80，聚氧乙烯蓖麻油衍生物、山梨坦酯、聚乙二醇硬脂酸酯及其两种或多种的混合物。在特定的实施方案中，非离子型表面活性剂是聚山梨酯。在其它特定的实施方案中，该非离子型表面活性剂是聚山梨酯80。任选地，该组合物包含两种或多种两亲性赋形剂或表面活性剂。在一项优选的实施方案中，组合使用了两种或多种非离子型表面活性剂。例如聚山梨酯，如聚山梨酯20或80，可以与克列莫佛EL或克列莫佛RH组合。两亲性赋形剂或表面活性剂，或表面活性剂的组合，可以以能够形成溶解N-辛酰基多巴胺的胶束的量引入。一般而言，胶束是溶剂中两亲性分子的胶体聚集物。其可以是球状，也可以是非常不同的形状。在水性系统中，通常的球型胶束包含表面活性剂分子，其亲水性部分与周围的溶剂接触，将疏水分子区域隔离于胶束中心。难溶于水的亲脂性化合物可以溶于此类胶束的核心区域。为了发生胶束形成，表面活性剂的浓度必须高于临界胶束浓度(CMC)。因此，如果目标是胶束溶液，组合物中表面活性剂的量应当选择高于该浓度。此外，表面活性剂的量应当选择足够高以便溶解引入的N-辛酰基多巴胺的量。同时，表面活性剂的量必须足够低以避免在移植物供者、移植物自身或移植物受者中的不期望的作用。在一项特定的实施方案中，两亲性赋形剂的量是至少约0. 05重量％。根据其它实施方案，所述量分别是从约0.1重量％至约30重量％,或从约0. 5重量％至约20重量％。例如，已经发现在0. 5重量％的水平，聚山梨酯20和聚山梨酯80各自能够溶解大量的N-辛酰基多巴胺，例如40 μ m ο 1/mL。但是，如果该组合物是用作浓缩物加至用于组织和器官保存的市售溶液中时，该浓缩物自身还可以包含相对高浓度的两亲性赋形剂，这是因为将稀释因素考虑在内。在其它实施方案中，N-辛酰基多巴胺与两亲性赋形剂的比率是在约5:1至约1:50范围内选择。在其它优选的实施方案中，该组合物是不含有机溶剂或共溶剂，例如乙醇、甘油、丙二醇或聚乙二醇。根据另一项优选的实施方案，该组合物可以包含少量的此类溶剂或共溶剂，例如最多约2重量％。在需要或合适的情况下，该组合物可以包含其它无活性的药物成分。例如，其可以包含一种或多种用于调整制剂张度的赋形剂。优选将该组合物调整至表现出大约310m0smol/kg的渗透压,例如分别在约200至约450m0smol/kg的范围，或者在约250至约400m0smol/kg的范围，或者在约280至约350m0smol/kg的范围。如果预期的用途是在储存和运输过程中保存异体移植物，应当保证，任选地在用常规器官保存溶液稀释后，该组合物具有生理学渗透压约300至330m0smOl/kg。用于调整渗透压的适合的赋形剂包括，例如盐类、糖类、糖醇类和氨基酸类。所述盐类中，缓冲盐或氯化钠是特别适合的。可用的糖类和糖醇类包括，例如葡萄糖、棉子糖、海藻糖、山梨醇和甘露醇，这里提到的仅代表其中几种。此外，该组合物还可包含一种或多种用于调整pH值的赋形剂，该pH值优选的选自约pH3至约pH8范围内。更加优选地，该pH不高于大约7,例如从约pH4至约pH7. O,或从约pH4. 5至约pH6. 5。如果预期的用途是在储存和运输过程中保存异体移植物，应当保证，任选地在用常规器官保存溶液稀释后，该组合物表现出大约7. O至7. 5的pH。用于调整pH的适合的赋形剂包括生理学可接受的有机或无机酸、碱和缓冲盐。所述的盐可以同时作为生理学电解质来起作用，例如钠、钾、镁和钙盐。该组合物可以进一步包含一种或多种稳定剂，例如络合或螯合剂如EDTA，和/或抗氧化剂例如维生素E或维生素E衍生物、抗坏血酸、亚硫酸盐、亚硫酸氢盐、没食子酸酯、丁羟茴醚、丁羟甲苯或乙酰半胱氨酸；增粘剂，例如水溶性聚合物；防腐剂(当该组合物以多剂量容器包装且用于胃肠外给药时)；乳糖酸、别嘌呤醇、谷胱甘肽、腺苷；氨基酸，例如组氨酸、色氨酸、谷氨酸、氨基谷氨酸或酮戊二酸。任选地，本发明可以通过配制粉末或液态浓缩物来进行，其中如本文所述的组合物可以重构。例如，为获得延长的储存期，将该组合物的固体成分配制成无菌冻干粉末是有用的，其可以在使用前溶解于或分散于合适的水性载体或稀释剂中。或者，可以配制成液体浓缩物，经用水性介质稀释，获得最终的组合物用于移植物供者预处理、异体移植物保存或移植物受者处理。该液体浓缩物不仅具有使其易于制备、运输、存储和处理的低重量和体积的优点，而且还提供了在存储过程中避免偏离例如PH或重量克分子渗透压浓度的生理学参数的机会，例如考虑到延长的存储期。随后通过将所述浓缩物适当地稀释来实现其应用所需的生理学特性。在另一项实施方案中，该组合物是微乳剂的形式。如本文所用的，微乳剂是澄清的、热力学稳定的、光学各向同性的亲 脂性成分、亲水性成分和两亲性成分的混合物。通常情况下，当将各成分组合并彼此混合时，微乳剂自发形成，不需要在正常情况下形成“普通”乳液所需要的高能量输入。微乳剂可以具有分散在亲水相中的胶体亲脂相，或者以胶体状分散在亲脂相中的亲水相。分散相的大小通常在约5nm至约400nm范围内，且最经常是在约200nm以下。在本发明的一项优选的实施方案中，颗粒尺寸是从约5nm至约lOOnm。由于其流变性质，该微乳剂可以是液体或凝胶的形式，即以液体或半固体形式。在优选的实施方案中，该微乳剂是液体形式。如果使用微乳剂，亲脂性成分优选地选自其自身适用于胃肠外使用的赋形剂。例如，可以使用高度纯化的甘油三酯油或半合成的中链甘油三酯。在其它实施方案中，两亲性赋形剂是形成囊泡的磷脂。在该情况下，所述组合物设计为脂质体的胶体分散体系，其中脂质体容纳N-辛酰基多巴胺。如本文所用的，脂质体是从至少一个双层结构形成的囊泡，其中该双层结构由聚集的(或装配的)两亲性脂类构成。该双层结构表现出与生物膜的某种类似性，其中亲水性朝向囊泡的内侧和外侧，而亲脂性区域夹在这些亲水性区域的中间。较大的脂质体通常具有两个或多个同心双层结构。小的脂质体倾向于为球型，但较大的囊泡可以以多种形状存在。根据所选择的制备方法和生产条件，所得的脂质体可以描述为多层囊泡(MLV)、小单层囊泡(SUV)或大单层囊泡(LUV)。MLV与SUV和LUV的不同在于MLV具有两个或多个脂质双层结构。因此，MLV表现为在装载溶于或结合于囊泡膜的脂溶性区域的脂溶性药物中特别有用。相反，SUV和LUV对于将亲水性化合物包裹于脂质体的水性隔室内尤其有用。通常情况下，MLV的半径是从约200nm直至数微米。SUV通常在约80nm至约200-300nm范围，而LUV通常理解为平均大于约200-300nm。在本发明的内容范围内，所述半径应当理解为由激光衍射或光子相关光谱法检测的z平均值。在本发明的内容范围内，应当使用胶体脂质体，且非常大的MLV不属于此范畴。构成脂质体的两亲性脂类通常包含至少一种磷脂。磷脂是包含磷酸基团的两亲性脂类，其带有负电荷并因此基本上是亲水的。磷脂可以划分为甘油磷酸酯类(或磷酸甘油酯，其特征在于存在甘油基部分)或鞘磷脂类(或神经酰胺类，例如鞘磷脂)。脂质体可以包含天然的、半合成的和/或合成的磷脂类。通常情况下，脂质体包含至少一种甘油磷酸酯(或磷酸甘油酯)。该甘油磷酸酯类实际上是在脂质体中最常使用的形成囊泡的脂类。通常使用的甘油磷酸酯类包括由天然卵磷脂(例如大豆或鸡蛋卵磷脂)衍生的那些，或(部分)来自其水合产物。卵磷脂类包含大量的磷脂酰胆碱类，而且还包含少量的磷酸、胆碱、脂肪酸、甘油、糖脂类、甘油三酯类、磷脂酰乙醇胺类和磷脂酰肌醇。与磷脂酰乙醇胺类和磷脂酰甘油类相反，磷脂酰胆碱类是包含胆碱作为首基团的甘油磷酯。在磷脂酰胆碱类中，甘油部分的两个羟基基团经酯键与酰基连接，所述酰基通常衍生自中链至长链脂肪酸。用作脂质体组分的磷脂酰胆碱类(以及磷脂酰乙醇胺类和磷脂酰甘油类)中常见的酰基基团包括豆蘧酰基、棕榈酰基、硬脂酰基和油酰基。由于磷酸基团的负电荷和胆碱的正电荷，磷脂酰胆碱类通常是两性离子(有时也认为是中性)。磷脂酰乙醇胺类在大的pH范围内也是两性离子，但在碱性环境下也可以以阴离子存在。磷脂酰甘油类是阴离子。除了一种或多种甘油磷酸酯类以外，脂质体还可以包含一种或多种脂类，其自身不能形成双层结构，但其修饰或稳定该双层结构。此类膜修饰脂类的一个实例是胆固醇。脂质体和脂质体制剂的制备和鉴定方法是本领域技术人员已知的。通常，当两亲性脂类与水结合后将自发地形成多层囊泡，然而小单层囊泡的形成通常需要包括大量能量输入例如超声或高压匀浆的处理过程。制备和鉴定脂质体的方法已经例如在s. Vemuri等人[Preparation and characterization of liposomes as therapeutic deliverysystems:a review. Pharm Acta Helv. 1995, 70 (2) :95-111]中有描述。在已知的脂质体中，可以按照本发明使用的那些基本上具有胶体尺寸，S卩，它们的平均颗粒尺寸低于大约500nm。还优选直径分别最多大约300nm,或不大于200nm。该平均颗粒尺寸通常要求经过孔径为0. 22 μ m的过滤器进行过滤除菌，当所述组合物对于经受加热灭菌不够稳定时，这一点具有显著优势。本发明的组合物可以用作药物或用作保存和存储异体移植器官或组织的液体介质。当用于异体移植物保存时，其(任选地在重构后或用常规器官储存溶液稀释后)可以在将器官移出供者前和/或刚刚移出后立即直接注射或输注到器官的血管系统。因此，将该器官的血管系统用所述组合物冲洗，其随后保留在血管系统中用于储存和运输。在在受者体内植入后和灌注前，该移植物应当使用生理学血浆容积膨胀剂或其它类似物质进行冲洗，以除去所述保存和储存溶液。或者，可以将该组合物进行全身性注射或输注(例如通过静脉)到供者体内。按照该用途，用N-辛酰基多巴胺对供者进行预处理特别有用，特别是与仅在异体移植物移出后应用相比，所述化合物的保护功能可以更早起作用。此外，在(例如从脑死亡供者)取出多个器官情况下，该方案能够对所需的全部器官同时启动保护。在其它实施方案中，该组合物用作向移植物受者施用的药物，特别是用于预防和治疗移植排斥的目的。令人吃惊地是，发明人已经发现N-辛酰基多巴胺在治疗有用的浓度下能够抑制T细胞增殖。抑制出现在早期T细胞受体信号传递事件的下游，并且与NF K B (活化B细胞的核因子K轻链增强子)和AP-1 (活化蛋白I)的抑制相关联。发现所述效果取决于氧化还原活性，即，N-辛酰基多巴胺在氧化后丧失其T细胞抑制能力。

此外，还意外地发现N-辛酰基多巴胺和钙神经素抑制剂如环孢素A在抑制T细胞中发挥协同作用，因此在N-辛酰基多巴胺存在下用于基本上抑制T细胞所需的钙神经素抑制剂的浓度远低于不含N-辛酰基多巴胺的情况。基于该发现，本发明尤其指出接受钙神经素抑制剂如环孢素A治疗的移植物受者可以有利地用N-辛酰基多巴胺进行联合治疗。同时施用N-辛酰基多巴胺使得钙神经素抑制剂的剂量显著减少，其导致了剂量依赖性的钙神经素抑制剂不良反应的发生率和严重性实质上降低的优点。例如，在环孢素A和他克莫司的情况下，本发明提供了降低特别是其肾毒性可能性的方法，肾毒性是其在移植物受者治疗应用中的一项主要缺陷。例如，当患者接受钙神经素抑制剂环孢素A治疗时，对于器官移植物受者口服环孢素A的通常最初每日剂量是约10-14mg/kg体重，而对于骨髓移植物受者或已经存在移植物抗宿主反应的受者是约12. 5-15mg/kg,该剂量随后降至每日2_6mg/kg范围的维持剂量。通常情况下，目标是100_400ng/mL的波谷血液水平。然而在本发明情况下，其中环孢素A与N-辛酰基多巴胺组合，环孢素A的初始剂量可以降至低于10mg/kg，例如从约2至低于10mg/kg,或从约4至约8mg/kg。维持剂量可以分别降至从约I至约4mg/kg,例如获得波谷血衆水平不高于约200ng/mL,或者不高于约150ng/mL,或甚至低于100ng/mL。某些情况下，在N-辛酰基多巴胺存在下使用环孢素A，不高于约80ng/mL的波谷水平将证实能够满足移植排斥中的有效的维持治疗。在使用其它钙神经素抑制剂例如他克莫司的情况中，剂量减少以类似的方式实现。一般而言，推荐的标准每日剂量可以减少约20%或更多，或者减少约30%或更多，或者甚至减少50%或更多。在移植物受者的治疗中，N-辛酰基多巴胺，任选地以如上文所述组合物的形式，可通过导致N-辛酰基多巴胺的全身性利用或者在移植物中局部利用的任何途径进行施用。具体而言，N-辛酰基多巴胺或本发明的组合物可以经胃肠外或口服施用。如本文所用的，胃肠外施用是指任何经注射或输注给药的侵入性给药，包括静脉内、动脉内、皮下、肌内、局部、管腔内和真皮内给药。在优选的实施方案中，所述途径选自静脉内、动脉内、皮下和肌内给药。 对于口服给药，N-辛酰基多巴胺可以例如使用本领域技术人员已知的常规药物赋形剂配制成片剂、硬胶囊或软凝胶。其它实施方案将根据以下实施例而变得显而易见，实施例用于在某些其主要方面举例说明本发明，而不是限定其范围。
实施例实施例1用聚山梨酯80 (吐温80)作为两亲性赋形剂来制备N-辛酰基多巴胺的溶解的制齐U。简言之，将N-辛酰基多巴胺和聚山梨酯80加入等渗的(0.9重量％)氯化钠溶液中，以获得1. 116mg/mL(4ymo 1/mL)浓度的N-辛酰基多巴胺和5mg/mL浓度的聚山梨酯。将pH调至pH6. 5。将该混合物装入小瓶中，用橡皮塞和铝盖密封，并在121° C下高压灭菌10分钟，随后在冷却过程中振荡。得到无色、澄清或轻微乳光的溶液。该溶液在室温下至少4周保持物理和化学稳定。实施例2
与实施例1类似，用泊洛沙姆407 (普流尼克127)作为两亲性赋形剂配制溶解的N-辛酰基多巴胺制剂。使用相同的量和方法。再次获得稳定且仅有轻微乳光的液体。实施例3重复实施例1，除了将N-辛酰基多巴胺和聚山梨酯的量升至10倍(分别升至
11.16mg/mL和50mg/mL)。再次获得无色、澄清或轻微乳光且稳定的溶液，令人惊讶的证明了小浓度的聚山梨酯能够溶解治疗相关量的N-辛酰基多巴胺。实施例4重复实施例1和3，除了使用O. 189mg/mL浓度的乙酰半胱氨酸作为另外的赋形剂。该混合物的PH是4. 5。所得液体是无色且仅有轻微乳光。在胁迫条件下，其比实施例1和3的制剂在更长时间内保持无色。实施例5 将含有浓度为11. 16mg/mL的N-辛酰基多巴胺的实施例4的制剂的两个样品分别与威斯康星大学溶液(Viaspan或UW)或组氨酸-色氨酸-酮戊二酸(HTK)溶液(Custodiol)以1:4(1部分的本发明组合物加4部分的常规溶液)的体积比混合。在4° C下117小时后，该混合物保持澄清，并未显示出N-辛酰基多巴胺的氧化特征，而该氧化通常在与UW或HTK混合后非常迅速发生，导致产生褐色-粉红色。实施例6将N-辛酰基多巴胺(11. 16mg/mL)和大豆卵磷脂(Lipoid S75) (50mg/mL)加入葡萄糖水溶液(5重量％)。将pH调至pH6. 5。将该混合物超声4分钟，并随后在121° C高压灭菌10分钟。冷却后，得到几乎澄清、仅有轻微乳光的液体。由于卵磷脂，其颜色轻微发黄。实施例7重复实施例6，此外使用O. 189mg/mL浓度的乙酰半胱氨酸作为另外的赋形剂。该混合物的pH是4. 5。所得液体在物理和化学上稳定。实施例8将N-辛酰基多巴胺(223. 2mg)、聚山梨酯80(1，OOOmg)和乙醇(50mg)称重，混合并加热至121° C持续10分钟。随后，将该混合物在振荡下冷却至室温。将所得浓缩物用注射用水或灭菌的等渗氯化钠溶液以多种比例稀释，都获得澄清且基本上无色的溶液。实施例9检测按照实施例1所得的制剂是否能够抑制TNF-α介导的炎症。将人脐静脉内皮细胞(HUVEC)在不存在或存在多种浓度的N-辛酰基多巴胺制剂的情况下用TNF-α (肿瘤坏死因子α)刺激。进行Affymetrix基因表达谱、定量PCR、蛋白质印迹法和NF-K B活化来评价本发明组合物的抗炎能力。作为对比物，也检测不含表面活性剂的N-辛酰基多巴胺的水性分散体系(其不是本发明的实施方案)。结果，基因表达谱显示在这些粘附分子和炎症趋化因子中，许多促炎症反应基因被所述组合物下调。尽管HO-1 (血红素氧化酶I)被N-辛酰基多巴胺强烈地上调，但是HO-1表达对抗炎效果不发挥作用。虽然HO-1已经被Iy M的N-辛酰基多巴胺显著诱导，但抑制VCAM-1 (血管细胞粘附分子-1)表达需要50 μ M所述化合物。除了 HO-1外，属于泛素蛋白酶体系统(UPS)例如去泛素化酶Ε3-连接酶类和蛋白酶体亚单位的基因被所述组合物显著地上调。其不抑制I K B α (B细胞抑制物中的K轻链多肽基因增强子的核因子，α)的降解，但能够抑制持续的NFk B活化。作为对比物的制剂的效果更低，即，需要实质上更高的浓度以实现相同的效果。可以从这些结果得出结论，本发明的组合物显示出有效的抗炎作用。由于移植前损伤严重地影响移植结果，该组合物将对于供者预处理以减少脑死亡引发的炎症和保持器官质量(尤其是在长期冷藏保存后)有用。实施例10检测根据实施例3所得的制剂是否在体内具有抗炎作用。将急性肾衰竭(ARF)的大鼠用所述组合物(相当于O. 67mg的N-辛酰基多巴胺)静脉推注进行预处理。在I或5天后采集肾脏。检测肾脏功能。经免疫组织化学和EMSA(电泳迁移位移试验)检测肾脏炎症。结果，本发明组合物相对于盐水对照物显著提高了肾脏功能。免疫组织化学显示相对于对照物在处理的大鼠中单核细胞数量减少。此外，在用所述组合物处理的肾脏组织中NFk B下调。因此，其证明该组合物在体内具有有效的抗炎作用。其施用不仅减缓肾脏功能的恶化，而且在缺血再灌注情况中减少肾脏炎症。实施例11检测根据实施例1所得的制剂是否能够影响T细胞增殖。使用细胞培养系统，其中新鲜分离的T细胞经抗-CD3/抗-CD28小珠多克隆活化。将该细胞在存在或不存在本发明组合物的不同稀释液的情况下增殖至少10天。在第3、5、7和10天通过3H-胸苷掺入来检测T细胞增殖。在该模型中，T细胞增殖在第3天最高并在第10天逐渐下降。在所述组合物存在下，T细胞增殖有剂量依赖性的抑制，其根据所使用的浓度是可逆的。例如，25 μ M浓度的N-辛酰基多巴胺没有作用，50 μ M在第3天抑制T细胞增殖(此后T细胞开始增殖)，在100 μ M，T细胞增殖在第3、5天抑制并在第7天部分地抑制。已经发现抑制作用取决于氧化还原活性，因为抑制作用由于N-辛酰基多巴胺的氧化而消除，并且在结构相关的缺乏氧化还原活性的化合物中没有观察到抑制作用。重复该试验，此外将新鲜分离的T细胞用抗⑶3/抗-⑶28抗体在稀释成50 μ M浓度的N-辛酰基多巴胺和多种浓度的环孢素A或他克莫司存在下刺激。将类似浓度的环孢素A或他克莫司在该组合物不存在的情况下也进行检测。结果，环孢素A和他克莫司均为剂量依赖性抑制T细胞增殖，在10 μ M的环孢素A和1μ M的他克莫司下为最大抑制率。当存在50 μ M的Ν_辛酰基多巴胺时，T细胞增殖在IOnM的环孢素A和InM的他克莫司下仍然被完全抑制。考虑到事实上50 μ M的N-辛酰基多巴胺单独存在时仅在第3天部分地抑制T细胞增殖并在随后不抑制，这意味着N-辛酰基多巴胺和钙神经素抑制剂协同作用抑制T细胞。事实上，50 μ M的N-辛酰基多巴胺可以减少用于完全抑制T细胞所需的钙神经素抑制剂的量至少1000倍。这证明了钙神经素抑制剂的需要量可以被N-辛酰基多巴胺减少，而且不影响免疫抑制。由于钙神经素抑制剂的肾毒性与其剂量直接相关，与N-辛酰基多巴胺组合的低剂量的环孢素A或他克莫司能够保持有效， 但降低了肾毒性的发生率。实施例12将心肌细胞从新出生的大鼠中新鲜分离并培养3天。随后，将其在4° C下在不存在或存在按照实施例1配制的多种浓度的多巴胺或N-辛酰基多巴胺的情况下储存8小时。8小时冷却保存后，检测ATP水平和LDH释放，并在此后将心肌细胞重新加温，测定每孔的收缩速率和ATP再生。结果，8小时冷却保存后的ATP水平检测表明，所有处理过的心肌细胞与未处理的细胞相比显示出剂量依赖性的ATP损失的减轻(图1)。本发明组合物的作用与多巴胺组合物相比在更低得多的剂量下观察到。并且，重新加温后的ATP再生在处理过的细胞中相对于未处理的细胞更快。8小时冷却保存后的LDH释放在处理过的细胞中被抑制，但是N-辛酰基多巴胺制剂在低浓度时更加有效(图2)。重新加温心肌细胞后，在处理过的细胞中收缩速率表现出显著改善的速率。该结果证明，根据本发明配制的N-辛酰基多巴胺可以防止心肌细胞的冷却保存损伤，并在非常低的剂量下仍具有保护作用，这与常规的多巴胺处理不同。由于冷却保存和再灌注损伤对于心脏移植结果是不利的预测因素，这说明本发明的组合物对于供者预处理 有用。
权利要求
1.药物组合物，其包含 (a)有效量的N-辛酰基多巴胺； (b)生理学可接受的水性溶剂；和 (C)生理学可接受的两亲性赋形剂； 其中N-辛酰基多巴胺是以分子或胶体的分散状态存在。
2.如权利要求1所述的组合物，其是胶束溶液或微乳剂形式。
3.如权利要求2所述的组合物，其中两亲性赋形剂是非离子型表面活性剂。
4.如权利要求3所述的组合物，其中非离子型表面活性剂是聚山梨酯。
5.如权利要求1所述的组合物，其是脂质体分散体系形式。
6.如权利要求5所述的组合物，其中两亲性赋形剂是形成囊泡的磷脂。
7.如任何上述权利要求所述的组合物，其具有不高于约7的pH。
8.如任何上述权利要求所述的组合物，其还包含酸和/或抗氧化剂。
9.如权利要求1-8中任一项所述的组合物，其用作药物或用作器官或组织保存的制剂。
10.用于权利要求9所述用途的如权利要求1-8中任一项所述的组合物，其中该组合物是向器官或组织供者施用。
11.用于权利要求9所述用途的如权利要求1-8中任一项所述的组合物，其中该组合物是向器官或组织移植物受者施用。
12.用于权利要求11所述用途的如权利要求1-8中任一项所述的组合物，其中该组合物是经胃肠外施用。
13.非水性的药物组合物，其包含有效量的N-辛酰基多巴胺和生理学可接受的两亲性赋形剂，其适合于与生理学可接受的水性溶剂混合后获得如权利要求1-8中任一项所述的组合物。
14.N-辛酰基多巴胺，用于与钙神经素抑制剂联合处理来预防在移植物受者中的器官或组织的移植排斥。
15.用于如权利要求14所述用途的N-辛酰基多巴胺，其中钙神经素抑制剂的剂量低于在不存在N-辛酰基多巴胺联合处理的情况下的其有效剂量。
全文摘要
本发明提供了新的用于储存和保存移植物例如器官或组织异体移植物的水性组合物。该组合物包含以溶解形式的化合物N-辛酰基多巴胺。该组合物还可以作为移植物供者的预处理施用。此外，其可以用于移植物受者，任选地与免疫抑制剂组合。
文档编号A61P37/06GK103068370SQ201180039733
公开日2013年4月24日 申请日期2011年8月16日 优先权日2010年8月17日
发明者B·泰辛格, S·泰辛格, B·京特 申请人:诺瓦利克有限责任公司