专利名称:改善的IgG4类抗体的制作方法
改善的lgG4类抗体本发明涉及与野生型抗体相比较具有改变的二硫键排列的改善的抗体和产生所述改善的抗体的方法。包括重组蛋白质、单克隆抗体(mAb)和基于核酸的药物的生物药剂工业正在快速发展。抗体工程已导致抗体片段或替代形式的设计和产生。当选择基于抗体的蛋白质作为治疗剂时,要考虑优选的分子形式以及其它方面例如产品得率(production yield)、蛋白质质量和贮存稳定性。所有免疫球蛋白(Ig)分子的基本结构包含,通过二硫键偶联的两个相同的重链(HC)和两个相同的轻链(LC)。每一个LC由可变结构域(')和恒定结构域(CJ组成。基于HC,5个主要的Ig种类公认为:IgG、IgA、IgD、IgE和IgM0对于IgG7HC由一个可变结构域(Vh)和三个恒定结构域(Ch1-3)组成。(^和^^结构域形成了负责刺激效应子功能的分子的Fe部分,并且通过赋予IgG分子柔性的铰链区连接至Fab片段(Vh'和QA)。两个抗原识别位点位于' 和Vh结构域的末端。I gG还被细分成4个不同的同种型:I gG1、I gG2、IgG3 和 IgG4。Fe-介导的效应子功能,即抗体依赖性细胞毒性(ADCC)或补体依赖性细胞毒性(CDC),是同种型依赖性的。每一个同种型已进化来进行体内的特定功能。IgGl同种型因其延长的半衰期、增强的ADCC激活和补体激活而目前被最广泛地用作治疗剂。取决于靶和期望的作用,其它同种型也被当作治疗剂。例如,当仅中和靶抗原并且效应子功能不太重要时,可使用替代性同种型例如IgG2和IgG4。或者,可考虑具有再工程化的Fe/效应子功能的 IgG0IgG2也具有最小的相关效应子功能,且易于二聚化(这尚未被完全理解)。由于其相对缺乏效应子功能的诱导,因此IgG4仍然是有用的同种型。然而,IgG4还具有一些固有的使用难题,即其形成半抗体的倾向、其交换半分子的能力及其较短的血清半衰期。
在体外,IgG4分子符合典型的IgG结构,但在体内已观察到,它们形成各自包含单个轻链和单个重链的半分子(通过在铰链区内形成重链内二硫键而引起)。已观察到大百分比的循环IgG4是双特异性的,但功能上是单价的。这是因为半分子可与其它IgG4 半分子形成 IgG4 (Schuurman, J., Van Ree, R., Perdok, G.J., Van Doorn, H.R., Tan, Κ.Y.,Aalbersej R.C., 1999.Normal human immunoglobulin G4 is bispecific:1t has twodifferent antigen-combining sites.1mmunology 97,693-698)。可通过在铰链中的位置241 (根据Kabat编号系统编号的)上引入Ser至Pro的突变来减少 IgG4 半分子的形成(Angal, S.等人,1993.Asingle amino acid substitutionabolishes the heterogeneity of chimeric mouse/human(IgG4)antibody.Mol Tmmunol30,105-108)。此外,该点突变不影响IgG4的紧凑结构,从而使得IgG4能够保留其减弱的激活补体的能力。在发现S241P突变后,已研究了 IgG4的其它突变,以理解IgG4抗体的重链间相互作用,减弱IgG4的效应子功能并且增加结构稳定性。在Schuurman等人(Schuurman, J等A, 2001.The inter-heavy chain disulphide bonds of IgG4 are in equilibrium withintra-chain disulphide bonds.Molecular Immunology38, 1-8)中,使用 IgG4 突变体研究了观察到的IgG4的重链间二硫键的不稳定性。在突变体Ml中,参与重链-轻链间(Q-Chi)二硫键的Cys 131 (根据EU编号系统编号的或根据Kabat编号系统的Cys 127)被丝氨酸替代,并且发现该突变体导致轻链二聚体和重链二聚体的形成。在突变体M2中,参与铰链中的重链间二硫键的半胱氨酸226 (根据EU编号系统编号的226或根据Kabat编号系统的239)被丝氨酸替代,并且发现该突变体与IgG4相比较具有更稳定的重链间连接并且阻止重链内二硫键的形成。为了减少IgG4抗体的聚集物的形成,还已研究了 IgG4抗体的CH2和CH3结构域中的突变。US 2008/0063635 Takahashi等人已研究了这样的IgG4突变体,其中CH3结构域中的位置409 (根据EU编号系统编号的409或根据Kabat编号系统编号的440)上的精氨酸被赖氨酸、苏氨酸、甲硫氨酸或亮氨酸置换,以在低PH下抑制聚集物形成。为了减弱CDC活性,还教导了 L235、D265、D270、K322、P329和P331 (根据EU编号系统编号的L235、D265、D270、K322、P329 和 P331 或根据 Kabat 编号系统编号的 L248、D278、D283、K341、P348和P350)上的其它突变。W02008/145142 Van de Winkel等人公开了,即使在铰链区中的S228P (根据EU编号系统编号的S228或根据Kabat编号系统编号的S241)突变不存在的情况下,通过置换位置409上的精氨酸残基、位置405上的Phe残基或位置370上的Lys残基(根据EU编号系统编号的409、F405和K370或根据Kabat编号系统编号的R440、F436和K393),具有减弱的进行Fab-臂交换的能力的稳定的IgG4抗体。先前已研究了存在于抗体的铰链区中的半胱氨酸残基的数目的改变。US 5677425Bodmer等人公开了,为了有利于使用半胱氨酸巯基连接效应子或报道分子,可增加铰链区中半胱氨酸残基的数目。US 5677425还教导,为了有利于装配抗体分子,可将铰链区中的半胱氨酸残基的数目减少至I个(由于其仅是形成单个二硫键所必需的),这将为将铰链区连接至另一个铰链区或至效应子或报道分子提供特异性靶。然而,仍然需要提供具有使得它们甚至更适合用作治疗剂的改良的性质的新型抗体。本发明提供了与野生型抗体相比较具有有利性质(包括改善的生物物理性质)的新的突变型抗体。特别地,已 令人惊讶地发现,对与轻链中的半胱氨酸形成二硫键的IgG4抗体重链中的半胱氨酸残基位置的修饰提供了,与野生型IgG4抗体相比较,具有提高的稳定性的IgG4抗体。发明概述在一个方面,本发明提供了 IgG4类抗体,所述抗体包含至少一个含有C0I结构域和铰链区的重链,其中在每一个重链中:a.ChI结构域中根据Kabat编号系统编号的位置127上的链间半胱氨酸被另一个
氨基酸置换;和b.位于上铰链区(upper hinge region)中的一个或多个氨基酸被半胱氨酸置换。与轻链中的半胱氨酸形成链间二硫键的ChI结构域中的半胱氨酸为根据Kabat编号系统编号的位置127上的半胱氨酸,且示于
图1b中。改变IgG4恒定区中的二硫键的位置导致,对于Fab结构域观察到更高的Tm。50%的蛋白质解折叠时的温度被指定为Tm。根据实验,Tm被测定为例如突光-对-温度曲线的拐点(即,荧光-对-温度曲线最陡峭时的温度)。
因此,更高的Tm反映出更高的热稳定性。因此,本公开内容的分子具有更高的热稳定性。然而,不希望受理论束缚,这可以是因为所获得的二硫键或多肽分子的应力(strain)或内部张力的减小。还可通过将其它修饰引入IgG4恒定区来获得热稳定性的进一步提高。位于上铰链区中的被半胱氨酸置换的一个或多个氨基酸可选自根据Kabat编号系统编号的226、227、228、229、230、237和238,如图1b中显示的(上铰链区中以下划线标示的氨基酸)。在优选实施方案中,位于上铰链区中的被半胱氨酸置换的一个或多个氨基酸为选自根据Kabat编号系统编号的227、228、229和230的位置上的氨基酸中的一个或多个,如图1b和2a中显示的。在该较后的排列中,随后形成的链间(轻链-重链)二硫键的位置与IgGl恒定区中发现的_■硫键类似。本发明人已确定,IgGl在Fab和Fe结构域中具有比IgG4分子更高的热稳定性。然而,本公开内容使得能够提供不具有ADCC效应子功能但具有如IgGl分子的热稳定性和/或其它有利性质的IgG4分子。显示存在影响形成的IgG4分子中的Fab结构域的稳定性的3个一般方面。第一个方面是二硫桥的位置。第二个方面是靠近二硫桥的环境,即二硫键周围的残基的性质,第三个方面是上铰链区的长度。因此,本发明还提供了,包含具有上铰链、核心和下铰链(1werhinge)的重链的IgG4抗体,并且其中重链或每一个重链中的所述上铰链和核心在长度上为13至17个,例如15个氨基酸。在一个实施方案中,IgG4抗体具有长度为15个氨基酸的上铰链和核心。在一个实施方案中,上铰链和核心包含在IgG4铰链中发现的天然12个氨基酸和3个其它的氨基酸,例如3个丙氨酸残基或3个甘氨酸残基或其组合。在一个实施方案 中,铰链具有下列序列之一:
权利要求
1.一种IgG4类抗体,其包含至少一个含有(^1结构域和铰链区的重链,其中在每一个重链中: a.所述ChI结构域中的根据Kabat编号系统编号的位置127上的链间半胱氨酸被另一种氨基酸置换;和 b.位于上铰链区的一个或多个氨基酸被半胱氨酸置换。
2.权利要求1的抗体,其中位于上铰链区中的被半胱氨酸置换的一个或多个氨基酸选自根据Kabat编号系统编号的227、228、229和230。
3.权利要求2的抗体,其中根据Kabat编号系统编号的位置230上的甘氨酸被半胱氨酸置换。
4.权利要求2的抗体,其中根据Kabat编号系统编号的位置229上的酪氨酸被半胱氨酸置换。
5.权利要求2的抗体,其中根据Kabat编号系统编号的位置228上的赖氨酸被半胱氨酸置换。
6.权利要求2的抗体,其中根据Kabat编号系统编号的位置227上的丝氨酸被半胱氨酸置换。
7.权利要求1至6的任一项的抗体,其中重链中根据Kabat编号系统编号的位置239上的半胱氨酸和位置242上的 半胱氨酸被另一种氨基酸置换。
8.权利要求1至6的任一项的抗体,其中重链中根据Kabat编号系统编号的位置239上的半胱氨酸被另一种氨基酸置换。
9.权利要求1至6的任一项的抗体,其中重链中根据Kabat编号系统编号的位置242上的半胱氨酸被另一种氨基酸置换。
10.一种IgG4类抗体,其包含至少一个含有(^1结构域和铰链区的重链,其中在每一个重链中: a.根据Kabat编号系统编号的的位置127上的链间半胱氨酸被另一种氨基酸置换;和 b.根据Kabat编号系统编号的位置239上的半胱氨酸或位置242上的半胱氨酸被另一种氨基酸置换。
11.权利要求7至10的任一项的抗体,其中位置239上的半胱氨酸和/或位置242上的半胱氨酸被不含巯基的氨基酸置换。
12.权利要求11的抗体,其中所述不含巯基的氨基酸是丝氨酸。
13.前述权利要求任一项的抗体,其中位置127上的半胱氨酸被不含巯基的氨基酸置换。
14.权利要求13的抗体,其中所述不含巯基的氨基酸是丝氨酸。
15.前述权利要求任一项的抗体,其中所述重链经突变以在根据Kabat编号系统编号的氨基酸226与243之间插入3个氨基酸。
16.权利要求15的抗体,其中所述重链经突变以在根据Kabat编号系统编号的位置238与239之间插入3个氨基酸。
17.权利要求16的抗体,其中在根据Kabat编号系统编号的位置238与239之间插入3个丙氨酸。
18.权利要求16的抗体,其中在根据Kabat编号系统编号的位置238与239之间插入苏氨酸、组氨酸和另外的苏氨酸。
19.前述权利要求任一项的抗体,其中根据Kabat编号系统编号的位置241上的丝氨酸被脯氨酸置换。
20.前述权利要求任一项的抗体,其中位置230上的甘氨酸被半胱氨酸置换,位置227上的丝氨酸被脯氨酸置换,位置229上的酪氨酸被丝氨酸置换,位置237上的脯氨酸被天冬氨酸置换,位置238上的脯氨酸被赖氨酸置换,氨基酸序列苏氨酸-组氨酸-苏氨酸被插入在位置238与239之间,并且位置241上的丝氨酸被脯氨酸置换。
21.前述权利要求任一项的抗体,其中所述重链包含CH2结构域和CH3结构域。
22.前述权利要求任一项的抗体,其中所述抗体包含两条如先前任一权利要求中所定义的重链。
23.权利要求22的抗体,其中所述重链是相同的。
24.权利要求1至23的任一项的抗体,其中所述重链或每一个重链包含长度为12至17个氨基酸的上铰链区和核心区。
25.权利要求24的抗体,其中上铰链和核心区的长度为15个氨基酸。
26.一种表达载体,其包含编码如权利要求1至25的任一项中所定义的抗体的序列。
27.—种宿主细胞,其包含权利要求26中定义的载体。
28.权利要求1至25的任一项中定义的抗体,其用于治疗疾病或障碍。
29.一种用于治疗疾病 或障碍的方法,其包括施用治疗有效量的权利要求1至25任一项中定义的抗体。
30.一种包含重链的IgG4抗体,所述重链具有上铰链、核心和下铰链,并且其中所述重链或每一个重链的所述上铰链和核心的长度为12至17个氨基酸,例如15个氨基酸。
全文摘要
本发明提供了IgG4类抗体,其包含至少一个含有CH1结构域和铰链区的重链,其中在每一个重链中a.所述CH1结构域中根据Kabat编号系统编号的位置127上的链间半胱氨酸被另一种氨基酸置换;并且,b.位于上铰链区中的一个或多个氨基酸被半胱氨酸置换。
文档编号A61K39/395GK103097410SQ201180040277
公开日2013年5月8日 申请日期2011年8月19日 优先权日2010年8月20日
发明者D·P·汉弗莱斯, S·J·彼得斯, R·亚当斯, J·黑兹 申请人:Ucb医药有限公司