专利名称：自由脂肪酸受体2在抗肿瘤药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及自由脂肪酸受体2 (FFAR2)诱导细胞凋亡的用途。
背景技术：
生物体内各种组织细胞通过增殖与凋亡来维持数量的平衡。一旦这种平衡被打破就会导致一些疾病的产生，如癌症。细胞凋亡与癌症之间的关系为癌症的治疗提供了新思路。近年来的研究发现细胞凋亡是各种抗癌药物引发细胞死亡的主要方式，从而使得细胞凋亡与癌症之间的关系及细胞凋亡在癌症治疗中的作用成为抗肿瘤研究的新焦点。细胞死亡一般有两种方式，即细胞坏死(necrosis)和细胞凋亡(apoptosis)。细胞坏死通常发生在一群接触的细胞中，是由各种非生理因素，如局部缺血等引起的难以控制的一种破坏现象。它通过干扰细胞能量代谢，引起细胞渗透压不平衡，细胞质肿胀，最终由溶酶体酶导致细胞结构的不可逆性破坏并诱发局部的炎症反应。而细胞凋亡是一种主动的、固有的程序化现象。射线、高温、毒素及各种抗癌药物等生理性或非生理性的因素都可以引起细胞凋亡。凋亡的细胞由于失去细胞间相互联系而与邻近细胞分离，随后细胞表面释放出信号分子被吞噬细胞识别，因此凋亡不损伤周围的细胞。同时，凋亡一般伴有明显的形态学特征，以细胞核的变化为主，表现为核浓缩、细胞浆中细胞器密集、胞膜突出、体积缩小、DNA断裂及形成凋亡小体。组成人体的正常细胞是一个复杂和相互依赖的共同管理、相互调控对方的大环境。一个细胞通过接收生长或者抑制的信号来调节其增殖，从而使每一种组织得以维持一定的大小和形状。而癌细胞则与之截然相反，它们对于正常控制增殖的信号不敏感，只遵循它们自己内在的增殖信号。恶性的肿瘤细胞甚至可以移动、入侵邻近组织，干扰了机体生存所需的器官和组织，并最终导致机体死亡。长期以来，人们认为肿瘤化疗的药物靶细胞是选择性地针对快速分裂的细胞，但在临床上有些现象却无法解释。因为可治疗的癌症有时生长缓慢，而对化疗有抗药性的癌症中也可能在快速分裂。而更多的事实表明，化疗可能是在肿瘤细胞中诱导相应细胞凋亡，而各种细胞凋亡的阈值不同造成了对不同肿瘤细胞治疗的反应不同。如有研究表明在体内用视黄酸处理后T淋巴细胞凋亡；体内对食道癌细胞放疗和化疗(5-氟尿嘧啶、顺钼，博来霉素)处理后能诱导肿瘤细胞凋亡。因此，诱导细胞凋亡已成为抗肿瘤研究的新焦点。游离脂肪酸(free fatty acids,FFA)是生物体的一种重要能量来源，同时也是一种信号分子，具有多种生理作用。FFA的生理功能及其对机体内的营养代谢疾病的调控作用长期以来受到人们的关注，但由于FFA的特异性膜受体一直未被发现，关于其分子机制的认识无法进一步深入。而最新研究找到并鉴定了 FFA的特异性膜受体，使科学家们重新认识了 FFA在健康人及患者体内发挥作用的分子机制。游离脂肪酸受体(FFAR)属于G蛋白偶联受体(GPCR)家族，而鉴于 目前30%以上的药物靶标都是GPCR，因此开发基于FFA受体的高亲和力的药物进而治疗如糖尿病等的复杂的疾病，将有着很大的应用潜力。短链脂肪酸是肠道菌群消化食物过程的产物，而短链脂肪酸亦受体属于游离脂肪酸受体家族。其中，脂肪酸受体2 (FFAR2)又名GPR43，于1997年首次被克隆，但直到2003年之后才被逐渐重视，之后不断有重要发现发表；尤其是2010年，新发表论文数量和质量都是历年之最，足见目前FFAR2的研究已成为国际上一个新的研究热点。文献查阅发现FFAR2在肠道、胃、骨髓、脾脏、外周血单个核细胞、脂肪等组织均有表达，而在免疫相关组织、肠道、脂肪组织中表达较高，因此目前其研究主要集中在免疫、肠炎、脂肪分化领域。文献报道，短链脂肪酸(Short Chain Fatty Acids, SCFAs)均能一定程度上结合FFAR2并激活下游信号通路但亲和力有明显差异，具体顺序为亲和力C2 = C3 > C4 > C5 = C6 (数字代表短链脂肪酸中碳原子数)，而长链脂肪酸则不能激活其下游信号通路。在炎症相关研究方面，文献报道在硫酸葡聚糖(Dextran sulphate sodium, DSS)诱导的肠炎模型中，通过在造模小鼠饮水中添加FFAR2激动剂醋酸钠(Sodium Acetate)能够显著抑制肠道炎症反应，并缓解肠道损伤指数。而FFAR2基因敲除小鼠中，醋酸钠处理并不能够显著缓解DSS诱导的肠炎。上述发现提示FFAR2与SCFA的相互作用可能将食物、胃肠道微生物代谢、免疫系统及炎症反应在分子机制上的相互作用联系起来，并发挥着重要的调节作用。然而，上述研究虽然对FFAR2的功能有重要的提示作用，但是有关FFAR2的功能及其作用的分子机制方面还有很多有待探索之处。鉴于FFAR2可能发挥着重要的生理功能，我们利用文献中报道的FFAR2的配体-醋酸盐，利用各种细胞株，研究FFAR2的功能。如图6所示，其为FFAR2的电脑模拟3D结构图，其具有7次跨膜结构，灰色区域代表细胞膜。
发明内容
本发明的目的是提供自由脂肪酸受体2在抗肿瘤药物中的应用。自由脂肪酸受体2可以诱导细胞的凋亡。本发明提供一个基因-自由脂肪酸受体2在抗肿瘤药物中的应用。通过给予自由脂肪酸受体2的配体醋酸钠与丙酸钠，发现该配体能够显著减少小鼠免疫细胞株Raw264.7的活细胞数量；通过在人胚肾细胞株HEK293T中过表达FFAR2基因，发现该细胞系中活细胞的数量显著减少；进一步通过小分子核糖核酸介导的基因沉默技术(siRNA技术)，减少HEK293T细胞株中的FFAR2后，细胞株中活细胞数量显著增加；进一步通过线粒体膜电位检测试剂盒检测发现，在过表达了 FFAR2的HEK293T细胞中，线粒体膜电位显著降低，提示该基因能够诱导细胞凋亡；通过细胞凋亡检测试剂盒(Annexin V-PI)染色并通过流式细胞仪检测后，结果提示在过表达了 FFAR2的HEK293T细胞中凋亡细胞显著增加；本发明首次提供自由脂肪酸受体2在抗肿瘤药物中的应用，其对血液系统及其它种类的肿瘤具有潜在的治疗作用。
:
图1:FFAR2的配体-醋酸盐及FFAR2的配体-丙酮酸盐对Raw264.7细胞生长的影响的不意图；图1A是空白组的不意图；图1B是25mM的FFAR2的配体_醋酸盐的不意图；图1C是加入25mM的FFAR2的配体-丙酮酸盐的示意图；图1D加入不同浓度的FFAR2的配体-醋酸盐及FFAR2的配体-丙酮酸盐的细胞OD值(450nm)的对比图。图2:过表达了 hFFAR2的Raw264.7的活细胞数变化对比图；图2A空白组的细胞示意图；图2B是过表达了 hFF AR2的Raw264.7的细胞示意图；图2C是空白组与过表达了hFFAR2的Raw264.7的细胞与空白组OD值(450nm)的对比示意图。图3:通过siRNA技术减少hFFAR2的表达后HEK293T活细胞变化对比图；图3A是空白组的示意图；图38是通过siRNA技术减少hFFAR2的表达后HEK293T活细胞示意图；图3C是通过siRNA技术减少hFFAR2过表达后的HEK293T细胞与空白组OD值(450nm)对比图。图4:hFFAR2在HEK293T细胞中过表达后细胞线粒体膜电位的变化对比图；图4A是空白组示意图；图48是hFFAR2在HEK293T细胞中过表达后细胞线粒体膜电位示意图；图4C是hFFAR2在HEK293T细胞中过表达后细胞线粒体膜电位的变化与空白组的对比示意图。图5:hFFAR2在HEK293T细胞中过表达后细胞数量变化示意图；图5A空白组AnnexinV及PI染色双阳性的示意图；图5B是hFFAR2在HEK293T细胞中过表达后细胞Annexin V及PI染色双阳性的示意图；图5C是hFFAR2在HEK293T细胞中过表达后AnnexinV及PI染色双阳性与空白组的对比示意图。
图6:FFAR2的电脑模拟3D结构示意图。
具体实施方式
:
下面结合具体实施方式
，详细描述本发明。应理解，这些实施方式仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。本发明公开了自由脂肪酸受体2在抗肿瘤药物中的应用，即自由脂肪酸受体2(FTTAR2)可以诱导细胞的凋亡。
1，自由脂肪酸受体2FFAR2的配体-醋酸盐及丙酮酸盐显著减少了 Raw264.7的活细胞数。如图1所示，FFAR2的配体-醋酸盐及丙酮酸盐对Raw264.7细胞生长的影响的示意图。为了观察FFAR2的激活对小鼠免疫细胞株Raw264.7细胞生长的影响，我们通过给予细胞培养液中加入不同浓度的醋酸盐与丙酮酸盐，处理24小时后，通过CCK-8活细胞计数试剂盒(Cell Counting Kit_8)对处理后细胞计数,观察其对Raw264.7细胞的影响。实验数据如图1A-C所示，图1A是空白组的示意图；图1B是25mM的FFAR2的配体-醋酸盐的示意图；图1C是25mM的FFAR2的配体-丙酮酸盐的示意图；本实施例中的醋酸盐为醋酸钠，丙酮酸盐为丙酮酸钠。通过图1A -1C对比发现，显微镜观察发现醋酸钠与丙酮酸钠处理后，视野中细胞数显著减少。如图1D所示，其为本发明加入不同浓度的醋酸钠和丙酮酸钠的细胞OD值(450nm)的对比示意图，醋酸钠与丙酮酸钠能够以浓度依赖性地减少细胞数，各组活细胞定量数据的统计学分析亦用GraphPad Prism计算,且有统计学意义，'冬p〈0.05，^p<0.01，***/ <% OOlo上述结果显示，FFAR2的配体醋酸盐与丙酮酸盐处理后，能够显著减少小鼠免疫细胞株Raw264.7的细胞数。实施例1: (I)，Raw264.7小鼠巨噬细胞系用RPMI1640中加入10%热灭活的胎牛血清培养(均购自Gibco公司)。(2)，醋酸钠与丙酸钠均用磷酸缓冲液配制成25M的存储液，并于实验中加入对应体积的存储液，得到对应浓度。(3)，用醋酸盐或者丙酸盐处理24小时后，用显微镜观察细胞形态(Olympus DP71纤维观测与拍照系统)，放大倍数:200倍。(4)，处理后的活细胞数量用CCK-8试剂盒定量(杭州碧云天生物技术研究所)。2，人自由脂肪酸受体2 (hFFAR2)的过表达显著减少Raw264.7的活细胞数。
为了研究人的自由脂肪酸受体2 (hFFAR2)对细胞数量的影响，我们克隆了人的自由脂肪酸受体2 (hFFAR2)基因的cDNA序列(美国公共医学图书馆序列号(PubMed):NM_005306.2，mRNA 序列:ATGCTGCCGGACTGGAAGAGCTCCTTGATCCTCATGGCTTACATCATCATCTTCCTCACTGGCCTCCCTG CCAACCTCCTGGCCCTGCGGGCCTTTGTGGGGCGGATCCGCCAGCCCCAGCCTGCACCTGTGCACATCCT CCTGCTGAGCCTGACGCTGGCCGACCTCCTCCTGCTGCTGCTGCTGCCCTTCAAGATCATCGAGGCTGCG TCGAACTTCCGCTGGTACCTGCCCAAGGTCGTCTGCGCCCTCACGAGTTTTGGCTTCTACAGCAGCATCT ACTGCAGCACGTGGCTCCTGGCGGGCATCAGCATCGAGCGCTACCTGGGAGTGGCTTTCCCCGTGCAGTA CAAGCTCTCCCGCCGGCCTCTGTATGGAGTGATTGCAGCTCTGGTGGCCTGGGTTATGTCCTTTGGTCAC TGCACCATCGTGATCATCGTTCAATACTTGAACACGACTGAGCAGGTCAGAAGTGGCAATGAAATTACCT GCTACGAGAACTTCACCGATAACCAGTTGGACGTGGTGCTGCCCGTGCGGCTGGAGCTGTGCCTGGTGCT CTTCTTCATCCCCATGGCAGTCACCATCTTCTGCTACTGGCGTTTTGTGTGGATCATGCTCTCCCAGCCC CTTGTGGGGGCCCAGAGGCGGCGCCGAGCCGTGGGGCTGGCTGTGGTGACGCTGCTCAATTTCCTGGTGT GCTTCGGACCTTACAACGTGTCCCACCTGGTGGGGTATCACCAGAGAAAAAGCCCCTGGTGGCGGTCAAT AGCCGTGGTGTTCAGTTCACTCAACGCCAGTCTGGACCCCCTGCTCTTCTATTTCTCTTCTTCAGTGGTG CGCAGGGCATTTGGGAGAGGGCTGCAGGTGCTGCGGAATCAGGGCTCCTCCCTGTTGGGACGCAGAGGCA AAGACACAGCAGAGGGGACAAATGAGGACAGGGGTGTGGGTCAAGGAGAAGGGATGCCAAGTTCGGACTT CACTACAGAGTAG)。用脂质体法(LipoFectamine2000)将hFFAR转染HEK293T细胞，并用显微镜及CCK-8细胞计数法观察hFFAR2过表达后对细胞数量的影响。实验数据如图2A-C显微镜观察所示(放大200倍)，图2A空白组的细胞示意图；图2B是过表达了 hFFAR2的Raw264.7的细胞示意图；在册1(2931'中过表达hFFAR2 24小时后，该细胞系中的细胞数量明显减少。如图2C所示，图2C是过表达了 hFFAR2的Raw264.7的细胞与空白组OD值(450nm)的对比示意图。通过CCK-8活细胞计数，在HEK293T中过表达hFFAR2后，该细胞系中的活细胞数量显著减少，且各组活细胞定量数据的统计学分析用GraphPad Prism计算，有统计学意义，***/ 〈() QOl0上述结果显示，hFFAR的过表达能够显著减少Raw264.7的活细胞数。实施例2: (I)，HEK293T人胚肾细胞系DMEMl 1995中加入10%的胎牛血清培养(均购自 Gibco 公司)。(2),用脂质体法(LipoFectamine2000,购自 Invitrogen 公司)将 hFFAR表达质粒转染HEK293T细胞。(3)，质粒转染24小时后，用显微镜观察细胞形态并拍照(Olympus DP71纤维观测与拍照系统)，放大倍数:200倍。(4)，用CCK-8细胞计数试剂盒观察hFFAR2过表达24小时后对细胞数量的影响(杭州碧云天生物技术研究所)。3，减少hFFAR2的表达能够显著增加HEK293T活细胞数。为了进一步观察hFFAR2对细胞数的影响，我们在HEK293T中用小干扰RNA( siRNA)的技术，检测了在细胞中减少hFFAR2的表达后，对其活细胞数量的影响。实验结果如图3A-C所示，图3A是空白组 的示意图；图3B通过siRNA技术减少hFFAR2的表达后HEK293T活细胞示意图；显微镜观察显示(放大200倍)，用siRNA干扰掉FFAR2的表达后24h后(siRNA序列:5' CCGAUAACCAGUUGGACGUtt 及 3' ACGUC CAACUGGUUAUCGGtg)，细胞数量明显增力口。图3C通过siRNA技术减少hFFAR2的表达后HEK293T细胞与空白组0D(450nm)值的对比图，通过CCK-8活细胞计数，在HEK293T中减少hFFAR2后，该细胞系中的活细胞数量显著增加，其中各组活细胞定量数据的统计学分析用GraphPad Prism计算，(97，具有统计学意义。 上述结果显示，在所述过表达自由脂肪酸受体2的人胚肾细胞株HEK293T中，通过小分子核糖核酸介导的基因沉默技术减少人胚肾细胞株J1EK293T细胞株中的hFFAR2后，活体细胞数量增加。实施例3: (I),用脂质体转染法(LipoFectamine2000,购自Invitrogen公司)，将针对人FFAR2特异的siRNA (购自上海吉凯生物技术有限公司公司)转染到HEK293细胞中。
(2)，siRNA转染24小时后，用显微镜观察细胞形态并拍照(Olympus DP71纤维观测与拍照系统)，放大倍数:200倍。(3)，用CCK-8细胞计数试剂盒(杭州碧云天生物技术研究所)观察hFFAR2过表达24小时后对细胞数量的影响。4，hFFAR2在HEK293T细胞中过表达，能够显著抑制细胞线粒体膜电位。线粒体膜电位失调是细胞凋亡前期的重要标志之一。为了分析hFFAR2对细胞数影响的机制，进一步通过分析线粒体膜电位的方法，观察了在HEK293T中过表达hFFAR2对线粒体膜电位的影响。如图4所示，hFFAR2在HEK293T细胞中过表达前后细胞线粒体膜电位的变化对比图；如图4A-C所示，图4A是空白组示意图；图4B是hFFAR2在HEK293T细胞中过表达后细胞线粒体膜电位示意图；我们用线粒体膜电位检测试剂盒(JC-1检测试剂盒)检测，用显微镜观察显示(放大200倍)，在过表达了 hFFAR的细胞中，线粒体膜电位失调细胞明显增力口(绿色明显增加)，线粒体膜电位正常明显减少(红色荧光明显减少)。图4C是hFFAR2在HEK293T细胞中过表达后细胞线粒体膜电位的变化与空白组的对比示意图，在HEK293T中过表达hFFAR2后，同时通过荧光检测酶标仪分析该细胞系中的红色荧光与绿色荧光的比值，图4C显示，该比值显著降低(比值低反应细胞膜电位不正常)，并对各组线粒体膜电位活性定量数据的统计学分析用GraphPad Prism计算，衫沐p〈0.001。上述结果显示，在所述过表达自由脂肪酸受体2的人胚肾细胞株HEK293T中，细胞线粒体膜电位降低，FFAR2的激活能够显著促进细胞膜电位的失调。实施例4: (I),用脂质体法(LipoFectamine2000,购自 Invitrogen 公司)将 hFFAR表达质粒转染HEK293T细胞。(2)，质粒转染24小时后，用JC-1线粒体膜电位检测试剂盒(购自杭州碧云天生物技术研究所)检测细胞膜电位变化；红色代表膜电位正常，绿色代表膜电位已被破坏。(3),突光显微镜观察细胞形态并拍照(Olympus DP71纤维观测与拍照系统)，放大倍数:200倍。(4)，用荧光酶标(购自BioTec公司)仪检测绿色及红色荧光强弱，并计算红光/绿光比值，计算线粒体活性。5，hFFAR2在HEK293T细胞中过表达，能够显著增加细胞凋亡。细胞膜状态的变换是细胞凋亡的重要标志，凋亡的细胞呈现Annexin V或/与PI染色阳性。我们用Annexin V与PI染色，通过流式细胞术，观察了在HEK293T中过表达hFFAR2后，对细胞凋亡的影 响。
如图5所示，hFFAR2在HEK293T细胞中过表达后细胞数量变化示意图；实验结果如图5A-B所示，图5A空白组Annexin V及PI染色双阳性的示意图；图5B是hFFAR2在HEK293T细胞中过表达后细胞Annexin V及PI染色双阳性的示意图；流式细胞术结果显示，在过表达了 hFFAR的细胞中，Annexin V与PI双阳性的细胞明显增加。同时图5C是hFFAR2在HEK293T细胞中过表达后Annexin V及PI染色双阳性与空白组的统计学结果对比示意图，图5所示，凋亡细胞明显增多，各组Annexin-V/PI阳性细胞比例的定量数据的统计学分析亦用GraphPad Prism计算，林p〈0.0l。上述结果显示，FFAR2过表达能够显著促进细胞凋亡在所述过表达自由脂肪酸受体2的人胚肾细胞株HEK293T中，凋亡细胞增加，hFFAR2能够显著增加细胞凋亡。实施例5: (1),用脂质体法(LipoFectamine2000,购自 Invitrogen 公司)将 hFFAR表达质粒转染HEK293T细胞。(2)，质粒转染24小时后，用Annexin-V/PI细胞凋亡检测试剂盒(购自杭州碧云天生物技术研究所)按照说明书方法染各组细胞。(3)，染色后细胞用流式细胞仪(购自BD FACS CALIBUR)检测。本发明公开了自由脂肪酸受体2在抗肿瘤药物中的应用。本发明显示了在细胞中过表达FFAR2，能够显著增加凋亡细胞的数量。肿瘤的过度生长及迁移严重威胁着患者的生命，诱导肿瘤细胞凋亡是肿瘤治疗领域的一个重要方向。FFAR2能够显著促进细胞凋亡，具有一定的肿瘤治疗的潜在应用价值。
权利要求
1.自由脂肪酸受体2在抗肿瘤药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的自由脂肪酸受体2在抗肿瘤药物中的应用，其特征在于，自由脂肪酸受体2可以诱导细胞的凋亡。
3.根据权利要求2所述的自由脂肪酸受体2在抗肿瘤药物中的应用，其特征在于，给予小鼠免疫细胞株Raw264.7自由脂肪酸受体2的配体醋酸盐与丙酸盐，小鼠免疫细胞株Raw264.7的活细胞数量减少。
4.根据权利要求3所述的自由脂肪酸受体2在抗肿瘤药物中的应用，其特征在于，所述丙酮酸盐和醋酸盐分别为丙酮酸钠和醋酸钠。
5.根据权利要求2所述的自由脂肪酸受体2在抗肿瘤药物中的应用，其特征在于，在人胚肾细胞株HEK293T中过表达人的自由脂肪酸受体2，经过一定时间后，所述人胚肾细胞株HEK293T细胞系中活体细胞减少。
6.根据权利要求2所述的自由脂肪酸受体2在抗肿瘤药物中的应用，其特征在于，在所述过表达人的自由脂肪酸受体2的人胚肾细胞株HEK293T中，通过小分子核糖核酸介导的基因沉默技术减少人胚肾细胞株HEK293T细胞株中的人的自由脂肪酸受体2后，活体细胞数量增加。
7.根据权利要求2所述的自由脂肪酸受体2在抗肿瘤药物中的应用，其特征在于，在所述过表达人的自由脂肪酸受体2的人胚肾细胞株HEK293T中，细胞线粒体膜电位降低。
8.根据权利要求2所述的自由脂肪酸受体2在抗肿瘤药物中的应用，其特征在于，在所述过表达人的自由脂肪酸受 体2的人胚肾细胞株HEK293T中，凋亡细胞增加。
全文摘要
本发明公开了一个自由脂肪酸受体2(FFAR2)在抗肿瘤药物中的应用。通过给予自由脂肪酸受体2的配体醋酸钠与丙酸钠，发现该配体能够显著减少小鼠免疫细胞株Raw264.7的活细胞数量；通过在人胚肾细胞株HEK293T中过表达FFAR2基因，发现该细胞系中活细胞的数量显著减少；进一步通过小分子核糖核酸介导的基因沉默技术(siRNA技术)，减少HEK293T细胞株中的FFAR2后，细胞株中活细胞数量显著增加；进一步通过线粒体膜电位检测试剂盒检测发现，在过表达了FFAR2的HEK293T细胞中，线粒体膜电位显著降低，提示该基因能够诱导细胞凋亡；通过细胞凋亡检测试剂盒(AnnexinV-PI)染色并通过流式细胞仪检测后，结果提示在过表达了FFAR2的HEK293T细胞中凋亡细胞显著增加。本发明公开自由脂肪酸受体2在抗肿瘤药物中的应用，其在临床上对血液系统及其它种类的肿瘤具有潜在的治疗作用。
文档编号A61K31/19GK103212061SQ20121001825
公开日2013年7月24日 申请日期2012年1月20日 优先权日2012年1月20日
发明者宁光, 石国军, 顾卫琼, 杨明兰, 章晓芳 申请人:上海交通大学医学院附属瑞金医院