专利名称：具有模拟超氧化物歧化酶功能的角蛋白铜离子结合体的制作方法
技术领域：
本发明涉及人工模拟抗氧化剂制备技术领域中的抗氧化酶模拟物，尤其涉及具有模拟超氧化物歧化酶功能的角蛋白铜离子结合体。
背景技术：
角蛋白是蛋白质的一种，在自然界中非常丰富，我国年产几十万吨，广泛存在于人和动物的表皮、毛发、蹄、壳、爪及角等中，但其通常被作为一种环境污染有机废弃物而丢弃。然而，角蛋白作为一种可再生资源，却具有很大的回收利用价值。天然角蛋白的加工利用已经有很长的历史。随着对角蛋白的理论研究和应用研究的开展，角蛋白已经广泛应用于饲料和纺织业中。基于高分子量的角蛋白具有很高的机械强度、优良的加工性能、可降解性、良好的生物相容性、无毒和价格低廉等优点，目前国内外有很多人正在研究利用角蛋白开发表面活性剂、絮凝剂、可生物降解包装材料、分离膜、伤口敷料、氨基酸产品、系列保健品和化妆品等。例如以角蛋白为原料制备的表面活化剂可以使假发表面附着一层和人发化学成分相同的角蛋白质，使假发丝变成和人发一样具有柔软、顺畅；以角蛋白为原料制备的角蛋白固体纤维或粉末可用于高吸水性材料、赋形剂及具生物相容性的粘弹性填料等的制备中；以羽毛角蛋白粉为原料制备的角蛋白膜具有良好的生物可降解性，可作为药物载体用于膜剂药物的制备中。因此，拓展羽毛角蛋白的废物再利用途径有着十分重要的意义。超氧阴离子自由基(SuperoxideAnion Free Radical, SAFR ；02"0 是代谢过程中产生的第一个自由基，而超氧化物歧化酶(SOD)是一类能够催化超氧阴离子自由基发生歧化反应，平衡体内SAFR的金属酶。SOD在临床上可以治疗多种疾病，如SOD具有防止再灌注损伤，减轻炎症反应及延缓衰老等作用。天然SOD虽具有优异的清除SAFR的性能，但用于临床领域的SOD酶蛋白尚存在许多问题和缺点，如天然SOD从动物的血浆中提取过程复杂，成本高；在生物体内容易失活(体内半衰期5 8min)等，均使其药用价值受到很大限制，因此制备能消除SAFR的高效、无毒的模拟酶成为研究的热点。迄今为止，许多SOD模拟物已经被合成和检测，如金属卟啉配合物、大环金属配合物、希夫碱金属配合物等，这些SOD模拟物具有合成方法简单、价格低廉、可大量生产、稳定性高等优点，可以很好的克服天然SOD 本身的局限性，已经用在抗炎症，抑制肿瘤生长，治疗心血管疾病等临床应用中。本发明对难以重复溶于水的羽毛角蛋白进行处理，进一步与金属离子进行结合， 成功制备了角蛋白铜离子结合体，用此方法不仅制得了一种具有良好生物相容性和高抗氧化活性的大分子SOD模拟物，而且使羽毛角蛋白达到了废物再利用，既得到了一种高效的超氧化物歧化酶模拟物，又可用于有机废弃物资源化，保护环境。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种高效、价格低廉且制备方法简单的具有模拟超氧化物歧化酶功能的角蛋白铜离子结合体。为解决上述问题，本发明所述的具有模拟超氧化物歧化酶功能的角蛋白铜离子结
3合体，其特征在于该结合体由羽毛角蛋白与金属铜离子(Cu2+)结合而成，其中羽毛角蛋白的物质的量与金属铜离子的物质的量的比值为I : 5 I : 100。如上所述的具有模拟超氧化物歧化酶功能的角蛋白铜离子结合体的制备方法，包括以下步骤(I)可溶性角蛋白的制备将羽毛角蛋白、Na2S2O3固体放入二次去离子水中，并加入浓度为2mol/L的NaOH溶液，调节PH值至5 9，常温下密封避光搅拌6 12h，得可溶性角蛋白(FK)溶液；所述羽毛角蛋白与所述Na2S2O3固体的质量比为5 20 10 60 ;所述羽毛角蛋白与所述二次去离子水的质量体积比为5 20 : 100 ;所述二次去离子水与所述NaOH溶液的体积比为 100 O.05 ；(2)角蛋白铜离子结合体的制备将浓度为25mmol/L的Cu (OAc)2溶液与所述可溶性角蛋白(FK)溶液避光搅拌反应 12h后，即得一系列角蛋白铜离子结合体(FK-Cu);该角蛋白铜离子结合体(FK-Cu)在O 4°C条件下避光保存即可；所述Cu(OAc)2溶液与所述可溶性角蛋白(FK)溶液的体积比为 O. 01 O. 20 10。如上所述的具有模拟超氧化物歧化酶功能的角蛋白铜离子结合体作为超氧化物歧化酶模拟物在抗氧化中的应用，其特征在于所述角蛋白铜离子结合体的超氧化物歧化酶(SOD)活性为O. 005 O. 12ymol/L，其模拟度为天然SOD酶的68. 3% 683. 3%。本发明与现有技术相比具有以下优点I、本发明以羽毛角蛋白为原料，通过碱溶、还原改性得到可溶性角蛋白溶液，再与金属铜离子复合，得到角蛋白铜离子结合体，应用于超氧化物歧化酶(SOD)的模拟中，模拟度很高。经对比蛋白铜离子结合体FK-Cu20、FK-Cu60与FK(可溶性角蛋白)和天然CuZnSOD 的抗SAFR活性(参见图1)，可知FK的活性很低；FK结合铜离子后，活性显著提高，其中，结合体与天然CuZnSOD相比，模拟度可达到683. 3%。2、本发明制备工艺简单，原料来源广泛，成本低廉，实现了废物的有效再利用，有利于环境保护。
下面结合附图对本发明的具体实施方式
作进一步详细的说明。图I为本发明角蛋白铜离子结合体与天然CuZnSOD的抗SAFR活性对比图。
具体实施例方式实施例I具有模拟超氧化物歧化酶功能的角蛋白铜离子结合体，该结合体由羽毛角蛋白与金属铜离子(Cu2+)结合而成，其中羽毛角蛋白的物质的量与金属铜离子的物质的量的比值为1:5。该具有模拟超氧化物歧化酶功能的角蛋白铜离子结合体的制备方法，包括以下步骤(I)可溶性角蛋白的制备将IOmg羽毛角蛋白、25mg Na2S2O3固体放入IOOmL二次去离子水中，并加入O. 05mL浓度为2mol/L的NaOH溶液，调节pH值至5 9，常温下密封避光搅拌6 12h，得可溶性角蛋白(FK)溶液。(2)角蛋白铜离子结合体的制备将O. OlmL浓度为25mmol/L的Cu(OAc)2溶液与IOmL可溶性角蛋白(FK)溶液避光搅拌反应12h后，即得角蛋白铜离子结合体(FK-Cu)，其中羽毛角蛋白的物质的量与金属铜离子的物质的量的比值为I : 5。该角蛋白铜离子结合体(FK-Cu)在O 4°C条件下避光保存即可。该具有模拟超氧化物歧化酶功能的角蛋白铜离子结合体作为超氧化物歧化酶模拟物在抗氧化中的应用通过氯化硝基四氮唑蓝(NBT)光化学还原法对角蛋白铜离子结合体进行超氧化物歧化酶(SOD)活性测定，其活性为O. 06ymol/L，具有优异的抗SAFR能力， 与天然CuZnSOD相比，模拟度达到68. 3%。具体测定方法如下用照度计控制光强度(4000Lux)。用pH = 7. 80 的 O. 05mol/L NaH2PO4-Na2HPO4 缓冲溶液配制含3. 4X10_6mol/L核黄素，O. 01mol/L蛋氨酸，4. 66 X 10_5mol/L硝基NBT及不同浓度自由基清除剂的混合液，混合液均用空气饱和，置于25°C恒温O. 5hr，每次取3mL混合液于恒定光强度下进行光照，测定加入或不加入配合物时在560nm处不同光照时间后(时间间隔为30s.)溶液的吸光度E，以E对t作图，由图中直线的斜率即可求得吸光度随时间的变化量Λ，比较加入配合物前后吸光度随时间的变化量Aci和Λ，即可求得NBT还原反应受到抑制的百分数(式I)。f%= (Δ0-Δ)/Δ0Χ100%(I)以对Cm(配合物的浓度)作图得到一条曲线，通常以抑制百分数f%= 50%的活性物质的浓度(Cm)作为I个SOD活力单位。得到的活性数据与相同条件获得的天然CuZnSOD的活性比较，经检测，天然 CuZnSOD 的 EC50 为 O. 041 μ mol/L。相比角蛋白(FK)而言，Cu (II)和FK结合后抗SAFR能力明显增强，其SOD活性可与天然CuZnSOD相媲美。实施例2具有模拟超氧化物歧化酶功能的角蛋白铜离子结合体，该结合体由羽毛角蛋白与金属铜离子(Cu2+)结合而成，其中羽毛角蛋白的物质的量与金属铜离子的物质的量的比值为I : 20。该具有模拟超氧化物歧化酶功能的角蛋白铜离子结合体的制备方法，包括以下步骤(I)可溶性角蛋白的制备将5mg羽毛角蛋白、IOmg Na2S2O3固体放入IOOmL 二次去离子水中，并加入O. 05mL 浓度为2mol/L的NaOH溶液，调节pH值至5 9，常温下密封避光搅拌6 12h，得可溶性角蛋白(FK)溶液。(2)角蛋白铜离子结合体的制备将O. 04mL浓度为25mmol/L的Cu(OAc)2溶液与IOmL可溶性角蛋白(FK)溶液避光搅拌反应12h后，即得角蛋白铜离子结合体(FK-Cu)，其中羽毛角蛋白的物质的量与金属铜离子的物质的量的比值为I : 20。该角蛋白铜离子结合体(FK-Cu)在O 4°C条件下避光保存即可。该具有模拟超氧化物歧化酶功能的角蛋白铜离子结合体作为超氧化物歧化酶模拟物在抗氧化中的应用通过氯化硝基四氮唑蓝(NBT)光化学还原法对角蛋白铜离子结合体进行超氧化物歧化酶(SOD)活性测定(测定方法同实施例I)，其活性为O. 018 μ mol/L, 具有优异的抗SAFR能力，与天然CuZnSOD相比，模拟度达到227. 8 %。实施例3具有模拟超氧化物歧化酶功能的角蛋白铜离子结合体，该结合体由羽毛角蛋白与金属铜离子(Cu2+)结合而成，其中羽毛角蛋白的物质的量与金属铜离子的物质的量的比值为I : 50。该具有模拟超氧化物歧化酶功能的角蛋白铜离子结合体的制备方法，包括以下步骤(I)可溶性角蛋白的制备将20mg羽毛角蛋白、60mg Na2S2O3固体放入IOOmL二次去离子水中，并加入O. 05mL 浓度为2mol/L的NaOH溶液，调节pH值至5 9，常温下密封避光搅拌6 12h，得可溶性角蛋白(FK)溶液。(2)角蛋白铜离子结合体的制备将O. IOmL浓度为25mmol/L的Cu(OAc)2溶液与IOmL可溶性角蛋白(FK)溶液避光搅拌反应12h后，即得角蛋白铜离子结合体(FK-Cu)，其中羽毛角蛋白的物质的量与金属铜离子的物质的量的比值为I : 50。该角蛋白铜离子结合体(FK-Cu)在O 4°C条件下避光保存即可。该具有模拟超氧化物歧化酶功能的角蛋白铜离子结合体作为超氧化物歧化酶模拟物在抗氧化中的应用通过氯化硝基四氮唑蓝(NBT)光化学还原法对角蛋白铜离子结合体进行超氧化物歧化酶(SOD)活性测定(测定方法同实施例I)，其活性为O. 012 μ mol/L, 具有优异的抗SAFR能力，与天然CuZnSOD相比，模拟度达到341. 7%。实施例4具有模拟超氧化物歧化酶功能的角蛋白铜离子结合体，该结合体由羽毛角蛋白与金属铜离子(Cu2+)结合而成，其中羽毛角蛋白的物质的量与金属铜离子的物质的量的比值为I : 80。该具有模拟超氧化物歧化酶功能的角蛋白铜离子结合体的制备方法，包括以下步骤(I)可溶性角蛋白的制备将15mg羽毛角蛋白、35mg Na2S2O3固体放入IOOmL二次去离子水中，并加入O. 05mL 浓度为2mol/L的NaOH溶液，调节pH值至5 9，常温下密封避光搅拌6 12h，得可溶性角蛋白(FK)溶液。(2)角蛋白铜离子结合体的制备将O. 16mL浓度为25mmol/L的Cu(OAc)2溶液与IOmL可溶性角蛋白(FK)溶液避光搅拌反应12h后，即得一系列角蛋白铜离子结合体(FK-Cu)，其中羽毛角蛋白的物质的量与金属铜离子的物质的量的比值为I : 80。该角蛋白铜离子结合体(FK-Cu)在O 4°C条件下避光保存即可。该具有模拟超氧化物歧化酶功能的角蛋白铜离子结合体作为超氧化物歧化酶模拟物在抗氧化中的应用通过氯化硝基四氮唑蓝(NBT)光化学还原法对角蛋白铜离子结合体进行超氧化物歧化酶(SOD)活性测定(测定方法同实施例I)，其活性为O. 02 μ mol/L,具有优异的抗SAFR能力，与天然CuZnSOD相比，模拟度达到205. O %。实施例5具有模拟超氧化物歧化酶功能的角蛋白铜离子结合体，该结合体由羽毛角蛋白与金属铜离子(Cu2+)结合而成，其中羽毛角蛋白的物质的量与金属铜离子的物质的量的比值为I 100。该具有模拟超氧化物歧化酶功能的角蛋白铜离子结合体的制备方法，包括以下步骤(I)可溶性角蛋白的制备将18mg羽毛角蛋白、50mg Na2S2O3固体放入IOOmL二次去离子水中，并加入O. 05mL 浓度为2mol/L的NaOH溶液，调节pH值至5 9，常温下密封避光搅拌6 12h，得可溶性角蛋白(FK)溶液。(2)角蛋白铜离子结合体的制备将O. 20mL浓度为25mmol/L的Cu(OAc)2溶液与IOmL可溶性角蛋白(FK)溶液避光搅拌反应12h后，即得一系列角蛋白铜离子结合体(FK-Cu)，其中羽毛角蛋白的物质的量与金属铜离子的物质的量的比值为I : 100。该角蛋白铜离子结合体(FK-Cu)在O 4°C 条件下避光保存即可。该具有模拟超氧化物歧化酶功能的角蛋白铜离子结合体作为超氧化物歧化酶模拟物在抗氧化中的应用通过氯化硝基四氮唑蓝(NBT)光化学还原法对角蛋白铜离子结合体进行超氧化物歧化酶(SOD)活性测定(测定方法同实施例I)，其活性为O. 017 μ mol/L, 具有优异的抗SAFR能力，与天然CuZnSOD相比，模拟度达到241. 2%。实施例6具有模拟超氧化物歧化酶功能的角蛋白铜离子结合体，该结合体由羽毛角蛋白与金属铜离子(Cu2+)结合而成，其中羽毛角蛋白的物质的量与金属铜离子的物质的量的比值为I : 60。该具有模拟超氧化物歧化酶功能的角蛋白铜离子结合体的制备方法，包括以下步骤(I)可溶性角蛋白的制备将8mg羽毛角蛋白、12mg Na2S2O3固体放入IOOmL 二次去离子水中，并加入O. 05mL 浓度为2mol/L的NaOH溶液，调节pH值至5 9，常温下密封避光搅拌6 12h，得可溶性角蛋白(FK)溶液。(2)角蛋白铜离子结合体的制备将O. 05mL浓度为25mmol/L的Cu(OAc)2溶液与IOmL可溶性角蛋白(FK)溶液避光搅拌反应12h后，即得一系列角蛋白铜离子结合体(FK-Cu)，其中羽毛角蛋白的物质的量与金属铜离子的物质的量的比值为I : 60。该角蛋白铜离子结合体(FK-Cu)在O 4°C条件下避光保存即可。该具有模拟超氧化物歧化酶功能的角蛋白铜离子结合体作为超氧化物歧化酶模拟物在抗氧化中的应用通过氯化硝基四氮唑蓝(NBT)光化学还原法对角蛋白铜离子结合体进行超氧化物歧化酶(SOD)活性测定(测定方法同实施例I)，其活性为O. 006 μ mol/L, 具有优异的抗SAFR能力，与大然CuZnSOD相比，模拟度达到683. 3%。
权利要求
1.具有模拟超氧化物歧化酶功能的角蛋白铜离子结合体，其特征在于该结合体由羽毛角蛋白与金属铜离子结合而成，其中羽毛角蛋白的物质的量与金属铜离子的物质的量的比值为I : 5 I : 100。
2.如权利要求I所述的具有模拟超氧化物歧化酶功能的角蛋白铜离子结合体的制备方法，包括以下步骤(1)可溶性角蛋白的制备将羽毛角蛋白、Na2S2O3固体放入二次去离子水中，并加入浓度为2mol/L的NaOH溶液， 调节PH值至5 9，常温下密封避光搅拌6 12h，得可溶性角蛋白溶液；所述羽毛角蛋白与所述Na2S2O3固体的质量比为5 20 10 60 ;所述羽毛角蛋白与所述二次去离子水的质量体积比为5 20 100 ;所述二次去离子水与所述NaOH溶液的体积比为100 0.05;(2)角蛋白铜离子结合体的制备将浓度为25mmol/L的Cu(OAc)2溶液与所述可溶性角蛋白溶液避光搅拌反应12h后， 即得一系列角蛋白铜离子结合体；该角蛋白铜离子结合体在O 4°C条件下避光保存即可； 所述Cu(OAc)2溶液与所述可溶性角蛋白溶液的体积比为O. 01 O. 20 10。
3.如权利要求I所述的具有模拟超氧化物歧化酶功能的角蛋白铜离子结合体作为超氧化物歧化酶模拟物在抗氧化中的应用，其特征在于所述角蛋白铜离子结合体的超氧化物歧化酶活性为O. 005 O. 12ymol/L，其模拟度为天然SOD酶的68. 3%~ 683. 3%0
全文摘要
本发明涉及一种具有模拟超氧化物歧化酶功能的角蛋白铜离子结合体，该结合体由羽毛角蛋白与金属铜离子(Cu2+)结合而成，其中羽毛角蛋白的物质的量与金属铜离子的物质的量的比值为1∶5～1∶100。本发明采用碱溶法、还原法制备了可溶性角蛋白溶液，并将金属铜离子与提取的可溶性角蛋白溶液相结合而制得。本发明应用于超氧化物歧化酶(SOD)的模拟中，模拟度很高，可达到天然SOD的68.3％～683.3％；同时本发明制备工艺简单，原料来源广泛，成本低廉，实现了废物的有效再利用，有利于环境保护。
文档编号A61K38/39GK102585246SQ201210011619
公开日2012年7月18日 申请日期2012年1月13日 优先权日2012年1月13日
发明者何玉凤, 宋鹏飞, 李晓晓, 王荣民, 赵婷婷 申请人:西北师范大学