专利名称：抗流感病毒的免疫方法及其组合疫苗的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于预防流感病毒传播的方法，以及构成所述方法的因素，以及尤其地涉及组合疫苗和其免疫方法。流感组合疫苗的基本思路是使用不同的流感血凝素蛋白或者其编码基因来进行序贯(sequential)免疫，所述序贯免疫的意思是在多个疫苗免疫步骤中使用不同的流感血凝素蛋白或者其不同的编码基因，从而得到具有高滴度且抗多种流感病毒的广谱抗性的中和抗体。在本发明中所涉及的流感组合疫苗可以用于预防由多种亚型所引起的流感病毒感染。
背景技术：
流行性感冒(以下简称“流感(flu)”)是由流感病毒(以下简称“流感病毒(fluvirus)”)引起的急性呼吸道疾病。其通过呼吸道传播，具有相对高的感染率，并且其中的一些可以导致严重的发病率和致死率。流感病毒的传播根据其特征可以划分为以下几类。1.季节性流感。季节性流感是流感最常见的形式，其每年爆发，并且在秋天或者冬天所述的爆发通常大规模发生。据世界卫生组织(WHO)所估计，每年约有6亿人被感染，并且300-500万人患有重度病症，并且其导致25-50万例死亡。在医疗资源丰富的发达国家，大多数死亡病例是在年老人群中发生的。在美国，据估计每年有36000人死于季节性流感，并且约90%是65岁以上的(Thompson et al.Am J Public Health.2009)。当前市场上针对季节性流感的疫苗包括用于肌肉注射的灭活病毒疫苗和裂解疫苗以及用于黏膜接种的减毒活疫苗，其都由三种不同类型的流感病毒抗原所组成，所述的流感病毒抗原即H1N1、H3N2和乙型流感。2.流感大流行。流感大流行是由于流感病毒基因重排导致的抗原转换引起的。该流感大流行对社会具有极 大的危害，由于人很少针对基因组中如此大片段的突变产生免疫力。在上个世纪，有三次这样的流感大流行爆发，并且各次的爆发导致大量的感染和死亡，并且对经济和社会带来了巨大的损失。据估计，1918-1920年间暴发的“西班牙流感(Spainflu)”，历史上最严重的自然灾害之一，感染了约5亿人(世界人口的三分之一)，并且导致4-5千万人的死亡，这占当时世界人口的3%。随后，于1957年和1968年发生的“亚洲流感”和“香港流感”也导致了数百万病例死亡。随着社会的发展，国家和地区之间的交流日益增多，并且更加便利和频繁，这也使得流感大流行的传播更容易。WHO认为，过去流感大流行传播到全世界需要6-9个月，而现在只需要3个月。据估计，下一次流感大流行会在发达国家带来I亿3千万门诊病人，200万人入院治疗以及65万人死亡。在发展中国家，其影响会更加严重，甚至有数百万人死亡。因此，该流感大流行对于全球公共健康是极大的风险。WHO和各国卫生当局也对2009年的HlNl进行了极大的关注，由于其显示出流感大流行的特征。3.禽流感。此感染是由突变的禽类病毒所引起的。尽管在人群中尚未观察到爆发，但是极高的病死率给人类健康带来了严重的威胁。并且，由于其野生宿主不断迁徙，该高致病性的禽流感病毒很难得到控制，从而给全球公共健康带来了新的挑战。到2010年3月30日为止WHO报道了 492例，并且有291例死亡(数据来自www.pandemicflu.ac.cn)
各国的公共卫生部门进行了努力来预防该危险，并且WHO建立了全球监控网络，并且希望能够根据该监控来进行预警。到现在为止，控制感染性疾病传播的最有效方法是疫苗。尤其对于流感病毒来说，流感疫苗接种是预防和控制流感病毒传播的最有效的手段。尽管三种类型的流感传播对应于不同的上市疫苗，当前的疫苗仅仅保护对象免受与疫苗株相同或者相似的流感病毒感染，并且不太可能克服病毒突变，从而预防由多种流感病毒导致或者与疫苗株不同的流感病毒所导致的感染。因此，在各个流感季节，用于季节性流感病毒的候选疫苗株将要由WHO根据流行趋势重新评估，并且疫苗株每年都要更新。所选择的疫苗株可能和季节性传播的病毒株不匹配，从而疫苗的效果存在风险。已报道的数据表明，流感病毒血凝素(HA)蛋白是一种保护性抗原，其通过诱导中和抗体(nAb)来保护宿主。因此，流感疫苗是对HA的含量来进行评价的，并且疫苗的效果是通过血凝素抑制抗体的滴度来评价的。如本领域技术人员所熟知的，HA是甲型流感(A-flu)中具有最多突变的蛋白。迄今为止，发现了 16种HA的亚型，并且HA抗原之间的抗原性是不相同的。尽管保护相关的表位集中在HA中，而且现有的疫苗可以诱导具有高滴度的抗体，然而，具有高度免疫原性的表位不断地变化。疫苗仅仅对于相同或者相似株的病毒株有效，并且不针对其他的株或者新的株显示出广泛的保护能力。从本质上来说，当前的疫苗技术不能克服病毒株之间的突变，从而实现广泛的交叉保护。还期待得到具有广泛保护能力，并且保持对甲型流感Hl亚型的强保护作用的疫苗。2009年，HlNl流感在全世界传播，并且导致了大量的死亡。因此针对Hl流感的保护能力对于疫苗来说是重要的因素。
发明内容
在本发明中，术语“共享序列”与“共有序列”可以交换地使用，并且“血凝素”与“ HA ”可以交换地使用。本发明提供了一种抗流感病毒的新型的组合疫苗及其组合方法。在本发明中，将多种不同的流感疫苗 按顺序组合，从而得到新的特性，所述的新的特性不能由单个的疫苗或者所述疫苗的混合物达到。本发明的关键点在于使用不同的流感病毒HA抗原按照一定的顺序接种，从而诱导抗大量流感病毒的中和抗体。本发明人于2009年5月25日递交了 “抗多种艾滋病病毒的组合疫苗及其组合方法”(申请号200910027615.2)的专利申请，其中描述了序贯接种的原理。本发明是将该技术原理应用在流感疫苗上。本发明提供了抗多种流感病毒的普遍类型的流感免疫方法，其特征在于将两种或更多种不同的流感疫苗按照特定的顺序进行接种，并且每种流感疫苗接种至少一次，并且总接种次数为两次或更多次；其中每种流感疫苗包括一种或更多种抗原、其免疫原性片段或者其编码基因，并且进一步包括不同抗原、所述不同抗原的免疫原性片段或者所述不同抗原的编码基因。优选地，所述的抗原是流感病毒血凝素蛋白(HA)。在本发明优选的方面，本发明的流感疫苗可以选自:灭活疫苗、减毒疫苗、重组HA亚单位疫苗、携带流感病毒血凝素编码基因的DNA疫苗、重组病毒载体疫苗、重组细菌载体疫苗或者重组酵母载体疫苗、表达血凝素的重组病毒样颗粒疫苗，以及上述疫苗的组合。在本发明优选的方面，所述的HA选自甲型流感的H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15 和 H16 亚型的 HA 和乙型流感的 HA0在本发明优选的方面，所述的HA选自甲型流感的Hl、H3、H5亚型的HA和乙型流感的HA。在本发明优选的方面，所述的HA选自甲型流感HA的H1、H3和H5亚型的HA。优选地，所述的两种或多种流感疫苗包含Hl亚型的一种或多种HA或者其编码基因。在本发明优选的方面，所述的流感病毒血凝素蛋白来自甲型或乙型流感病毒或者来自流感病毒的不同亚型，以及所述的亚型包括但不限于H1N1、H3N2、H5N1或者H7N7 ;或者所述的流感病毒血凝素蛋白来自一种病毒株的不同血凝素蛋白类型，例如来自同一病毒株的HAl或HA2。所述的 流感病毒血凝素蛋白可以选自HA0、HA1、HA2或其免疫原性片段。所述的流感病毒血凝素编码基因可以是针对人进行密码子优化的。在特别指出的实施例中，所述的流感病毒血凝素蛋白选自甲型流感的Hl、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15和H16亚型或乙型流感的血凝素蛋白或者其组合；优选地，甲型流感的H1、H3或H5亚型的血凝素蛋白。更优选地，所述的流感病毒血凝素蛋白是同一亚型的共享序列或者祖先序列。在本发明优选的方面，提供了免疫方法，并且三次免疫按顺序进行，并且a)第一次免疫是Hl疫苗，其中的HA来自甲型流感的Hl亚型；b)第二次免疫是H3疫苗，其中的HA来自甲型流感的H3亚型；并且c)第三次免疫是H5疫苗，其中的HA来自H5亚型。在本发明进一步优选的方面，提供了免疫方法，并且Hl疫苗的HA是A/Texas/05/2009 (HlNl)，H3疫苗的HA是2006到2009的H3亚型的共享序列，以及H5疫苗的HA是2006到2009的H5亚型的共享序列。在本发明再进一步优选的方面，提供了免疫方法，并且所述的Hl疫苗是PVAX1-TE09H1,所述的H3疫苗是pVAXl-CON H3，以及所述的H5疫苗是pVAXl-CON H5 ；其中PVAX1-TE09H1是表达流感病毒毒株A/Texas/05/2009 (HlNl)的HA的重组DNA疫苗，pVAXl-CON H3是表达2006到2009的H3亚型HA的共享序列的重组DNA疫苗，以及pVAXl-CON H5是表达2006到2009的H5亚型HA的共享序列的重组DNA疫苗。在本发明优选的方面，提供了免疫方法，并且按顺序进行三次免疫，并且所有的免疫是Hl疫苗，其中的HA来自甲型流感病毒的Hl亚型。在本发明进一步优选的方面，提供了免疫方法，并且Hl疫苗的HA来自A/Brisbane/59/2007 (HlNl)、A/Brisbane/59/2007 (HlNl)和 A/Texas/05/2009 (HlNl)。在本发明再进一步优选的方面，提供了免疫方法，并且三种Hl疫苗是PVAX1-BR07HU pVAXl-BR07Hl 和 rvv_TE09Hl，其中 pVAXl_BR07Hl 是表达流感病毒毒株 A/Brisbane/59/2007 (HlNl)的HA的重组DNA疫苗，并且rvv_TE09Hl是表达流感病毒毒株A/Texas/05/2009 (HlNl)的HA的重组疫苗性病毒载体疫苗。在本发明优选的方面，按顺序进行四次免疫，并且a)第一次免疫是BHA疫苗，其中的HA来自乙型流感；b)第二次免疫是Hl疫苗，其中的HA来自甲型流感的Hl亚型；c)第三次免疫是H3疫苗，其中的HA来自甲型流感的H3亚型；并且d)第四次免疫是H5疫苗，其中的HA来自H5亚型。在本发明进一步优选的方面，提供了免疫方法，并且BHA疫苗的HA来自B/Brisbane/60/2008, Hl 疫苗的 HA 来自 A/Texas/05/2009 (HlNl)，并且 H3 疫苗的 HA 是 2006到2009的H3亚型的共享序列，并且H5疫苗的HA是2006到2009的H5亚型的共享序列。在本发明再进一步优选的方面，提供了免疫方法，并且所述的BHA疫苗是PVAX1-BR08BHA,所述的Hl疫苗是pVAXl_TE09Hl，所述的H3疫苗是pVAXl-CON H3,以及所述的 H5 疫苗是 pVAXl-CON H5 ;其中 pVAXl_BR08 是表达 B/Brisbane/60/2008 的 HA 的重组DNA疫苗，pVAXl-TE09Hl是表达流感病毒毒株A/Texas/05/2009 (HlNl)的HA的重组DNA疫苗，pVAXl-CON H3是表达2006到2009的H3亚型HA的共享序列的重组DNA疫苗，并且pVAXl-CON H5是表达2006到2009的H5亚型HA的共享序列的重组DNA疫苗。本发明的抗流感的免疫方法可以针对禽类和哺乳类动物，优选地针对人。在本发明的抗流感的免疫方法中，两次接种之间的间隔是至少I周；优选为2周或更多周，最多四周。在本发明的另一个方面，提供了用于上述流感免疫方法中任一种的流感组合疫苗，其包含两种或更多种用于序贯接种的流感疫苗，其特征在于每种流感疫苗包含一种或多种抗原、其免疫原性片段或者其编码基因，并且进一步地包含不同抗原、所述不同抗原的免疫原性片段或者所述不同抗原的编码基因。所述的两种或多种流感疫苗按照一定的顺序进行接种，并且每种流感疫苗接种至少一次，并且总接种次数为两次或更多次。优选地，所述的抗原是流感病毒HA，或者流感病毒HA的组合。在本发明优选的方面，所述的两种或更多的流感疫苗选自:灭活疫苗、减毒疫苗、重组HA亚单位疫苗、携带流感病毒HA编码基因的DNA疫苗、重组病毒载体疫苗、重组细菌载体疫苗或者重组酵母载体疫苗、表达HA的重组病毒样颗粒疫苗，或者上述疫苗的组合。任意的上述疫苗包含流感病毒HA抗原、其免疫原性片段或者其编码基因。优选地，所述的HA 选自甲型流感的 H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、Hll、H12、H13、H14、H15 或 H16亚型的HA和乙型流感的HA。 在本发明另一个优选的方面，所述的两种或更多种流感疫苗包含来自Hl亚型的一种或多种HA或者其编码基因。在本发明另一个优选的方面，所述的流感病毒HA选自HA0、HA1、HA2或其免疫原性片段。在本发明优选的方面，所述的HA序列是相同亚型的共享序列或祖先序列。在本发明优选的方面，所述的HA的编码基因是针对人进行密码子优化的。在本发明的一个方面，按顺序进行四次接种，并且a)第一次免疫是BHA疫苗，其中的HA来自乙型流感；b)第二次免疫是Hl疫苗，其中的HA来自甲型流感的Hl亚型；c)第三次免疫是H3疫苗，其中的HA来自甲型流感的H3亚型；并且d)第四次免疫是H5疫苗，其中的HA来自H5亚型。在本发明优选的方面，BHA疫苗的HA来自B/Brisbane/60/2008，Hl疫苗的HA来自A/Texas/05/2009 (HlNl)，并且H3疫苗的HA是2006到2009的H3亚型的共享序列，并且H5疫苗的HA是2006到2009的H5亚型的共享序列。在本发明的一个方面，按顺序进行三次免疫，并且a)第一次免疫是Hl疫苗，其中的HA来自甲型流感的Hl亚型；b)第二次免疫是H3疫苗，其中的HA来自甲型流感的H3亚型；并且c)第三次免疫是H5疫苗，其中的HA来自H5亚型。在本发明优选的方面，Hl疫苗的HA来自A/Texas/05/2009 (HlNl)，并且H3疫苗的HA是2006到2009的H3亚型的共享序列，并且H5疫苗的HA是2006到2009的H5亚型的
共享序列。在本发明优选的方面，三次免疫按顺序进行，并且所有的免疫是Hl疫苗，其中的HA来自甲型流感的Hl亚型。在本发明优选的方面，Hl疫苗的HA来自A/Brisbane/59/2007 (HlNl)、A/Brisbane/59/2007 (HlNl)和 A/Texas/05/2009 (HlNl)。在本发明优选的方面，所述的疫苗针对哺乳动物，优选地针对人。本发明还提供了所 述流感组合疫苗中的任一种在预防或治疗流感病毒感染中的用途。在本发明的另一个方面，提供了所述流感组合疫苗中的任一种在制备用于预防或治疗流感病毒感染的药物中的用途。针对具有多亚型、且在亚型之间具有丰富的突变的流感病毒，将受试者使用来自一个株的免疫原进行一次或多次接种，或者将所述的受试者使用来自多个株的多个免疫原进行多次接种不提供广谱的交叉保护。通过按顺序接种来自两个或更多个株的免疫原，优选地激活了一致的或共有的表位(两个或更多个株所共有的表位)，并且针对该表位的免疫反应在随后的疫苗接种中被增强。该免疫反应被认为是广谱的交叉免疫反应，并且针对所接种的两种或多种株显示出抗性。考虑到共有的或者一致的表位对于具有高突变潜力的病毒至关重要，并且不轻易地变化，组合疫苗对于其他未经接种的或者新的株也显示出抗性。本发明的另一个优点在于在本发明中的组合疫苗针对不同的Hl流感病毒表现出非常强的保护。如在下文的实施例中所表明的，组合疫苗相对于大多数的传统病毒Hl显示为更强，并且因此在针对频繁发作的感染进行接种中有用。
实施例在本发明中，携带来自不同流感亚型或者来自同一亚型的不同毒株的HA抗原或者HA编码基因的流感疫苗按顺序接种，从而得到组合疫苗，并且从而得到了广谱的中和抗体，从而预防流感的感染。在本发明中，第一次注射可以携带来自甲型流感的H1-16中任意的亚型毒株或者乙型流感的HA，或者上述中的一种或多种的组合的抗原；优选地，所述的抗原选自甲型流感的H1、H3和H5亚型。第二次注射可以携带来自甲型流感的H1-16中任意的亚型毒株或者乙型流感的HA，或者上述中的一种或多种的组合的抗原；优选地，所述的抗原选自甲型流感的H1、H3和H5亚型，以及在第二次注射中的至少一种HA与第一次注射不同。所述的流感组合疫苗可以包括疫苗的第三次注射，并且所述的第三次注射可以携带来自甲型流感的H1-16中任意的亚型毒株或者乙型流感的HA，或者上述中的一种或多种的组合的抗原；优选地，所述的抗原选自甲型流感的Hl、H3和H5亚型，以及在第三次注射中的至少一种HA与第一次或第二次注射不同。所述的流感组合疫苗可以包括额外注射的疫苗，第四次或者更多次的注射可以携带来自甲型流感的H1-16中任意的亚型毒株或者乙型流感的HA，或者上述的一种或多种的组合的抗原；优选地，在额外注射中的至少一种HA与前面的注射不同。在本发明中，使用了以下的动物、病毒株、疫苗和化学品:
DNA疮苗构律和制各流感毒株A/Texas/05/2009 (HlNl) HA (Gebank ACP41934) (TE09H1)氨基酸序列(如SEQ.1D.N0.1所示的)是密码子优化的，并且密码子优化的核苷酸序列(如SEQ.1D.N0.2所示的)通过Generay biotechnology化学合成。随后通过已知的分子生物学方法,将此核苷酸序列转移到DNA疫苗载体pVAXl (Invitrogen, V260-20, CA, USA)。所构建的质粒DNA疫苗在此命名为PVAX1-TE09H1,并且通过测序来确认(Invitrogen,上海，中国)。通过Endo-FReePlasimd Giga Kits (QIAGEN, GE)来成批制备此疫苗。2006到2009流感毒株的流感病毒H3亚型氨基酸序列的共享序列(CON H3)(如SEQ.1D.N0.3)是密码子优化的，并且密码子优化的核苷酸序列(如SEQ.1D.N0.4所示的)通过Generay biotechnology化学合成。随后通过已知的分子生物学方法,将此核苷酸序列转移到DNA疫苗载体pVAXl (Invitrogen, V260-20, CA, USA)。所构建的质粒DNA疫苗在此命名为pVAXl-CON H3并且通过测序来确认(Invitrogen,上海，中国)。通过Endo-FRee PlasimdGiga Kits(QIAGEN, GE)来成批制备此疫苗。在本发明中使用的其他DNA疫苗可以按照上述方法进行构建和制备。BR07H1(SEQ.1D.N0.5中所示的氨基酸序列，以及SEQ.1D.N0.6中所示的核酸序列)，BR07H3 (SEQ.1D.N0.7中所示的氨基酸序列，以及SEQ.1D.N0.8中所示的核酸序列)，CON H5(SEQ.1D.N0.9中所示的氨基酸序列，以及SEQ.1D.N0.10中所示的核酸序列)，BR08BHA (SEQ.1D.N0.11中所示的氨基酸序列，以及SEQ.1D.N0.12中所示的核酸序列)全部都用于构建疫苗。所述氨基酸序列和核酸序列在序列表中显示。本文中所使用的所有DNA疫苗都是由本发明人按照以下的方案进行构建和制备的。所有的HA抗原序列是密码子优化的，并且通过Generay biotechnology合成。随后通过已知的分子生物学方法，将此抗原序列转移到DNA疫苗载体pVAXl (Invitrogen,V260-20, CA，USA) 。所构建的DNA疫苗通过测序来确认(Invitrogen，上海，中国)，并且该DNA疫苗的HA表达通过蛋白质免疫印迹来确认。构建的所有DNA疫苗通过Endo-freePlasimd Giga Kits(QIAGEN)来制备。重组疫苗载体疫苗的构建和制备在本文中使用的全部重组痘苗载体疫苗都是由本发明人根据公知的方案(FredM.Ausubel, et al.Current Protocols in Molecular Biology, 2002)来构建和制备的。全部的重组痘苗载体疫苗是在Vero细胞中制备和滴定的(上海生命科学研究院细胞研究中心(Cell Research Center of ShanghaiInstitutes for Biological Sciences),上海X动物和免疫SPF雌性BAL B/c小鼠购自Slac实验动物(上海)并且在苏州大学试验动物中心中保管。所有的免疫是通过肌肉内注射进行的。基于假病毒的中和检测假病毒化验作为普遍接受的方案，被用于评估组合疫苗对流感病毒的不同毒株的保护效果。此方法充分描述在Wei等人.Science27August2010:329(5995), 1060-1064中。在本发明中，假病毒通过以下的方案来制备。将5X 106293T包装细胞(上海生命科学研究院细胞研究中心，上海)与5 μ g的慢病毒载体pNL4-31uc.R-E-和2.5 μ g的HA表达质粒以及2.5μ g的NA表达质粒使用Turbofect(Fermentas)进行共转染。所有的HA和NA由Generay biotechnology化学合成。所有的表达质粒根据上述的方法进行构建和制备。细胞过夜孵育之后，将其使用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤一次并且在5ml的完全DMEM (Hyclone)中培养16到20小时。收获假病毒的上清，并且在-80° C的冰箱中以小份储存，直到在中和检测中使用。在实施方案中采用了来自13个毒株的HA编码 DNA。所述的 NA 来自 A/Shanghai/37T/2009 (HlNl) (GenBank N0.ACS27784)。假病毒的HA编码序列和其所表达的蛋白质序列列于下文:I)A/Singapore/6/1986 (HlNl)HA(GenBank N0.AB038395)DNA序列示于SEQ.1D.N0.13，以及所表达的氨基酸序列示于SEQ.1D.N0.14。2)A/NewCaledonia/20/1999(HlNl)HA(GenBank N0.AY289929)
DNA序列示于SEQ.1D.N0.15，以及所表达的氨基酸序列示于SEQ.1D.N0.16。3)A/SolomonIslands/3/2006(HlNl)HA(GenBank N0.ABU99109)DNA序列示于SEQ.1D.N0.17，以及所表达的氨基酸序列示于SEQ.1D.N0.18。4)A/Brisbane/59/2007 (HlNl)HA(GenBank N0.ACA28844)DNA序列示于SEQ.1D.N0.19，以及所表达的氨基酸序列示于SEQ.1D.N0.20。5)A/Texas/05/2009 (HlNl)HA(GenBank N0.ACP41934)DNA序列示于SEQ.1D.N0.2，以及所表达的氨基酸序列示于SEQ.1D.N0.1。6)A/Moscow/10/1999(H3N2)HA(GenBank N0.AAT08002)DNA序列示于SEQ.1D.N0.21，以及所表达的氨基酸序列示于SEQ.1D.N0.22。7)A/Fujian/411/2002(H3N2)HA(GenBank N0.ABB71825)DNA序列示于SEQ.1D.N0.23，以及所表达的氨基酸序列示于SEQ.1D.N0.24。8)A/Wisconsin/67/2005(H3N2)HA(GenBank N0.ACF54576)DNA序列不于SEQ.1D.N0.25,以及所表达的氨基酸序列不于SEQ.1D.N0.26。9)A/Brisbane/10/2007(H3N2)HA(GenBank N0.ABW23353)DNA序列不于SEQ.1D.N0.27，以及所表达的氣基酸序列不于SEQ.1D.N0.28。10)A/Viet Nam/1203/2004(H5N1)HA(GenBank N0.AAW80717)DNA序列示于SEQ.1D.N0.29，以及所表达的氨基酸序列示于SEQ.1D.N0.30。11)A/duck/Novosibirsk/56/2005(H5N1)HA(GenBank N0.ABB43059)DNA序列示于SEQ.1D.N0.31，以及所表达的氨基酸序列示于SEQ.1D.N0.32。12)B/Brisbane/60/2008(Victoria lineage)HA(GenBank N0.ACN29380)DNA序列示于SEQ.1D.N0.33，以及所表达的氨基酸序列示于SEQ.1D.N0.34。13)B/Florida/4/2006(Yamagata-1ineage)HA(GenBank N0.ACA33493)。DNA序列不于SEQ.1D.N0.35,以及所表达的氨基酸序列不于SEQ.1D.N0.36。14)A/Shanghai/37T/2009(HlNl) NA GenBank N0.ACS27784DNA序列不于SEQ.1D.N0.37，以及所表达的氣基酸序列不于SEQ.1D.N0.38。假病毒、HA表达质粒、流感毒株的名称及其Genbank登录号显示在下表I中。表I
权利要求
1.一种抗多种流感毒株的通用型流感免疫方法，其特征在于将两种或更多种不同的流感疫苗按照特定的顺序进行接种，并且每种流感疫苗接种至少一次，并且总接种次数为两次或更多次；其中，每种流感疫苗包含一种或多种抗原、其免疫原性片段或者其编码基因，并且进一步包含一种不同抗原、所述不同抗原的免疫原性片段或者所述不同抗原的编码基因。
2.权利要求1所述的方法，其特征在于所述的抗原是流感病毒血凝素(HA)。
3.权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述的两种或多种流感疫苗选自:灭活疫苗、减毒疫苗、重组HA亚单位疫苗、携带HA编码基因的DNA疫苗、重组病毒载体疫苗、重组细菌载体疫苗或者重组酵母载体疫苗、表达HA的重组病毒样颗粒疫苗，以及上述疫苗的组合ο
4.权利要求2或3所述的方法，其特征在于所述的HA选自:甲型流感的H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15 和 H16 亚型的 HA 和乙型流感的 HA0
5.权利要求2或3所述的方法，其特征在于所述的HA选自:甲型流感的H1、H3、H5亚型的HA和乙型流感的HA。
6.权利要求2或3所述的方法，其特征在于所述的HA选自:甲型流感HA的H1、H3和H5亚型的HA。
7.权利要求2-6中任一项所述的方法，其特征在于所述的两种或多种流感疫苗包含来自Hl亚型的一种或多种HA或者其编码基因。
8.权利要求2-6中任一项所述的方法，其特征在于所述的HA选自HAO、HAl、HA2或其免疫原性片段。
9.权利要求2-8中任一项所述的方法，其特征在于所述HA的氨基酸序列是同一亚型的HA的共享序列或者祖先序列。
10.权利要求2-9中任一项所述的方法，其特征在于所述的流感病毒HA编码基因是针对人进行密码子优化的。
11.权利要求1-10中任一项所述的方法，其特征在于按顺序进行三次免疫，并且 a)第一次免疫是Hl疫苗，其中的HA来自甲型流感的Hl亚型； b)第二次免疫是H3疫苗，其中的HA来自甲型流感的H3亚型；并且 c)第三次免疫是H5疫苗，其中的HA来自H5亚型。
12.权利要求11所述的方法，其特征在于Hl疫苗的HA来自A/Texas/05/2009(HlNl)，并且H3疫苗的HA是2006到2009的H3亚型的共享序列，并且H5疫苗的HA是2006到2009的H5亚型的共享序列。
13.权利要求12所述的方法，其特征在于所述的Hl疫苗是pVAXl-TE09Hl，所述的H3疫苗是pVAXl-CON H3，以及所述的H5疫苗是pVAXl_C0N H5 ;其中pVAXl_TE09Hl是表达流感病毒毒株A/Texas/05/2009 (HlNl)的HA的重组DNA疫苗，pVAXl-CON H3是表达2006到2009的H3亚型HA的共享序列的重组DNA疫苗，以及pVAXl-CON H5是表达2006到2009的H5亚型HA的共享序列的重组DNA疫苗。
14.权利要求1到10中任一项所述的方法，其特征在于按顺序进行三次免疫，并且所有的免疫是Hl疫苗，其中的HA来自甲型流感的Hl亚型。
15.权利要求14所述的方法，其特征在于Hl疫苗的HA来自A/Brisbane/59/2007 (HlNl)、A/Brisbane/59/2007 (HlNl)和 A/Texas/05/2009 (HlNl)。
16.权利要求15所述的方法，其特征在于三种Hl疫苗是pVAXl-BR07Hl、pVAXl-BR07Hl和 rvv-TE09Hl，其中 pVAXl_BR07Hl 是表达流感病毒毒株 A/Brisbane/59/2007 (HlNl)的 HA的重组DNA疫苗，并且rvv-TE09Hl是表达流感病毒毒株A/Texas/05/2009 (HlNl)的HA的重组痘苗病毒载体疫苗。
17.权利要求1-5中任一项所述的方法，其特征在于按顺序进行四次免疫，并且 a)第一次免疫是BHA疫苗，其中的HA来自乙型流感； b)第二次免疫是Hl疫苗，其中的HA来自甲型流感的Hl亚型； c)第三次免疫是H3疫苗，其中的HA来自甲型流感的H3亚型；并且 d)第四次免疫是H5疫苗，其中的HA来自H5亚型。
18.权利要求17所述的方法，其特征在于BHA疫苗的HA来自B/Brisbane/60/2008，Hl疫苗的HA来自A/Texas/05/2009 (HlNl)，并且H3疫苗的HA是2006到2009的H3亚型的共享序列，以及H5疫苗的HA是2006到2009的H5亚型的共享序列。
19.权利要求18所述的方法，其特征在于所述的BHA疫苗是pVAXl-BR08BHA，所述的Hl疫苗是pVAXl-TE09Hl，以及所述的H3疫苗是pVAXl-CON H3，以及所述的H5疫苗是 pVAXl-CON H5 ;其中 pVAXl_BR08 是表达 B/Brisbane/60/2008 的 HA 的重组 DNA 疫苗，pVAXl-TE09Hl是表达流感病毒毒株A/Texas/05/2009 (HlNl)的HA的重组DNA疫苗，pVAXl-CON H3是表达2006到2009的H3亚型HA的共享序列的重组DNA疫苗，并且pVAXl-CON H5是表达2006到2009的H5亚型HA的共享序列的重组DNA疫苗。
20.权利要求1-19中任一项所述的方法，其特征在于所述的免疫方法针对禽类和哺乳动物，优选地针对人。
21.权利要求1-20中任一项所述的方法，其特征在于两次接种之间的间隔是至少I周；优选为2周或更多周,最多4周。
22.一种流感组合疫苗，其包含两种或更多种用于序贯接种的流感疫苗，其特征在于每种流感疫苗包含一种或多种抗原、其免疫原性片段或者其编码基因，并且进一步地包含不同抗原、所述不同抗原的免疫原性片段或者所述不同抗原的编码基因。
23.权利要求22所述的流感组合疫苗，其特征在于所述的两种或更多种流感疫苗按照一定的顺序进行接种，并且每种流感疫苗接种至少一次，并且总接种次数为两次或更多次。
24.权利要求23所述的流感组合疫苗，其特征在于所述的抗原是流感病毒HA，或者流感病毒HA的组合。
25.权利要求22所述的流感组合疫苗，其特征在于所述的两种或更多流感疫苗选自:灭活疫苗、减毒疫苗、重组HA亚单位疫苗、携带流感病毒HA编码基因的DNA疫苗、重组病毒载体疫苗、重组细菌载体疫苗或者重组酵母载体疫苗、表达HA的重组病毒样颗粒疫苗，以及上述疫苗的组合。
26.权利要求23到25中任一项所述的流感组合疫苗，其特征在于所述的HA选自:甲型流感的 H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、Hll、H12、H13、H14、H15 或 H16 亚型的 HA和乙型流感的HA。
27.权利要求22到26中任一项所述的流感组合疫苗，其特征在于所述的两种或更多种流感疫苗包含Hl亚型的一种或多种HA或者其编码基因。
28.权利要求22到27中任一项所述的流感组合疫苗，其特征在于所述的流感病毒HA选自:HA0、HA1、HA2或其免疫原性片段。
29.权利要求22到28中任一项所述的流感组合疫苗，其特征在于所述的HA序列是相同亚型的共享序列或者祖先序列。
30.权利要求22到29中任一项所述的流感组合疫苗，其特征在于所述的HA编码基因是针对人进行密码子优化的。
31.权利要求22所述的流感组合疫苗，其特征在于按顺序进行四次免疫，并且 a)第一次免疫是BHA疫苗，其中的HA来自乙型流感； b)第二次免疫是Hl疫苗，其中的HA来自甲型流感的Hl亚型； c)第三次免疫是H3疫苗，其中的HA来自甲型流感的H3亚型；并且 d)第四次免疫是H5疫苗，其中的HA来自H5亚型。
32.权利要求31所述的流感组合疫苗，其特征在于BHA疫苗的HA来自B/Brisbane/60/2008, Hl 疫苗的 HA 来自 A/Texas/05/2009 (HlNl)，并且 H3 疫苗的 HA 是 2006到2009的H3亚型的共享序列，以及H5疫苗的HA是2006到2009的H5亚型的共享序列。
33.权利要求31所述的流感组合疫苗，其特征在于所述的BHA疫苗是pVAXl-BR08BHA，所述的Hl疫苗是pVAXl-TE09Hl，且所述的H3疫苗是pVAXl-CON H3，以及所述的H5疫苗是 pVAXl-CON H5 ;其中 pVAXl_BR08 是表达 B/Brisbane/60/2008 的 HA 的重组 DNA 疫苗，pVAXl-TE09Hl是表达流感病毒毒株A/Texas/05/2009 (HlNl)的HA的重组 DNA疫苗，pVAXl-CON H3是表达2006到2009的H3亚型HA的共享序列的重组DNA疫苗，并且pVAXl-CON H5是表达2006到2009的H5亚型HA的共享序列的重组DNA疫苗。
34.权利要求22所述的流感组合疫苗，其特征在于按顺序进行三次免疫，并且 a)第一次免疫是Hl疫苗，其中的HA来自甲型流感的Hl亚型； b)第二次免疫是H3疫苗，其中的HA来自甲型流感的H3亚型；并且 c)第三次免疫是H5疫苗，其中的HA来自H5亚型。
35.权利要求34所述的流感组合疫苗，其特征在于Hl疫苗的HA是A/Texas/05/2009 (HlNl)，并且H3疫苗的HA是2006到2009的H3亚型的共享序列，以及H5疫苗的HA是2006到2009的H5亚型的共享序列。
36.权利要求34所述的流感组合疫苗，其特征在于所述的Hl疫苗是pVAXl-TE09Hl，以及所述的H3疫苗是pVAXl-CON H3，并且所述的H5疫苗是pVAXl-CON H5 ;其中PVAX1-TE09H1是表达流感病毒毒株A/Texas/05/2009 (HlNl)的HA的重组DNA疫苗，pVAXl-CON H3是表达2006到2009的H3亚型HA的共享序列的重组DNA疫苗，以及pVAXl-CON H5是表达2006到2009的H5亚型HA的共享序列的重组DNA疫苗。
37.权利要求22所述的流感组合疫苗，其特征在于，按顺序进行三次免疫，并且所有的免疫是Hl疫苗，其中的HA来自甲型流感的Hl亚型。
38.权利要求37所述的流感组合疫苗，其特征在于，Hl疫苗的HA来自A/Brisbane/59/2007 (HlNl)、A/Brisbane/59/2007 (HlNl)和 A/Texas/05/2009 (HlNl)
39.权利要求37所述的流感组合疫苗，其特征在于，三种Hl疫苗是pVAXl-BR07Hl、PVAX1-BR07H1 和 rvv_TE09Hl，其中 pVAXl_BR07Hl 是表达流感病毒毒株 A/Brisbane/59/2007 (HlNl)的HA的重组DNA疫苗，并且rvv_TE09Hl是表达流感病毒毒株A/Texas/05/2009 (HlNl)的HA的重组痘苗病毒载体疫苗。
40.权利要求22到37中任一项所述的流感组合疫苗，其特征在于，所述的疫苗针对哺乳动物，优选地针对人。
41.权利要求22到40中任一项所述的流感组合疫苗在预防或治疗流感病毒感染中的用途。
42.权利要求22到40中任一项所述的流感组合疫苗在制备用于预防或治疗流感病毒感染的药物中的 用途。
全文摘要
本发明涉及一种预防流感病毒传播的方法，和构成所述方法的因素，以及尤其地涉及一种组合疫苗和其免疫方法。将两种或更多种疫苗按照特定的顺序进行接种，并且每种流感疫苗至少接种一次，并且总接种次数为两次或更多次；其中每种流感疫苗包含一种或多种抗原、其免疫原性片段或者其编码基因，并且进一步包含不同抗原、所述不同抗原的免疫原性片段或编码基因。与传统疫苗相比，该组合疫苗还对不同毒株或者新的毒株显示出更好的抗性。
文档编号A61K39/145GK103221064SQ201180042517
公开日2013年7月24日 申请日期2011年11月23日 优先权日2011年11月23日
发明者徐建青, 黄杨 申请人:苏州工业园区唯可达生物科技有限公司