专利名称：靶向半乳糖神经酰胺表达因子-1的肿瘤增殖控制方法
技术领域：
本发明涉及靶向半乳糖神经酰胺表达因子-1的抗肿瘤剂和抑制肿瘤增殖的方法。
背景技术：
半乳糖神经酰胺(GalCer)是由I个半乳糖残基和I个神经酰胺残基组成的最小的鞘糖脂，在髓鞘少突胶质细胞和/或肾上皮细胞中大量表达，是具有绝缘机能、耐受高盐浓度机能的糖脂。半乳糖神经酰胺表达因子-1 (GalCer Expression Factor-1 (GEF-1))是半乳糖神经酰胺的表达因子(Ogura，K.等人，J.Neurochem.,71,1827-1836，1998)，是由具有锌指序列(FYVE)的区域(Z)、富含脯氨酸的区域(P)、卷曲-卷曲序列区域(C)、富含脯氨酸2/富含谷氨酰胺的区域(Q)这4个区域组成的蛋白质。此外，大鼠GEF-1是小鼠Hrs (HGF调节酪氨酸激酶底物，HGF-regulated tyrosine kinase substrate)的大鼠同源物(Komada,Μ.等人，Mol.Cell Biol.，15，6213-6221，1995)，已知参与小泡转运和胞内信号传导。本发明人已发现，GEF-1/Hrs对于MDCK细胞显示出成纤维细胞样的形态变化，还发现GEF-1/Hrs与细胞的迁移性相关(特开2005-247735号公报)。然而，GEF-1/Hrs及其缺失了 Q区域的突变，没有表现出抑制肿瘤增殖的作用(特开2005-247735号公报)。已知肿瘤在增殖过程中，为了弥补低氧和营养缺乏，而释放VEGF、TGF-β等诱导血管形成因子，诱导向肿瘤形成血管。因此，为了抑制肿瘤增殖，考虑抑制所述肿瘤性血管形成的对策。然而，目前尚不清楚GEF-1/Hrs与血管形成之间的关系。
发明内容
鉴于上述情况，本发明要解决的问题是提供具有抑制血管形成作用和/或抑制肿瘤增殖作用的抗肿瘤剂和抑制肿瘤增殖的方法。本发明人为了解决上述问题进行了深入的研究，结果发现了 GEF-1参与血管形成和肿瘤增殖。从而发现了通过抑制GEF-1的表达，可以抑制血管形成和肿瘤增殖，完成了本发明。换言之，本发明内容如下。I肿瘤增殖抑制剂，其含有下述多肽:该多肽是在去除了半乳糖神经酰胺表达因子-1的Q区的多肽中、至少含有C区或其一部分的多肽。2肿瘤增殖抑制剂，其含有下列(a)或(b)的多肽:(a)由序列号8、10或12所示氨基酸序列组成的多肽，(b)由在序列号8、10或12所示氨基酸序列中缺失、取代或添加I个或多个氨基酸而成的氨基酸序列组成、且具有抑制肿瘤增殖作用的多肽。3肿瘤增殖抑制剂，其含有下列(a)或(b)的多肽:(a)含有序列号8、10或12所示氨基酸序列中的至少10个连续的氨基酸残基的多肽，(b)由下列氨基酸序列组成、且具有抑制肿瘤增殖作用的多肽，该氨基酸序列是在含有序列号8、10或12所示氨基酸序列中的至少10个连续的氨基酸残基的氨基酸序列中缺失、取代或添加I个或多个氨基酸而形成的。4上述3记载的肿瘤增殖抑制剂，其中，上述(a)中记载的多肽含有序列号44-65中任一项所示的氨基酸序列。
5肿瘤增殖抑制剂，其含有编码下述多肽的多核苷酸，该多肽是在去除了半乳糖神经酰胺表达因子-1的Q区的多肽中、至少含有C区或其一部分的多肽。6肿瘤增殖抑制剂，其含有编码下列(a)或(b)的多肽的多核苷酸，(a)由序列号8、10或12所示氨基酸序列组成的多肽，(b)由在序列号8、10或12所示氨基酸序列中缺失、取代或添加I个或多个氨基酸而成的氨基酸序列组成、且具有抑制肿瘤增殖作用的多肽。7肿瘤增殖抑制剂，其含有编码下列(a)或(b)的多肽的多核苷酸，(a)含有序列号8、10或12所示氨基酸序列中的至少10个连续的氨基酸残基的多肽，(b)由下列氨基酸序列组成、且具有抑制肿瘤增殖作用的多肽，该氨基酸序列是在含有序列号8、10或12所示氨基酸序列中的至少10个连续的氨基酸残基的氨基酸序列中缺失、取代或添加I个或多个氨基酸而形成的。8肿瘤增殖抑制剂，其含有下列(a)或(b)的多核苷酸:(a)由序列号7、9或11所示碱基序列组成的多核苷酸，(b)与由下列碱基序列组成的多核苷酸在严格条件下杂交、且编码具有抑制肿瘤增殖作用的多肽的多核苷酸，所述碱基序列是与序列号7、9或11所示碱基序列互补的碱基序列。9肿瘤增殖抑制剂，其含有抑制半乳糖神经酰胺表达因子-1表达的物质。10上述9记载的肿瘤增殖抑制剂，其中，所述抑制半乳糖神经酰胺表达因子-1表达的物质是针对编码半乳糖神经酰胺表达因子-1的多核苷酸的SiRNA或shRNA。11上述10记载的肿瘤增殖抑制剂，其中，所述编码半乳糖神经酰胺表达因子-1的多核苷酸含有编码下列(a)或(b)的多肽的碱基序列，(a)由序列号2、4或6所示氨基酸序列组成的多肽，(b)由在序列号2、4或6所示氨基酸序列中缺失、取代或添加I个或多个氨基酸而成的氨基酸序列组成、且具有抑制肿瘤增殖作用的多肽。12上述10记载的肿瘤增殖抑制剂，其中，所述编码半乳糖神经酰胺表达因子-1的多核苷酸含有下列(a)或(b)的多核苷酸:(a)由序列号1、3或5所示碱基序列组成的多核苷酸，(b)与由下列碱基序列组成的多核苷酸在严格条件下杂交、且编码具有抑制肿瘤增殖作用的多肽的多核苷酸，所述碱基序列是与序列号1、3或5所示碱基序列互补的碱基序列。13血管形成抑制剂，其含有下述多肽:该多肽是在去除了半乳糖神经酰胺表达因子-1的Q区的多肽中、至少含有C区或其一部分的多肽。
14血管形成抑制剂，其含有下列(a)或(b)的多肽:(a)由序列号8、10或12所示氨基酸序列组成的多肽，(b)由在序列号8、10或12所示氨基酸序列中缺失、取代或添加I个或多个氨基酸而成的氨基酸序列组成、且具有抑制血管形成作用的多肽。15血管形成抑制剂，其含有下列(a)或(b)的多肽:(a)含有序列号8、10或12所示氨基酸序列中的至少10个连续的氨基酸残基的多肽，(b)由下列氨基酸序列组成、且具有抑制血管形成作用的多肽，该氨基酸序列是在含有序列号8、10或12所示氨基酸序列中的至少10个连续的氨基酸残基的氨基酸序列中缺失、取代或添加I个或多个氨基酸而形成的。16
上述15记载的血管形成抑制剂，其中，上述(a)中记载的多肽含有序列号44-65中任一项所示的氨基酸序列。17血管形成抑制剂，其含有编码下述多肽的多核苷酸，该多肽是在去除了半乳糖神经酰胺表达因子-1的Q区的多肽中、至少含有C区或其一部分的多肽。18血管形成抑制剂，其含有编码下列(a)或(b)的多肽的多核苷酸，(a)由序列号8、10或12所示氨基酸序列组成的多肽，(b)由在序列号8、10或12所示氨基酸序列中缺失、取代或添加I个或多个氨基酸而成的氨基酸序列组成、且具有抑制血管形成作用的多肽。19血管形成抑制剂，其含有编码下列(a)或(b)的多肽的多核苷酸，(a)含有序列号8、10或12所示氨基酸序列中的至少10个连续的氨基酸残基的多肽，(b)由下列氨基酸序列组成、且具有抑制血管形成作用的多肽，该氨基酸序列是在含有序列号8、10或12所示氨基酸序列中的至少10个连续的氨基酸残基的氨基酸序列中缺失、取代或添加I个或多个氨基酸而形成的。20血管形成抑制剂，其含有下列(a)或(b)的多核苷酸:(a)由序列号7、9或11所示碱基序列组成的多核苷酸，(b)与由下列碱基序列组成的多核苷酸在严格条件下杂交、且编码具有抑制血管形成作用的多肽的多核苷酸，所述碱基序列是与序列号7、9或11所示碱基序列互补的碱基序列。21血管形成抑制剂，其含有抑制半乳糖神经酰胺表达因子-1表达的物质。22上述21记载的血管形成抑制剂，其中，所述抑制半乳糖神经酰胺表达因子-1表达的物质是针对编码半乳糖神经酰胺表达因子-1的多核苷酸的SiRNA或shRNA。23上述22记载的血管形成抑制剂，其中，所述编码半乳糖神经酰胺表达因子-1的多核苷酸含有编码下列(a)或(b)的多肽的碱基序列，(a)由序列号2、4或6所示氨基酸序列组成的多肽，(b)由在序列号2、4或6所示氨基酸序列中缺失、取代或添加I个或多个氨基酸而成的氨基酸序列组成、且具有诱导血管形成作用的多肽。24上述22记载的血管形成抑制剂，其中，所述编码半乳糖神经酰胺表达因子-1的多核苷酸含有下列(a)或(b)的多核苷酸:
(a)由序列号1、3或5所示碱基序列组成的多核苷酸，(b)与由下列碱基序列组成的多核苷酸在严格条件下杂交、且编码具有诱导血管形成作用的多肽的多核苷酸，所述碱基序列是与序列号1、3或5所示碱基序列互补的碱基序列。25癌细胞特性消除剂，其含有下列(a)或(b)的多肽:(a)由序列号8、10或12所示氨基酸序列组成的多肽，(b)由在序列号8、10或12所示氨基酸序列中缺失、取代或添加I个或多个氨基酸而成的氨基酸序列组成、且具有消除癌细胞特性作用的多肽。26上述25记载的癌细胞特性消除剂，其是使癌细胞获得接触抑制能力的癌细胞特性消除剂。27抑制肿瘤增殖的方法，该方法包括:抑制半乳糖神经酰胺表达因子-1的表达。28抑制血管形成的方法，该方法包括:抑制半乳糖神经酰胺表达因子-1的表达。通过本发明，可以提供含有下述多肽的抗肿瘤剂，该多肽是在去除了半乳糖神经酰胺表达因子-1的Q区的多肽中、至少含有C区或其一部分的多肽。此外，通过本发明，可以提供含有抑制半乳糖神经酰胺表达因子-1表达的物质的抗肿瘤剂。由于除了抑制癌转移的作用外，本发明还具有抑制血管形成作用和/或抑制肿瘤增殖的作用，因此作为抗肿瘤剂是非常有效的。
附图简介
图1是显示GEF-1的结构的模式图。图2A 是显示 B16 细胞、B16/bsr 细胞、B16/GEF-1 细胞、B16/C 细胞和 B16/shRNA细胞的集落形态的图。图2B是显示给予B16细胞、B16/GEF-1细胞、B16/C细胞和B16/shRNA细胞后第21天的肺转移图像的图。图中的“ HE ”表示HE染色图像。图2C是显示给予B16细胞、B16/bsr细胞、B16/GEF-1细胞、B16/C细胞和B16/shRNA细胞后的小鼠生存天数的图。图3是显示管腔形成实验的结果的图。A)显示了 KOP细胞和K0P/C细胞的管腔形成结果。B)显示了 MDCK/GEF-1细胞、MDCK细胞和MDCK/C细胞的管腔形成结果。图4是显示在小鼠背部皮下(体内)的血管形成的诱导和抑制结果的图。上图显示了血管形成的情况，下图显示了血管长度和血管面积的测量结果。图5是显示B16/C细胞在体外增殖能力的测量结果的图。图6是显示B16/C细胞的细胞密度和细胞周期的测量结果的图。图7是显示用于测量转录因子活性和启动子活性的载体的构造的模式图。图8是显示HGF和TGF- β对MDCK/GEF-1细胞和MDCK/C细胞的SMAD转录活性的影响的测量结果的图。 图9是显示MDCK细胞/GEF-1细胞和MDCK/C细胞中的各转录因子的活性的测量结果的图。
图10是显示B16细胞/GEF-1细胞、B16/shRNA细胞和B16/C细胞中的各转录因子的活性的测量结果的图。图11是显示B16/bsr细胞、B16细胞/GEF-1细胞和B16/C细胞中的TGF-P-SMAD信号诱导性的PA1-1启动子活性的测量结果的图。图12是显示培养基中所含的TGF-β变化量的测量结果的图。图13Α是显示Β16细胞/GEF-1细胞和B16/C细胞在软琼脂培养基中的增殖能力的测量结果的图。上图是显示集落形成的情况，下图是显示集落数的相对值的测量结果的图。图13Β是显示LLC/C细胞在软琼脂培养基中的增殖能力的测量结果的图。上图是显示集落形成的情况，下图是显示集落数的相对值的测量结果的图。图13C是显示MDCK细胞和MDCK/GEF-1细胞在软琼脂培养基中的增殖形态的图。图14Α是显示Β16细胞/GEF-1细胞、B16/shRNA细胞和B16/C细胞在C57BL/6小鼠中的肿瘤形成/增殖能力的测量结果的图。图14B是显示MDCK细胞和MDCK/GEF-1细胞在裸鼠中的肿瘤形成/增殖能力的测
量结果的图。图15是显示GEF-1siRNA的抑制管腔形成的效果的研究结果图。上图显示导入了siRNA的细胞的管腔形成情况，下图显示了管腔形成率的相对值的测量结果。图16是显示GEF_lsiRNA#3在体内抑制肿瘤增殖的效果的研究结果图。左图显示了肿瘤体积和肿瘤重量 的测量结果，右图显示了在裸鼠中形成的肿瘤的外观。图17是显示GEF-1/C组成寡肽的模式图。图18A是显示GEF-1/C组成寡肽对B16细胞的SMAD转录活性的影响的测量结果的图。图18B是显示GEF-1/C组成寡肽对C0L0205细胞的SMAD转录活性的影响的测量结果的图。图19是显示GEF-1/C组成寡肽对KOP细胞的管腔形成的影响的测量结果的图。图20A是显示GEF-1/C组成寡肽对B16细胞在软琼脂培养基中的增殖的影响的测量结果的图。图20B是显示GEF-1/C组成寡肽对HeLa细胞在软琼脂培养基中的增殖的影响的测量结果的图。图20C是显示GEF-1/C组成寡肽对C0L0205细胞在软琼脂培养基中的增殖的影响的测量结果的图。图20D是显示GEF-1/C组成寡肽对ΚΑΤΟΠΙ细胞在软琼脂培养基中的增殖的影响的测量结果的图。图2IA是显示GEF-1/C组成寡肽对Α549细胞在软琼脂培养基中的增殖的影响的测量结果的图。图2IB是显示GEF-1/C组成寡肽对ΡΤ45细胞在软琼脂培养基中的增殖的影响的测量结果的图。图22是显示使用Β16细胞，GEF-1/C组成寡肽在体内抑制肿瘤增殖的效果的研究结果的图。左图显示了肿瘤体积和肿瘤重量的测量结果，右图显示了在裸鼠中形成的肿瘤的外观。图23是显示使用C0L0205细胞，GEF-1/C组成寡肽在体内抑制肿瘤增殖的效果的研究结果的图。左图显示了肿瘤体积和肿瘤重量的测量结果，右图显示了在裸鼠中形成的肿瘤的外观。图24是显示使用A549细胞，GEF-1/C组成寡肽在体内抑制肿瘤增殖的效果的研究结果的图。左图显示了肿瘤体积和肿瘤重量的测量结果，右图显示了在裸鼠中形成的肿瘤的外观。图25是显示EL4/C细胞在体外的增殖能力的测量结果的图。图26是 显示PT45/C细胞在软琼脂培养基中的增殖能力的测量结果的图。上图显示了集落形成的情况，下图显示了集落数的相对值的测量结果。图27是显示C0L0205/C细胞在软琼脂培养基中的增殖能力的测量结果的图。上图显示了集落形成的情况，下图显示了集落数的相对值的测量结果。图28是显示使用C0L0205细胞，结合了细胞膜透过肽的GEF-1/C组成寡肽(r9-0P10-ll)在体内抑制肿瘤增殖的效果的研究结果的图。左图显示了肿瘤体积变化和肿瘤湿重的测量结果，右图显示了在裸鼠中形成的肿瘤的外观。发明的
具体实施例方式下面详细的说明本发明。下列实施方式是用于说明本发明的示例，本发明并非旨在限于这些实施方式。在不脱离其精神的条件下，本发明可以实施多种方式。此外，本说明书包含了作为本申请优先权基础的、于2010年6月25日提交的日本专利申请(特愿2010-144763号)的说明书和附图中记载的内容。1、概述半乳糖神经酰胺表达因子-1(GEF-1)是诱导半乳糖神经酰胺的表达的因子(Ogura, K.等人，J.Neurochem., 71,1827-1836,1998)。本发明人之前已经通过表达包含GEF-1的C区、且不含Q区的多肽，成功抑制了癌细胞的转移能力(特开2005-247735号公报)。另一方面，所述多肽没有显著抑制肿瘤增殖(同一公报)。然而，本发明人再次研究了 GEF-1对于肿瘤增殖的效果，结果发现GEF-1促进肿瘤增殖。此外，研究了 GEF-1对血管形成的效果，结果发现GEF-1还促进血管形成。针对GEF-1的C区的效果的研究结果发现，通过表达GEF-1的C区或其组成寡肽，可以抑制肿瘤增殖和血管形成。此外发现，通过使用抑制GEF-1表达的物质抑制GEF-1的表达，可以抑制肿瘤增殖和血管形成。基于上述结果，GEF-1的C区多肽、其组成多肽以及抑制GEF-1表达的物质，兼具抑制癌细胞转移、抑制血管形成和抑制肿瘤增殖这3种效果，显示作为抗肿瘤剂是非常有效的。此外，本发明的抗肿瘤剂不仅通过抑制肿瘤血管形成从而间接的抑制癌细胞转移和肿瘤增殖，还通过抑制癌细胞自身的迁移性而直接抑制癌转移，而且通过抑制与癌细胞的肿瘤增殖相关的转录因子的表达从而直接抑制肿瘤增殖。因此，本发明的抗癌剂可以发挥上述3种效果的协同效果，对于治疗癌症或肿瘤是非常有效的。2、半乳糖神经酰胺表达因子-1(I)半乳糖神经酰胺表达因子-1的功能GEF-1具有使GalCer及其硫酸化衍生物硫苷酯(sulfatide)在源自上皮细胞的MDCK细胞中高度表达的功能。此外，还具有在MDCK细胞中诱导上皮细胞-间充质细胞转换(Epithelial-Mesenchymal Transition(EMT)),使其变为成纤维细胞样形态的功能。上皮细胞-间充质细胞转换(EMT)是指由Wnt等信号诱导的在胚胎形态建成初期必需的过程，是与癌细胞转移中的浸润和血管内迁移有极大关系的过程(Bean，A.等人，Nature, 385,826-829,1997)。实际上，已知在作为癌细胞的小鼠黑素瘤B16细胞中表达GEF-1时，促进癌细胞的转移。此外，GEF-1具有诱导血管形成作用和肿瘤增殖作用。(2) GEF-1 多狀本发明中使用的GEF-1多肽没有特殊的限制，可以源自大鼠、人、小鼠中的任一种。大鼠GEF-1是小鼠或人的HGF调节酪氨酸激酶底物(下文称为“Hrs”或“Hgs”)的同源物。大鼠GEF-1和小鼠Hrs、大鼠GEF-1和人Hrs、小鼠Hrs和人Hrs的氨基酸序列同源性如下。(a)大鼠GEF-1和小鼠Hrs的氨基酸序列同源性为97%，(b)大鼠GEF-1和人Hrs的氨基酸序列同源性为93%，(c)小鼠Hrs和人Hrs的氨基酸序列同源性为93%。因此，本发明中使用的GEF-1多肽涵盖源自大鼠的GEF-1多肽、源自人的Hrs多肽、源自小鼠的Hrs多肽。源自大鼠、源自人、源自小鼠的GEF-1 (Hrs)多肽的氨基酸序列分别用序列号2、4、6显示。此外，编码源自大鼠、源自人、源自小鼠的GEF-1的多核苷酸的碱基序列分别用序列号1、3、5显示。 上述碱基序列和氨基酸序列都登录在GenBank中。各种GEF-1 (Hrs)的碱基序列和氨基酸序列的GenBank登录号如下所示。大鼠GEF-1 (序列号 1、2):AB002811,人Hrs(序列号 3、4):U43895，小鼠Hrs (序列号 5、6):D50050。用于本发明中的GEF-1多肽涵盖由上述序列号2、4或6所示氨基酸序列组成的多肽以外，还包括由在序列号2、4或6所示氨基酸序列中缺失、取代或添加(或其组合)I个或多个氨基酸而变异成的氨基酸序列组成，且具有诱导血管形成作用或肿瘤增殖作用的多肽。在上述序列号2、4或6所示氨基酸序列中，缺失、取代或添加(或其组合)I个或多个氨基酸而变异成的氨基酸序列可列举例如:(i)序列号2、4或6所示氨基酸序列中的1-10个(例如，1_5个，优选1_3个，更优选1-2个，更优选I个)氨基酸缺失而成的氨基酸序列，(ii)序列号2、4或6所示氨基酸序列中的1-10个(例如，1_5个，优选1_3个，更优选1-2个，更优选1个)氨基酸被其他的氨基酸取代而成的氨基酸序列，(iii)在序列号2、4或6所示氨基酸序列中添加1-10个(例如，1_5个，优选1_3个，更优选1-2个，更优选I个)氨基酸而成的氨基酸序列，(iv)由所述(i)-(iii)组合而成的变化的氨基酸序列等。在本发明中，“诱导血管形成作用”意指在体外诱导管腔形成的作用，或在体内诱导血管形成的作用。此外，“肿瘤增殖作用”意指促进癌细胞增殖的作用。此外，“具有诱导血管形成作用或肿瘤增殖作用”意指，与将具有序列号2、4或6所示氨基酸序列的多肽的诱导血管形成作用或肿瘤增殖作用作为100时相比，具有10%以上、20%以上、30%以上、40%以上、50%以上、60%以上、70%以上、80%以上，优选90%以上的活性。诱导血管形成的作用可以通过公知的方法，例如使MDCK细胞表达突变多肽，针对相比于对照MDCK细胞而言管腔形成能力是否亢进来进行实验从而确定。此外，使用在小鼠背部皮下诱导血管形成的实验(DAS方法)，通过测量血管长度和血管面积，可以测量诱导血管形成的作用。此外，可以使得在任何癌细胞中表达突变多肽，通过用公知的方法测量肿瘤的增殖量，测量肿瘤增殖作用。作为为了制备具有上述突变的多肽而将突变导入到多核苷酸中的方法，可以使用利用了 Kunkel法或Gapped duplex法等位点特异性突变诱发方法的导入突变试剂盒，例如QuikChange 定点诱变试剂盒(Stratagne公司生产)、GeneTailor 定点诱变系统(Invitrogen 公司生产)、TaKaRa 定点诱变系统(Mutan-K、Mutan-Super Express Km 等:TaKaRa Bio 公司生产)等。此外,可以使用 Molecular Cloning, A Laboratory Manual,第 2版(Cold Spring Harbor Press (1989)) ；Current Protocols in Molecular Biology (Johnffiley&Sons(19 87-1997)) ；Kunkel(1985)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA82:488-92 ；Kramer 和FritZ (1987)Method.Enzymol.154:350-67 ；Kunkel (1988)Method.Enzymol.85:2763-6 等记载的位点特异性诱变法等方法。此外，用于本发明中的GEF-1多肽涵盖上述序列号2、4或6所示氨基酸序列，还包括具有与序列号2、4或6所示氨基酸序列有约85%以上，优选约90%以上，更优选约93%以上的同源性的氨基酸序列，且具有诱导血管形成作用或肿瘤增殖作用的多肽(与序列号2、
4、6所示氨基酸序列实质上相同的氨基酸序列)。同源性可以在利用因特网的同源性检索网址(例如日本DNA数据库(DDBJ))中，利用FASTA、BLAST、PS1-BLAST等同源性检索。此外，可以在国家生物学信息中心(National Center for Biotechnology Information(NCBI))中，利用BLAST进行检索。(3)编码GEF-1的多核苷酸如上所述，大鼠GEF-1是小鼠或人Hrs的同源物。因此，编码本发明的GEF-1的多核苷酸涵盖编码Hrs的多核苷酸,例如编码人和小鼠Hrs的多核苷酸(序列号3和5),还包括编码由序列号4和6所示氨基酸序列组成的人和小鼠Hrs的多肽的多核苷酸。此外，还包括编码大鼠Hrs的多核苷酸。在本发明中，就编码GEF-1的多核苷酸而言，除了序列号1、3或5所示碱基序列之夕卜，只要是包含编码上述GEF-1多肽的碱基序列的多核苷酸即可，也没有特殊的限制。例如，除了编码由序列号2、4或6所示氨基酸序列组成的多肽的多核苷酸以外，编码下述多肽的多核苷酸也可用于本发明中，该多肽是由在序列号2、4或6所示氨基酸序列中缺失、插入、取代或添加I个或多个氨基酸而成的氨基酸序列组成的突变多肽、且是具有诱导血管形成作用或肿瘤增殖作用的多肽。在本文中，“多核苷酸”是指由多个脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)等碱基或碱基对组成的聚合物，包括DNA、cDNA、基因组DNA、化学合成DNA和RNA。此外，还包括必要时含有非天然的人工碱基的多核苷酸。编码本发明的GEF-1的多核苷酸包括由序列号1、3或5所示碱基序列组成的多核苷酸，或者是与由下列碱基序列组成的多核苷酸在严格条件下杂交、且编码具有抑制肿瘤增殖作用的多肽的多核苷酸，所述碱基序列是与序列号1、3或5所示碱基序列互补的碱基序列。这样的多核苷酸可以以由序列号1、3或5所示碱基序列组成的多核苷酸或其片段作为探针，通过集落杂交、噬斑杂交、Southern印记等公知的杂交方法，由人的cDNA文库或基因组文库获得。制备cDNA文库的方法可参见Molecular Cloning, A Laboratory Manual,第2版(Cold Spring Harbor Press (1989))。此外，也可以使用市售的cDNA文库或基因组文库。在本发明的杂交条件中，作为严格条件，可列举例如“2XSSC、0.1%SDS、25°C”、“1XSSC、0.1%SDS、25°C”、“0.2XSSC、0.1%SDS、42°C”，作为更严格的条件，可列举例如“0.1XSSC、0.1%SDS、68°C”等条件。除上述缓冲液的盐浓度、温度等条件外，本领域技术人员可以增加其他的各种条件如探针浓度、探针长度、反应时间等，来设定用于获得编码本发明的GEF-1基因的多核苷酸的条件。杂交方法的详细步骤可参见Molecular Cloning, A Laboratory Manual,第2版(Cold Spring Harbor Press (1989);特别是 9.47_9.58 章节)；Current Protocols inMolecular Biology (John ffiley&Sons (1987-1997);特别是 6.3_6.4 章节)等。本发明的多核苷酸的碱基序列可以通过常用的序列确定方法来确定。例如可以通过双脱氧核苷酸链终止测序法(Sanger等人，(1977) Proc.Natl.Acad.Sc1.USA74:5463)等进行。此外，还可以使用适当的DNA测序仪(例如,ABI PRISM (Applied Biosystem公司))来解析序列。3、GEF-1 的 C 区和 Q 区(I)GEF-1的C区和Q区的功能GEF-1蛋白质，如图1所示，是由自氨基末端依次是具有锌指序列(FYVE)的区域(Z)、富含脯氨酸的区域(P)、卷曲-卷曲序列区域(C)和富含脯氨酸2/谷氨酰胺的区域(Q)这4个区域组成的蛋白质。
至少含有GEF-1的C-Q区的多肽具有诱导EMT的能力，而不含Q区但含有C区的多肽(例如，ZPC、PC、C)具有抑制EMT诱导的活性。此外，在使用了 transwell小室的体外细胞迁移实验中，表达全长GEF-1 (ZPCQ)的细胞，迁移能力增加，另一方面，采用缺少Q区且含有C区的GEF-1突变体(ZPC、PC、C)时，其迁移能力则显著降低，特别是表达C区的细胞，迁移能力显著降低(特开2005-247735号公报)。进一步的，如后文实施例记载的，GEF-1的C区的多肽抑制癌细胞的转移。因此，在去除了 GEF-1的Q区的多肽中、至少含有C区的多肽，S卩，GEF-1的ZPC区，优选PC区，更优选C区的多肽，具有抑制癌细胞转移的作用。此外，GEF-1的C区的多肽，具有抑制血管形成作用和抑制肿瘤增殖作用。(2)在去除了 GEF-1的Q区的多肽中、至少含有C区的多肽在本发明中，“在去除了半乳糖神经酰胺表达因子-1的Q区的多肽中、至少含有C区的多肽”表示，不含GEF-1的Q区，且含有C区的多肽。作为这样的多肽，除GEF-1的C区的多肽(GEF-1/C)外，还可列举在C区的氨基末端侧含有P区的全长或一部分的多肽(GEF-1/PC)、在PC区的氨基末端侧含有Z区的全长或一部分的多肽(GEF-1/ZPC)，优选C区的多肽(GEF-1/C)。基于下表I和上述的突变体制备方法，本领域技术人员可以容易的制备GEF-1/ZPC、GEF-1/PC和GEF-1/C的各个多肽及其突变体。序列号2、序列号4和序列号6所示氨基酸序列中的Z、p、c和Q区的位置显示在下表I中。[表1]GEF-1/Hrs的全长氨基酸序列中的Z、P、C和Q区的位置
权利要求
1.肿瘤增殖抑制剂，其含有下述多肽:该多肽是在去除了半乳糖神经酰胺表达因子-1的Q区的多肽中、至少含有C区或其一部分的多肽。
2.肿瘤增殖抑制剂，其含有下列(a)或(b)的多肽: (a)由序列号8、10或12所示氨基酸序列组成的多肽， (b)由在序列号8、10或12所示氨基酸序列中缺失、取代或添加I个或多个氨基酸而成的氨基酸序列组成、且具有抑制肿瘤增殖作用的多肽。
3.肿瘤增殖抑制剂，其含有下列(a)或(b)的多肽: (a)含有序列号8、10或12所示氨基酸序列中的至少10个连续的氨基酸残基的多肽， (b)由下列氨基酸序列组成、且具有抑制肿瘤增殖作用的多肽，该氨基酸序列是在含有序列号8、10或12所 示氨基酸序列中的至少10个连续的氨基酸残基的氨基酸序列中缺失、取代或添加I个或多个氨基酸而形成的。
4.权利要求3记载的肿瘤增殖抑制剂，其中，上述(a)中记载的多肽含有序列号44-65中任一项所示的氨基酸序列。
5.肿瘤增殖抑制剂，其含有编码下述多肽的多核苷酸，该多肽是在去除了半乳糖神经酰胺表达因子-1的Q区的多肽中、至少含有C区或其一部分的多肽。
6.肿瘤增殖抑制剂，其含有编码下列(a)或(b)的多肽的多核苷酸， (a)由序列号8、10或12所示氨基酸序列组成的多肽， (b)由在序列号8、10或12所示氨基酸序列中缺失、取代或添加I个或多个氨基酸而成的氨基酸序列组成、且具有抑制肿瘤增殖作用的多肽。
7.肿瘤增殖抑制剂，其含有编码下列(a)或(b)的多肽的多核苷酸， (a)含有序列号8、10或12所示氨基酸序列中的至少10个连续的氨基酸残基的多肽， (b)由下列氨基酸序列组成、且具有抑制肿瘤增殖作用的多肽，该氨基酸序列是在含有序列号8、10或12所示氨基酸序列中的至少10个连续的氨基酸残基的氨基酸序列中缺失、取代或添加I个或多个氨基酸而形成的。
8.肿瘤增殖抑制剂，其含有下列(a)或(b)的多核苷酸: (a)由序列号7、9或11所示碱基序列组成的多核苷酸， (b)与由下列碱基序列组成的多核苷酸在严格条件下杂交、且编码具有抑制肿瘤增殖作用的多肽的多核苷酸，所述碱基序列是与序列号7、9或11所示碱基序列互补的碱基序列。
9.肿瘤增殖抑制剂，其含有抑制半乳糖神经酰胺表达因子-1表达的物质。
10.权利要求9记载的肿瘤增殖抑制剂，其中，所述抑制半乳糖神经酰胺表达因子-1表达的物质是针对编码半乳糖神经酰胺表达因子-1的多核苷酸的siRNA或shRNA。
11.权利要求10记载的肿瘤增殖抑制剂，其中，所述编码半乳糖神经酰胺表达因子-1的多核苷酸含有编码下列(a)或(b)的多肽的碱基序列， (a)由序列号2、4或6所示氨基酸序列组成的多肽， (b)由在序列号2、4或6所示氨基酸序列中缺失、取代或添加I个或多个氨基酸而成的氨基酸序列组成、且具有抑制肿瘤增殖作用的多肽。
12.权利要求10记载的肿瘤增殖抑制剂，其中，所述编码半乳糖神经酰胺表达因子-1的多核苷酸含有下列(a)或(b)的多核苷酸:(a)由序列号1、3或5所示碱基序列组成的多核苷酸， (b)与由下列碱基序列组成的多核苷酸在严格条件下杂交、且编码具有抑制肿瘤增殖作用的多肽的多核苷酸，所述碱基序列是与序列号1、3或5所示碱基序列互补的碱基序列。
13.血管形成抑制剂，其含有下述多肽:该多肽是在去除了半乳糖神经酰胺表达因子-1的Q区的多肽中、至少含有C区或其一部分的多肽。
14.血管形成抑制剂，其含有下列(a)或(b)的多肽: (a)由序列号8、10或12所示氨基酸序列组成的多肽， (b)由在序列号8、10或12所示氨基酸序列中缺失、取代或添加I个或多个氨基酸而成的氨基酸序列组成、且具有抑制血管形成作用的多肽。
15.血管形成抑制剂，其含有下列(a)或(b)的多肽: (a)含有序列号8、10或12所示氨基酸序列中的至少10个连续的氨基酸残基的多肽， (b)由下列氨基酸序列组成、且具有抑制血管形成作用的多肽，该氨基酸序列是在含有序列号8、10或12所示氨基酸序列中的至少10个连续的氨基酸残基的氨基酸序列中缺失、取代或添加I个或多个氨基酸而形成的。
16.权利要求15记载的血管形成抑制剂，其中，上述(a)中记载的多肽含有序列号44-65中任一项所示的氨基酸序列。
17.血管形成抑制剂，其含有编码下述多肽的多核苷酸，该多肽是在去除了半乳糖神经酰胺表达因子-1的Q区的多肽中、至少含有C区或其一部分的多肽。
18.血管形成抑制剂，其含有编码下列(a)或(b)的多肽的多核苷酸， (a)由序列号8、10或12所示氨基酸序列组成的多肽， (b)由在序列号8、10或12所示氨基酸序列中缺失、取代或添加I个或多个氨基酸而成的氨基酸序列组成、且具有抑制血管形成作用的多肽。
19.血管形成抑制剂，其含有编码下列(a)或(b)的多肽的多核苷酸， (a)含有序列号8、10或12所示氨基酸序列中的至少10个连续的氨基酸残基的多肽， (b)由下列氨基酸序列组成、且具有抑制血管形成作用的多肽，该氨基酸序列是在含有序列号8、10或12所示氨基酸序列中的至少10个连续的氨基酸残基的氨基酸序列中缺失、取代或添加I个或多个氨基酸而形成的。
20.血管形成抑制剂，其含有下列(a)或(b)的多核苷酸: (a)由序列号7、9或11所示碱基序列组成的多核苷酸， (b)与由下列碱基序列组成的多核苷酸在严格条件下杂交、且编码具有抑制血管形成作用的多肽的多核苷酸，所述碱基序列是与序列号7、9或11所示碱基序列互补的碱基序列。
21.血管形成抑制剂，其含有抑制半乳糖神经酰胺表达因子-1表达的物质。
22.权利要求21记载的血管形成抑制剂，其中，所述抑制半乳糖神经酰胺表达因子-1表达的物质是针对编码半乳糖神经酰胺表达因子-1的多核苷酸的siRNA或shRNA。
23.权利要求22记载的血管形成抑制剂，其中，所述编码半乳糖神经酰胺表达因子-1的多核苷酸含有编码下列(a)或(b)的多肽的碱基序列， (a)由序列号2、4或6所示氨基酸序列组成的多肽， (b)由在序列号2、4或6所示氨基酸序列中缺失、取代或添加I个或多个氨基酸而成的氨基酸序列组成、且具有诱导血管形成作用的多肽。
24.权利要求22记载的血管形成抑制剂，其中，所述编码半乳糖神经酰胺表达因子-1的多核苷酸含有下列(a)或(b)的多核苷酸: (a)由序列号1、3或5所示碱基序列组成的多核苷酸， (b)与由下列碱基序列组成的多核苷酸在严格条件下杂交、且编码具有诱导血管形成作用的多肽的多核苷酸，所述碱基序列是与序列号1、3或5所示碱基序列互补的碱基序列。
25.癌细胞特性消除剂，其含有下列(a)或(b)的多肽: (a)由序列号8、10或12所示氨基酸序列组成的多肽， (b)由在序列号8、10或12所示氨基酸序列中缺失、取代或添加I个或多个氨基酸而成的氨基酸序列组成、且具有消除癌细胞特性作用的多肽。
26.权利要求25记载的癌细胞特性消除剂，其是使癌细胞获得接触抑制能力的癌细胞特性消除剂。
27.抑制肿瘤增殖的方法，该方法包括:抑制半乳糖神经酰胺表达因子-1的表达。
28.抑制血管形成的方法， 该方法包括:抑制半乳糖神经酰胺表达因子-1的表达。
全文摘要
本发明的目的是提供具有抑制血管形成作用和/或抑制肿瘤增殖作用的抗肿瘤剂或抑制肿瘤增殖的方法。本发明提供了上述抗肿瘤剂，其含有下述多肽该多肽是在去除了半乳糖神经酰胺表达因子-1的Q区的多肽中、至少含有C区或其一部分的多肽，且该抗肿瘤剂具有抑制血管形成作用和/或抑制肿瘤增殖作用。
文档编号A61K31/713GK103221060SQ20118004117
公开日2013年7月24日 申请日期2011年6月24日 优先权日2010年6月25日
发明者小仓洁 申请人:公益财团法人东京都医学综合研究所