融合蛋白的小分子疏水性标记和引起的其降解的制作方法
【专利摘要】本发明涉及用小分子在活体系统中调节任意感兴趣的蛋白质的能力。具体地，本发明涉及这样的发现：附着疏水部分到蛋白质的表面可模拟蛋白质的部分变性状态，从而使细胞质量控制机构引起其蛋白酶体降解。本发明的方面涉及双功能小分子，其结合一些蛋白质——包括，例如自标记标签，诸如细菌脱卤素酶(HaloTag蛋白质)并在其表面上呈现疏水基团。用疏水部分(例如，金刚烷基部分)疏水性标记HaloTag蛋白质得以实现，并且，标记引起细胞培养物中的胞质蛋白、异戊二烯化蛋白和跨膜融合蛋白降解。本发明还证明，通过降解在斑马鱼胚胎中表达的蛋白质和通过抑制小鼠中RasG12V-驱动的肿瘤发展，疏水性标记的体内有用性。因此，疏水性标记HaloTag融合蛋白提供对任何感兴趣的蛋白质的小分子控制，使其成为确认疾病模型中潜在的药物靶标的理想系统。
【专利说明】融合蛋白的小分子疏水性标记和引起的其降解
发明领域[0001]本发明涉及化合物和组合物，其可用于干扰和/或扰乱跨膜蛋白质或细胞内蛋白质的功能，以确定或确认蛋白质作为感兴趣的蛋白质。除了化合物和方法外，本发明还涉及确定或确认蛋白质作为用作生物活性剂(药物)靶标的感兴趣的蛋白质以治疗疾病状态或状况的方法。
[0002]相关申请和政府支持
[0003]本发明要求2010年12月7日提交的、名称为“Regulation of Protein Functionin Live Animals via Hydrophobic Tagging(通过疏水标记调节活体动物内的蛋白质功能)”的临时申请序列号61/420，584和2011年9月I日提交的、名称与本申请相同的61/530,014的优先权，其通过引用以其整体并入本文。
[0004]本发明是以国立卫生研究院(National Institutes of Health) (NIH)授予的授权号R01A1084140在政府的支持下进行的。政府在本发明中享有一定权利。
[0005]发明背景
[0006]化学生物学的主要挑战之一仍在于利用小分子干扰任意细胞内蛋白质的功能的能力。虽然已经朝向发展特定蛋白质的单独的配体取得了显着进步，但只有约300种核准药物的分子祀标被表征1O此外，经现有方法归类为“无法制药的(undruggable) ”的蛋白质组部分估计约为80%2。很可能，许多有吸引力的药物候选物尚待发现，并且，药物开发未来的发展将能够克服被认为是“无法制药的”祀标3，4的界限。因此，对生物学家的挑战仍在于确定那些致病药物靶标。为此，深度测序、微阵列技术和全基因组RNAi筛选的进步已被成功地用于确定有前途的新药物靶标。例如，全基因组RNAi筛选已被用于确定与突变癌基因的合成致死相互作用和用于确定各种致病感染必需的基因5_7。
[0007]尽管靶标确定是药物开发中明显重要的第一步，但对这些潜在靶标的体内确认仍是挑战。这部分是由于基于蛋白质功能体外抑制确定的任何抑制性化合物的不可预测的药代动力学/药物动力学。换言之，小分子抑制剂不能产生期望的体内结果是其体内代谢的无法预料的后果？或者仅仅其靶标蛋白质是差的药物靶标？为解决该问题，需要一般的方法来从功能上确认推定的疾病相关蛋白质的调节是否导致期望的体内结果。RNAi为推定药物靶标的生物确认提供最初的预示，然而，双链体RNA的运输和稳定性仍是在整个动物设置(setting)中敲除mRNA表达中的主要障碍8。在不存在靶标蛋白质的直接配体的情况下，当前存在三种基于小分子的方法，来控制感兴趣的蛋白质(POI)的功能9。首先，植物激素生长素可用于使植物E3泛素连接酶(TIRl)与AUX/IAA转录阻抑物(Aidl)的结构域进行二聚，该结构域在融合于POI时可通过接近TIRl被泛素化1(1。该方法要求融合POI与Aidl，同时引入植物E3连接酶TIRl到细胞中。用于使蛋白质功能失调的第二种一般方法涉及FKBP12和来自mTOR的FKBP12-雷帕霉素结合(FRB)结构域的二聚化。已经证明通过该方法可将POI补充到蛋白酶体或补充到线粒体外膜1H3。再次，至少两种融合蛋白必须被引入到细胞中，以使该系统发挥作用9。最后，已经发现了两个去稳定结构域(DDs)——一个基于FKBP12蛋白质，另一个基于大肠杆菌(E.coli)DHFR蛋白质14’15，以使DD-POI融合蛋白不稳定。导致降解的DD可通过包含FK50616衍生物(在诱变处理的FKBP12的情况下)或大肠杆菌DHFR抑制剂三甲氧苄二氨嘧啶(在DHFR的情况下)而变稳定，最终导致融合蛋白水平增加。虽然DD方法已成功用于若干研究中17_2°，但它需要配体的持续存在，以稳定表达融合蛋白。在研究可能不接收足够的稳定配体的发育中胚胎时或在研究POI的长期作用时一在这种情况下，配体必须在研究期间内被注射到动物中，该要求可能是个问题。而且，在POI长期表达的情况下，必须考虑POI水平由于稳定化配体的间歇注入造成的可能波动。
[0008]发明概述
[0009]本发明涉及包含疏水部分的疏水化合物，该疏水部分连接于反应性连接体，优选卤代烷(haloalkane)反应性连接体(即，连接体，其包含与卤化酶/水解酶自标记标签诸如halotag具有反应性的卤代烷部分)，该反应性连接体与融合蛋白形成共价键，连接疏水化合物与融合蛋白。根据本发明的化合物可用于结合融合蛋白，其中，融合蛋白包含感兴趣的蛋白质(例如，潜在的药物或其它生理学靶标)和自标记标签(诸如halotag (halo标签)、snaptag(snap 标签)、cliptag(clip 标签)、ACPtag(ACP 标签)、MCPtag(MCP 标签),除了别的以外)，该自标记标签可用于结合疏水化合物与融合蛋白。在本发明的优选方面，疏水化合物包含卤代烷反应性连接体，借助于该卤代烷反应性连接体，疏水部分可通过卤代烷反应性连接体上卤化酶自标记标签(例如，HaloTag)的作用而连接于融合蛋白。当反应后，疏水部分共价结合于融合蛋白。出人意料地发现，共价连接于融合蛋白的疏水部分致使融合蛋白降解(通过与感兴趣的蛋白质相互作用/降解)，导致蛋白质变性和融合蛋白的蛋白酶体降解。连接于融合蛋白的疏水部分在降解融合蛋白中的作用可用于分析中，以确定感兴趣的蛋白质对生物学过程——例如疾病状态或状况的调节，诸如癌细胞或组织的生长或抑制——的重要性。确定感兴趣的蛋白质的重要性可用于确立感兴趣的蛋白质作为生物活性剂包括小分子药剂的潜在靶标，以治疗由感兴趣的蛋白质调节的疾病状态或状况。
[0010]在根据本发明确定感兴趣的蛋白质是否是潜在的生物活性剂(例如，药物)靶标的方法中，将疏水性标记的融合蛋白一包含感兴趣的蛋白质一暴露于细胞，并且测量细胞内或细胞表面上疏水性标记的融合蛋白的降解的影响，以确定感兴趣的蛋白质是否是潜在的药物靶标(即，调节疾病或状况，针对该疾病或状况药物或其它治疗可证明是有用的)。在优选实施方式中，该方法包括共价连接融合蛋白一包含感兴趣的蛋白质和自标记多肽一于疏水部分。这可通过表达两种多肽作为融合蛋白而实现。
[0011]在第一方法方面，本发明包括如下步骤:
[0012]1.提供疏水性标记的融合蛋白，其中所述融合蛋白包含感兴趣的蛋白质和共价连接于所述融合蛋白的疏水部分，其中所述疏水部分能够在细胞内或细胞表面上降解所述融合蛋白；
[0013]2.暴露利用所述感兴趣的蛋白质的细胞于所述疏水性标记的融合蛋白(例如，通过融合蛋白的细胞内表达或通过将细胞暴露于融合蛋白)，其中，融合蛋白可任选地和优选地在所述细胞内或其表面上通过小分子标记有疏水部分，所述小分子以疏水部分标记融合蛋白的自标记多肽；
[0014]3.测量细胞内或细胞表面上融合蛋白的降解；和
[0015]4.确定融合蛋白的降解是否与蛋白质作为通过感兴趣的蛋白质调节的疾病和/或状况的生物活性剂(例如，药物)的潜在祀标相一致地通过细胞的表型响应变化(例如，被鉴定的细胞的生长和/或活性变化)调节细胞的生物学活性。
[0016]在优选方面，根据本发明的方法利用融合蛋白——包含感兴趣的蛋白质和疏水地标记融合蛋白的自标记多肽——确定感兴趣的蛋白质是否是潜在的生物活性剂(例如，药物)靶标。该方法包括如下步骤:
[0017]1.提供融合蛋白，其包含感兴趣的蛋白质和多肽自标记标签——在体外或体内，包括在细胞内或细胞表面上；
[0018]2.共价连接所述融合蛋白与化合物，该化合物包含疏水基团(优选地，不是ClogP至少约为1.5的荧光部分)和反应性连接体，其中，反应性连接体是自标记标签的底物，其中所述疏水基团共价连接于所述融合蛋白，从而产生疏水性标记的融合蛋白；
[0019]3.任选地，分离所述疏水性标记的融合蛋白；
[0020]4.暴露利用所述感兴趣的蛋白质的细胞于所述疏水性标记的融合蛋白；
[0021]5.测量所述细胞内或其表面上所述融合蛋白的降解；和任选地
[0022]6.确定所述融合蛋白的所述降解是否与蛋白质作为通过感兴趣的蛋白质调节的疾病和/或状况的生物活性剂(例如，药物)的潜在靶标相一致地(通过细胞的表型响应变化，例如，被鉴定的细胞的生长和/或活性变化)调节所述细胞的生物学活性。
[0023]在本发明的可选方面，本发明涉及引起细胞中融合蛋白降解的方法，该方法包括如下步骤:
[0024]1.在细胞中表达融 合蛋白，其中所述融合蛋白包含感兴趣的蛋白质和自标记多妝标签；
[0025]2.在细胞内或所述细胞表面上使所述表达的融合蛋白与化合物反应,所述化合物包含疏水基团和与所述自标记多肽标签具有反应性的基团，其中所述化合物在与所述自标记多肽标签反应后与所述融合蛋白形成共价键，从而形成疏水性标记的融合蛋白；和
[0026]3.使所述融合蛋白在所述细胞内或其表面上降解。
[0027]在本发明的优选方面，在相同的细胞内或其表面上产生融合蛋白，并发生融合蛋白的疏水标记，在该细胞中，感兴趣的蛋白质被利用，以便在广生融合蛋白并且疏水性标记所产生的融合蛋白的相同细胞中确定感兴趣的蛋白质的相关性。因此，在本发明的某些优选方面，融合蛋白通过反应性连接体在体内/在细胞内或细胞表面上共价连接于疏水部分，其通过在细胞内表达融合蛋白(包括在测试动物中，诸如小鼠、大鼠或其它哺乳动物)和暴露融合蛋白于包含疏水部分和反应性连接体的化合物(例如,化合物可被体内施用给测试动物或暴露于在培养基中生长的细胞)进行，其中，连接于融合蛋白的疏水部分将与感兴趣的蛋白质——潜在的重要药物靶标——一致地引起融合蛋白在细胞内或细胞表面上降解，具有可能产生的和可测量的表型响应。注意，融合蛋白可在细胞内产生，并通过应用信号和/或细胞自身的或与融合蛋白一起表达的锚定肽序列锚定到细胞表面上。这样的方法在本领域中是众所周知的，其使得融合蛋白被表达和锚定在细胞表面上，以连接疏水部分。考虑本发明可用于在细胞表面上发挥作用的蛋白质以及在细胞内发挥作用的蛋白质。
[0028]在本发明中，融合蛋白包含感兴趣的蛋白质和多肽自标记标签(例如，Halotag、Snaptag、Cliptag、ACP标签或MCP标签)，疏水部分可通过反应性连接体结合到该多肽自标记标签。在Halotag融合蛋白的情况下,反应性连接体包含卤代烷基团,其与Halotag的卤化酶反应，以与融合蛋白产生共价键。在Snaptag融合蛋白的情况下，反应性连接体包含苄基鸟嘌呤底物，其与DNA修复蛋白质O6-烷基鸟嘌呤-DNA烷基转移酶反应，以于融合蛋白上提供共价连接的疏水部分。在Cliptag融合蛋白的情况下，反应性连接体包含02-苄基胞嘧啶部分，以于融合蛋白上提供共价连接的疏水部分。在ACP标签的情况下，反应性连接体包含辅酶A衍生物(CoA衍生物)，其通过由酰基载体蛋白质(ACP)磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶AcpS (ACP合成酶)催化的翻译后修饰进行共价结合。在MCP标签(突变体)的情况下，反应性连接体包含辅酶A衍生物，其通过由磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶Sfp (SFP合成酶)，而不是AcpS，催化的翻译后修饰进行共价结合。注意，ACP和MCP标签可用于提供疏水性标记的融合蛋白，该融合蛋白不能穿透细胞——它们限于应用于作为表面蛋白质的感兴趣的蛋白质。[0029]在上述测量步骤中，可利用确定和量化蛋白质的标准方法，通过测量所述细胞内或其表面上非降解的或降解的融合蛋白，量化降解的蛋白质。这些方法包括——除了其它方法之外——利用连接于报道分子诸如荧光剂或其它报道分子的蛋白质特异性抗体，这样的方法包括免疫分析(例如，ELISA，除了别的以外)和免疫印迹、吸光度分析、质谱法和蛋白质组学方法——除了许多别的以外。定量样品中具体蛋白质的方法在本领域中是众所周知的，并且，容易用于根据本发明的方法。对降解的蛋白质和这样的降解对细胞功能例如细胞生长和/或增殖(例如，细胞死亡)或细胞的其它特性(例如，生物学、生理学特性)的影响的分析证明感兴趣的蛋白质对细胞生长和功能的重要性，并确立感兴趣的蛋白质是否是疾病状态或状况的调节因子，从而确立感兴趣的蛋白质是否是治疗所述疾病状态或状况的潜在靶标(生物活性剂，包括药物)。将感兴趣的蛋白质确定为药学靶标将允许分析发展，以确定显示如感兴趣的蛋白质的潜在抑制剂和/或激动剂的活性的化合物和其它生物活性剂。
[0030]在一个方面，根据本发明的化合物可由如下通式表示:
[0031]
===, L]^
[0032]其中，是疏水基团，不是报道基团(例如，荧光基团)，其ClogP至少约为1.5或具体如本文另外描述；和
[0033]Lr 是连接基团，其具有反应部分，该反应部分与融合蛋白的自标记多肽
标签反应该融合蛋白包含所述自标记标签和感兴趣的蛋白质，以在所述基团
和所述融合蛋白之间形成共价键,其中所述疏水基团促进共价连接于所述基团的所述融合蛋白中的所述感兴趣的蛋白质的降解。[0034]在根据本发明的可选实施方式中，根据本发明的化合物包含根据如下化学结构的化合物:
[0035]
【权利要求】
1.根据下式的化合物:
2.权利要求1所述的化合物，其中所述疏水基团不是报道基团。
3.权利要求1所述的化合物，其中所述疏水基团不是荧光报道基团。
4.权利要求1-3任一项所述的化合物，其中所述自标记多肽标签是卤代烷脱卤素酶(halotag2 或 halotag7)自标记多肽标签(SEQ ID N0:1 或 SEQ ID NO: 2) ?
5.权利要求1-3任一项所述的化合物,其中所述自标记多肽标签选自:snaptag(SEQID NO: 3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO:6)、cliptag(SEQ ID NO: 7)、ACPtag(SEQID NO:8、SEQ ID NO:9)和 MCPtag(SEQ ID NO: 10)。
6.权利要求4所述的化合物，其中反应性基团是卤烷基，其任选地被单醚或二醚基团取代。
7.权利要求6所述的化合物，其中所述卤烷是C2-C12氯烷基，其任选地被单醚或二醚基团取代。
8.权利要求6所述的化合物，其中所述反应性基团是
9.权利要求5所述的化合物，其中所述自标记标签是O6-烷基鸟嘌呤-DNA烷基转移酶，其特异性地与苄基鸟嘌呤(BG)衍生物(SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ IDNO:6)反应。
10.权利要求9所述的化合物，其中所述反应性基团是
11.权利要求5所述的化合物，其中所述自标记标签是O6-烷基鸟嘌呤-DNA烷基转移酶，其特异性地与苄基胞嘧啶(BC)衍生物(cliptag)反应。
12.权利要求9所述的化合物，其中所述反应性基团是
13.权利要求5所述的化合物，其中所述自标记标签是磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶AcpS (SCP合成酶)，其特异性地与辅酶A衍生物(ACPtag、SEQ ID NO: 8或SEQ ID NO: 9)反应。
14.权利要求5所述的化合物，其中所述自标记标签是磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶Sfp (Sfp合成酶)(SEQ ID NO: 10)，其特异性地与辅酶A衍生物反应。
15.权利要求13或14所述的化合物，其中所述反应性基团是
16.根据如下化学结构的化合物:
17.权利要求16所述的化合物，其中所述疏水基团的ClogP至少约为1.5。
18.权利要求16所述的化合物，其中所述疏水基团是来自本文图14的基团。
19.权利要求16所述的化合物，其中，Z是键、-(CH2)1-CK-(CH2)1-S, -(CH2)1-N-R,(CH2^X1Y1基团，其中，X1Y1形成酰胺基团或氨基甲酸乙酯基团、酯或硫酯基团，或
20.权利要求19所述的化合物,其中，
21.权利要求19所述的化合物，其中，YK是与所述融合蛋白的自标记标签反应的基团。
22.权利要求21所述的化合物，其中所述自标记标签是halotag2或7(SEQ ID NO: KSEQ ID N0:2)、snaptag(SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID N0:6)、cliptag(SEQ ID NO:7)、ACPtag(SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9)或 MCPtag(SEQ ID NO:10)。
23.权利要求21所述的化合物，其中，Yk是:
24.权利要求19所述的化合物，其中，Yk是
25.权利要求19所述的化合物，其中所述疏水基团的ClogP至少为约1.5。
26.权利要求19所述的化合物，其中所述疏水基团是来自本文图14的基团。
27.根据本文图4的化合物HyT。
28.根据如下结构的化合物:
29.根据权利要求28的如下化学结构的化合物:
30.根据权利要求28或29所述的化合物，其中所述疏水基团的ClogP至少约为1.5。
31.权利要求28-30任一项所述的化合物，其中所述疏水基团是来自本文图14的基团。
32.权利要求28-31任一项所述的化合物，其中，Z是键、-(CH2)1-CK-(CH2)1-S, -(CH2)1-N-R、( CH2^XiYl基团，其中，X1Y1形成酰胺基团或氨基甲酸乙酯基团、酯或硫酯基团或
33.权利要求31或32所述的化合物，其中，是基团或酰胺基团。
34.权利要求28-33任一项所述的化合物，其中所述自标记标签是halotag2或7(SEQID NO:1、SEQ ID NO:2),snaptag(SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:5,SEQ ID NO:6),cliptag(SEQ ID NO:7)、ACPtag(SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9)或 MCPtag(SEQ ID NO:10)。
35.权利要求28-34任一项所述的化合物，其中所述感兴趣的蛋白质是结构蛋白质、受体、酶、细胞表面蛋白质、涉及催化活性、芳化酶活性、传动蛋白活性、解旋酶活性、代谢过程、抗氧化活性、蛋白水解、生物合成、激酶活性、氧化还原酶活性、转移酶活性、水解酶活性、裂合酶活性、异构酶活性、连接酶活性、酶调节因子活性、信号转导蛋白活性、结构分子活性、结合活性、细胞运动性、膜融合、细胞通信、生物学过程调节、发育、细胞分化、刺激物响应的蛋白质、行为蛋白质、细胞黏着蛋白质、涉及细胞死亡、蛋白质转运体活性、核转运、离子转运蛋白活性、通道转运蛋白活性、载体活性、透性酶活性、分泌活性、电子转运蛋白活性、发病机理、蛋白伴侣调节因子活性、核酸结合活性、转录调节因子活性、细胞外组构和生源说活性或翻译调节因子活性的蛋白质。
36.权利要求28-35任一项所述的化合物，其中所述感兴趣的蛋白质是真核蛋白质。
37.权利要求28-35任一项所述的化合物，其中所述感兴趣的蛋白质是原核蛋白质。
38.确定感兴趣的蛋白质是否是生物活性剂的潜在靶标或药物靶标的方法，包括如下步骤: a.提供疏水性标记的融合蛋白，其中所述融合蛋白包含所述感兴趣的蛋白质和共价连接于所述融合蛋白的疏水部分，其中所述疏水部分能够在细胞内或细胞表面上降解所述融合蛋白； b.暴露利用所述感兴趣的蛋白质的细胞于所述疏水性标记的融合蛋白，其中在所述细胞内或所述细胞表面上所述融合蛋白任选`地标记有所述疏水部分； c.测量所述细胞内或所述细胞表面上所述融合蛋白的降解；和 d.确定所述融合蛋白的所述降解是否与蛋白质作为通过所述感兴趣的蛋白质调节的疾病和/或状况的生物活性剂或药物的潜在祀标相一致地通过所述细胞的表型响应变化调节所述细胞的生物学活性。
39.权利要求38所述的方法，其中所述融合蛋白被表达于利用所述感兴趣的蛋白质的所述细胞内或其表面上。
40.确定感兴趣的蛋白质是否是潜在的生物活性剂靶标或药物靶标的方法，包括如下步骤:` 1.通过在细胞群内表达融合蛋白，提供所述融合蛋白，其包含感兴趣的蛋白质和多肽自标记标签；` 2.任选地，分离所述融合蛋白； `3.任选地，暴露利用所述感兴趣的蛋白质的细胞群于所述分离的融合蛋白； ` 4.在细胞内或细胞表面上共价连接所述融合蛋白与化合物，所述化合物包含疏水基团和反应性连接体，其中，所述反应性连接体具有反应性基团，所述反应性基团是所述自标记标签的底物，其中所述疏水基团共价连接于所述融合蛋白，从而在细胞内或所述细胞表面上产生疏水性标记的融合蛋白； ` 5.测量所述细胞内或其表面上所述融合蛋白的降解；和 ` 6.任选地确定所述融合蛋白的所述降解是否与所述感兴趣的蛋白质相一致地通过所述细胞的表型响应变化调节所述细胞的生物学活性，所述感兴趣的蛋白质是通过所述感兴趣的蛋白质调节的疾病和/或状况的生物活性剂或药物的潜在靶标。
41.确定感兴趣的蛋白质是否是潜在的生物活性剂靶标或药物靶标的方法，包括如下步骤: 1.通过在利用所述感兴趣的蛋白质的细胞群内表达融合蛋白，提供所述融合蛋白，其包含感兴趣的蛋白质和多妝自标记标签； 2.在所述细胞内共价连接所述融合蛋白与化合物，所述化合物包含疏水基团和反应性连接体，其中，所述反应性连接体具有反应性基团，所述反应性基团是所述自标记标签的底物，其中所述疏水基团共价连接于所述融合蛋白，从而在所述细胞内或其表面上产生疏水性标记的融合蛋白； 3.测量所述细胞内或其表面上所述融合蛋白的降解；和 4.任选地确定所述融合蛋白的所述降解是否与所述感兴趣的蛋白质相一致地通过所述细胞的表型响应变化调节所述细胞的生物学活性，所述感兴趣的蛋白质是通过所述感兴趣的蛋白质调节的疾病和/或状况的生物活性剂或药物的潜在靶标。
42.权利要求40或41所述的方法，其中所述自标记多肽标签是halotag2或7(SEQ IDNO: 1、SEQ ID NO:2), snaptag(SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6),cliptag(SEQ ID NO:7)、ACPtag(SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9)或 MCPtag(SEQ ID NO:10)。
43.权利要求38-42任一项所述的方法，其中所述疏水基团不是报道基团。
44.权利要求38-42任一项所述的方法，其中所述疏水基团不是荧光报道基团。
45.权利要求40-44任一项所述的方法，其中所述自标记多肽标签是卤代烷脱卤素酶(halotagl 或 halotag2)自标记多肽标签(SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO:2) ?
46.权利要求45所述的方法，其中所述反应性基团是卤烷基，其任选地被单醚或二醚基团取代。
47.权利要求46所述的方法，其中所述卤代烷是C2-C12氯烷基，其任选地被单醚或二醚基团取代。
48.权利要求46所述的方法，其中所述反应性基团是
49.权利要求40-42任一项所述的方法，其中所述自标记标签是O6-烷基鸟嘌呤-DNA烷基转移酶，其特异性地与苄基鸟嘌呤(BG)衍生物(SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ IDNO: 5、SEQ ID NO:6)反应。
50.权利要求49所述的方法，其中所述反应性基团是
51.权利要求40-42任一项所述的方法，其中所述自标记标签是O6-烷基鸟嘌呤-DNA烷基转移酶，其特异性地与苄基胞嘧啶(BC)衍生物(SEQ ID NO:7)反应。
52.权利要求51所述的方法，其中所述反应性基团是
53.权利要求40-42任一项所述的方法，其中所述自标记标签是磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶AcpS(SCP合成酶)，其特异性地与辅酶A衍生物(SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9)反应。
54.权利要求40-42任一项所述的方法，其中所述自标记标签是磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶Sfp (Sfp合成酶)，其特异性地与辅酶A衍生物(SEQ ID NO: 10)反应。
55.权利要求53或54所述的方法，其中所述反应性基团是
56.权利要求38-55任一项所述的方法，其中所述感兴趣的蛋白质是结构蛋白质、受体、酶、细胞表面蛋白质、涉及催化活性、芳化酶活性、传动蛋白活性、解旋酶活性、代谢过程、抗氧化活性、蛋白水解、生物合成、激酶活性、氧化还原酶活性、转移酶活性、水解酶活性、裂合酶活性、异构酶活性、连接酶活性、酶调节因子活性、信号转导蛋白活性、结构分子活性、结合活性、细胞运动性、膜融合、细胞通信、生物学过程调节、发育、细胞分化、刺激物响应的蛋白质、行为蛋白质、细胞黏着蛋白质、涉及细胞死亡、蛋白质转运体活性、核转运、离子转运蛋白活性、通道转运蛋白活性、载体活性、透性酶活性、分泌活性、电子转运蛋白活性、发病机理、蛋白伴侣调节因子活性、核酸结合活性、转录调节因子活性、细胞外组构和生源说活性或翻译调节因子活性的蛋白质。
57.权利要求38-56任一项所述的方法，其中所述感兴趣的蛋白质是真核蛋白质。
58.权利要求38-56任一项所述的方法，其中所述感兴趣的蛋白质是原核蛋白质。
59.权利要求38-58任一项所述的方法，其中所述疏水基团的ClogP至少为约1.5。
60.权利要求38-58任一项所述的方法，其中所述疏水基团是来自本文图14的基团。
61.权利要求38-58任一项所述的方法，其中所述疏水基团不是报道基团。
62.权利要求38-58任一项所述的方法，其中所述疏水基团不是荧光部分。
63.权利要求40-62任一项所述的方法，其中所述疏水性标记的融合蛋白是根据如下结构的化合物:
64.权利要求63所述的方法，其中所述化合物根据如下化学结构:
65.权利要求 63 或 64 所述的方法，其中，Z 是键、-(CH2)1-CK -(CH2)1-S, -(CH2)1-N-R,(CH2)^XiYi基团，其中，X1Y1形成酰胺基团或氨基甲酸乙酯基团、酯或硫酯基团或
66.权利要求65所述的方法，其中，
67.权利要求38-66任一项所述的方法，其中所述蛋白质的降解利用免疫分析、免疫印迹、吸光度分析、质谱法或蛋白质组学测量。
68.引起细胞中融合蛋白降解的方法，所述方法包括: `1.在细胞中表达融合蛋白，其中所述融合蛋白包含感兴趣的蛋白质和自标记多妝标签; ` 2.在细胞内或所述细胞表面上使所述表达的融合蛋白与化合物反应,所述化合物包含疏水基团和与所述自标记多肽标签具有反应性的基团，其中所述化合物在与所述自标记多肽标签反应后与所述融合蛋白形成共价键，以形成疏水性标记的融合蛋白；和 ` 3.使所述融合蛋白降解。
【文档编号】A61P31/00GK103502275SQ201180066936
【公开日】2014年1月8日 申请日期:2011年12月6日 优先权日:2010年12月7日
【发明者】C·M·克瑞武兹, H·S·泰, A·R·斯彻尼孔斯, T·尼克利萨, T·三德博格 申请人:耶鲁大学