具有酶敏感性连接的多核苷酸体内递送偶联物的制作方法
【专利摘要】本发明涉及将RNA干扰(RNAi)多核苷酸体内递送到细胞的组合物。所述组合物包括用酶可切割二肽-酰胺苄基-碳酸盐掩蔽剂可逆修饰的两亲膜活性多胺。修饰掩蔽所述聚合物的膜活性，而可逆性提供生理应答性。所述可逆修饰的多胺(动态聚偶联物或DPC)还共价连接RNAi多核苷酸或与靶向的RNAi多核苷酸靶向分子偶联物共同给予。
【专利说明】具有酶敏感性连接的多核苷酸体内递送偶联物
【背景技术】
[0001]将多核苷酸和其他基本不能穿透细胞膜的化合物递送到活细胞受到细胞复杂膜系统的限制。反义、RNAi和基因治疗中使用的药物是相对高亲水性的聚合物，且通常带较高负电荷。这些物理特征均严格限制其直接扩散穿过细胞膜。基于此原因，多核苷酸递送的主要障碍是将多核苷酸递送穿过细胞膜到达细胞质或细胞核。
[0002]一种已经用于体内递送小核酸的方法是将所述核酸与小靶向分子或脂质或固醇结合。虽然已在这些偶联物中观察到一些递送和活性，但这些方法需要的核酸剂量非常大。
[0003]还已开发大量转染试剂，其能实现体外将多核苷酸相当有效地递送到细胞。然而，用这些相同转染试剂体内递送多核苷酸很复杂且由于体内毒性、不利的血清相互作用和弱靶向而变得无效。体外作用良好的转染试剂、阳离子聚合物和脂质，通常形成大的阳离子静电颗粒并使细胞膜不稳定。体外转染试剂的正电荷有助于通过电荷之间(静电)的相互作用与核酸结合，因此形成核酸/转染试剂复合物。正电荷还有益于载剂与细胞非特异性结合以及膜融合、去稳定化或破坏。膜的去稳定化有利于递送基本不能渗透细胞膜的多核苷酸穿过细胞膜。虽然这些特性有利于核酸体外转移，但它们会造成体内毒性和靶向失效。阳离子电荷与血清组分相互作用，导致多核苷酸转染试剂相互作用的不稳定、较低的生物利用率和弱靶向。体外有效的转染试剂膜活性在体内常导致毒性。
[0004]为了体内递送， 载剂(核酸和结合的递送剂)应较小，直径低于lOOnm，优选低于50nm。低于20nm或低于IOnm的甚至更小复合物会更有用。大于IOOnm的递送载剂体内很少能穿过血管细胞之外的细胞。静电相互作用形成的复合物在暴露于生理盐浓度或血清组分时倾向于聚集或瓦解。此外，体内递送载剂上的阳离子电荷导致不良血清相互作用和因此造成弱生物利用率。有趣的是，高负电荷还会通过干扰靶向所需的相互作用来抑制靶向的体内递送，即，靶向配体与细胞受体的结合。因此，体内分布和靶向需要接近中性的载剂。不经过仔细的调控，膜的破坏或去稳定活性在体内使用时有毒。用核酸递送平衡载剂毒性体外比体内更容易实现。
[0005]Rozema等在美国专利公开20080152661中提供了使用双取代马来酸酐修饰可逆调控膜活性多胺的膜破坏活性的方法。由马来酸酐和胺反应形成的马来酰胺酸连接在体内递送的合适PH范围内是pH不稳定的。该方法使膜活性聚合物能用于体内递送或核酸。我们目前提供修饰的具有二肽-酰胺苄基-氨基甲酸盐连接的膜活性聚合物。所述二肽-酰胺苄基-氨基甲酸盐连接是可逆且生理响应的。不同于通过双取代马来酸酐修饰形成的PH不稳定性马来酰胺酸连接，本文所述的聚合物修饰剂连接生成在体内循环中更稳定的可酶促切割的连接。
【发明内容】
[0006]在一个优选的实施方式中，我们描述用于可逆修饰并抑制两亲性膜活性多胺的膜活性的掩蔽剂，所述掩蔽剂包括:连接二肽-酰胺苄基-碳酸盐的位阻稳定剂或靶向配体，在本文中称为二肽掩蔽剂或蛋白酶可切割的掩蔽剂。所述二肽掩蔽剂具有以下通式:[0007]R-A1A2-酰胺苄基-碳酸盐。
[0008]式中，R是位阻稳定剂或靶向配体，A1是氨基酸，A2是氨基酸。所述掩蔽剂碳酸盐和聚合物胺反应生成氨基甲酸盐连接。所述掩蔽剂保持稳定，直到体内由内源蛋白酶切割二肽并因而从所述多胺切割位阻稳定剂或靶向配体。在二肽(A2和酰胺苄基之间)后的酶切割之后，所述酰胺苄基-氨基甲酸盐自发重排，引起聚合物胺再生。优选R是中性的。更优选地，R不带电。优选的位阻稳定剂是聚乙二醇(PEG)。靶向配体可选自:半抗原例如地高辛、维生素例如生物素、抗体、单克隆抗体和细胞表面受体配体。靶向配体可通过接头(例如PEG接头)连接二肽。优选的细胞表面受体配体是去唾液酸糖蛋白受体(ASGPr)配体。优选的ASGPr配体是N-乙酰半乳糖胺(MG)。优选的二肽由通过酰胺键连接疏水不带电氨基酸的疏水氨基酸组成。优选的酰胺苄基基团是对酰胺苄基基团。优选的碳酸盐是活化的胺反应性碳酸盐。
[0009]在一个优选实施方式中，本发明涉及用于体内递送RNA干扰(RNAi)多核苷酸到细胞中的组合物，所述组合物包括:掩蔽的两亲性膜活性多胺(递送聚合物)以及RNAi多核苷酸，其中所述多胺通过用本文所述二肽掩蔽剂的可逆修饰来掩蔽。所述递送聚合物可共价连接所述RNAi多核苷酸。用于共价连接所述递送聚合物和RNAi多核苷酸的优选连接是生理不稳定连接。在一个实施方式中，该连接与所述二肽掩蔽剂连接彼此正交。或者，所述递送聚合物不与RNAi多核苷酸共价连接，而所述RNAi多核苷酸共价连接靶向分子。
[0010]在一个优选的实施方式中，我们描述某一组合物，所述组合物包括:两亲膜活性多胺，其与以下物质共价连接:a)通过二肽-酰胺苄基-氨基甲酸盐连接共价连接多个靶向配体或位阻稳定剂；和b)通过一个或多个可逆连接共价连接一个或多个多核苷酸。在一个实施方式中，二肽-酰胺苄基-氨基甲酸盐连接与所述多核苷酸可逆共价连接彼此正交。向哺乳动物给予含所述多核苷酸-聚合物偶联物的药学上可接受运载体或稀释剂。 [0011]在一个优选的实施方式中，我们描述某一组合物，所述组合物包括:a)通过二肽-酰胺苄基-氨基甲酸盐连接与多个靶向配体或位阻稳定剂共价连接的两亲膜活性多胺；和《与靶向基团共价连接的RNAi多核苷酸，所述靶向基团选自:具有20个或更多碳原子的疏水基团和半乳糖簇。在该实施方式中，所述RNAi多核苷酸不与所述修饰的两亲膜活性多胺共价连接。所述修饰的多胺和RNAi多核苷酸靶向基团偶联物分开合成，并可在单独容器或单一容器中提供。将溶于药学上可接受运载体或稀释剂的所述经修饰多胺和RNA多核苷酸靶向基团偶联物联合或分开地给予哺乳动物。
[0012]优选的二肽掩蔽剂包括蛋白酶(肽酶)可切割的二肽-对酰胺苄基胺-反应性碳酸盐衍生物。本发明的蛋白酶可切割掩蔽剂具有与酰胺苄基活化的碳酸盐部分相连的二肽。靶向配体或位阻稳定剂连接二肽的氨基末端。酰胺苄基活化的碳酸盐部分连接二肽的羧基末端。适用于本发明的蛋白酶可切割接头具有以下一般结构:
[0013]
【权利要求】
1.一种用于可逆修饰两亲膜活性多胺的化合物，所述化合物包括:共价连接二肽-酰胺苄基-碳酸盐的位阻稳定剂或祀向配体。
2.如权利要求1所述的化合物，其特征在于，所述化合物具有下式代表的结构:
3.如权利要求2所述的化合物，其特征在于，R4包括位阻稳定剂。
4.如权利要求3所述的化合物，其特征在于，所述位阻稳定剂是聚乙二醇(PEG)。
5.如权利要求2所述的化合物，其特征在于，所述靶向配体包括去唾液酸糖蛋白受体(ASGPr)配体。
6.如权利要求5所述的化合物，其特征在于，所述ASGPr配体选自:乳糖、半乳糖、N-乙酰基半乳糖胺、半乳糖胺、N-甲酰基半乳糖胺、N-丙酰基半乳糖胺、N-正丁酰基半乳糖胺和N-异丁酰基半乳糖胺。
7.如权利要求1所述的化合物，其特征在于，X和Y是-NH-，而Z是
8.如权利要求7所述的化合物，其特征在于，Rl是-CH2-苯基。
9.如权利要求7所述的化合物，其特征在于，R2是-(CH2)3-NH-C(O)- NH20
10.一种体内递送RNA干扰(RNAi)多核苷酸至细胞的递送聚合物，所述递送聚合物包括:
M1x-P- M2y
其中: P是两亲膜活性多胺， M1是通过二肽-酰胺苄基-氨基甲酸盐连接与P连接的靶向配体， M2是通过二肽-酰胺苄基-氨基甲酸盐连接与P连接的位阻稳定剂， y和z各是大于或等于零的整数，和 y+z的值大于多胺P上伯胺的50%，通过不存在任何掩蔽剂时P上的胺含量来测定。
11.如权利要求10所述的递送聚合物，其特征在于，所述位阻稳定剂是PEG。
12.如权利要求10所述的递送聚合物，其特征在于，所述靶向配体包括ASGPr配体。
13.如权利要求12所述的递送聚合物，其特征在于，所述ASGPr配体选自:乳糖、半乳糖、N-乙酰基半乳糖胺、半乳糖胺、N-甲酰基半乳糖胺、N-丙酰基半乳糖胺、N-正丁酰基半乳糖胺和N-异丁酰基半乳糖胺。
14.如权利要求10所述的递送聚合物，其特征在于，所述两亲膜活性多胺选自:随机、嵌段或交替合成聚合物。
15.如权利要求10所述的递送聚合物，其特征在于，所述两亲膜活性多胺是蜂毒肽。
16.如权利要求10所述的递送聚合物，其特征在于，所述二肽-酰胺苄基-氨基甲酸盐连接具有下式代表的结构:
17.如权利要求16所述的递送聚合物，其特征在于，所述两亲膜活性多胺还共价连接所述RNAi多核苷酸。
18.一种体内递送RNAi多核苷酸至哺乳动物内细胞的方法，所述方法包括:共同给予所述RNAi多核苷酸和如权利要求10所述的递送聚合物至所述哺乳动物。
19.如权利要求18所述的方法，其特征在于，所述RNA1-多核苷酸共价连接所述递送聚合物。
20.如权利要求18所述`的方法，其特征在于，所述细胞是肝细胞或肝癌细胞。
【文档编号】A61K31/675GK103491982SQ201180061179
【公开日】2014年1月1日 申请日期:2011年12月28日 优先权日:2010年12月29日
【发明者】D·B·罗泽玛, D·L·刘易斯, D·H·维基菲尔德, E·A·基塔斯, P·海德威格, J·A·沃尔夫, I·鲁尔, P·莫尔, T·霍夫曼, K·杨-霍夫曼, H·M·穆勒, G·奥托, A·V·布罗金, J·C·卡尔森, J·D·本森 申请人:箭头研究公司