专利名称：用于预防和/或治疗呼吸道合胞病毒感染的疫苗的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种用于预防和/或治疗呼吸道合胞病毒感染所致疾病的共免疫疫苗，特别涉及一种由DNA疫苗和亚单位疫苗共同组成的用于预防和/或治疗呼吸道合胞病毒感染所致疾病的共免疫疫苗。
背景技术：
呼吸道合胞病毒(RSV)属于副粘病毒科肺病毒属成员，为非节段性单股负链RNA病毒，分为A和B两个亚型。RSV病毒大小约120-300纳米，有包膜，由15222个核苷酸组成，编码10种主要蛋白，分别由三个跨膜蛋白(G、F和SH)、两个基质蛋白(M和M 2)、三个核衣壳蛋白(N、P和L)及两个非结构蛋白(NSl和NS2)构成。RSV是全世界范围内引起婴幼儿、免疫缺陷病人和老年人呼吸道感染、毛细支气管肺炎等急性下呼吸道感染的重要病原。美国1979 1997年的统计，每年因RSV感染导致下呼吸道疾病而住院和死亡的婴儿数分别为12.5万和450人，其中死亡率为2%。在我国，不但有RSV散发性感染，还发生过数次大规模爆性流行，2000 2002年间北京1402份婴幼儿患者中，有66.1 %的病毒性呼吸道感染是由该病毒引起的。1985 1992年期间先后在我国广州、山西、北京、以及河北和天津等地形成了 4次大流行。我国RSV流行主要以A亚型为主，但有的年份B亚型也可为主要优势株。因此，研制安全、有效的呼吸道合胞病毒疫苗是生命科学重大而急迫的问题。2001年世界卫生组织(WHO)已将开发安全有效的呼吸道合胞病毒疫苗列为21世纪需要优先解决的问题之一。
RSV疫苗的研制已有40多年的历史，但是至今仍然没有有效的、被批准使用的疫苗。目前研究的RSV疫苗主要包括灭活疫苗、减毒疫苗、亚单位疫苗和核酸疫苗几大类。20世纪60年代研制的福尔马林灭活疫苗(F1-RSV)，不仅不能预防RSV感染，反而再感染后使病情加重，甚至有的引起死亡，死者的肺组织内有T细胞浸润。通过对小鼠的研究已经确认F1-RSV诱生的T细胞亚群Th2-类细胞因子是加重病情的原因。随着F1-RSV疫苗研制的失败，人们开始通过人工诱变的方法构建减毒的RSV疫苗。从20世纪70年代至今，人工诱变RSV减毒株仍然没有应用于预防RSV的感染。人工诱变获得的减毒株存在较多的缺陷，并以遗传不稳定性为其主要缺点。亚单位疫苗和重组DNA疫苗是近年RSV疫苗研究的热点，主要以病毒表面糖蛋白F和G作为靶抗原。亚单位疫苗是将病毒抗原基因在大肠杆菌或酵母表达系统中进行蛋白质表达，提纯纯化后制成的。亚单位疫苗能够诱导较高水平的中和性抗体和保护抗体，降低RSV的感染率，但是由病毒引起的下呼吸道疾病的发病率没有明显的降低，这主要是由大量Th2型辅助性T细胞浸润肺部造成的。DNA疫苗又称核酸疫苗，它是将含有编码特定抗原蛋白质的基因序列克隆到合适的质粒载体上，制备成核酸表达载体，通过肌肉注射等方法将其导入机体内，通过宿主细胞的转录系统合成抗原蛋白，从而激发机体免疫系统产生针对外源蛋白质的特异性免疫应答反应。虽然DNA疫苗可以同时激发机体产生基于免疫球蛋白介导的的体液免疫反应和基于杀伤性T淋巴细胞介导的细胞免疫。但是其诱导的抗体水平，特别是中和抗体水平较低。虽然有研究报道，使用免疫增效剂可以在一定水平上提高DNA疫苗所激发的体液免疫反应，但是提升幅度有限。因此，对于RSV疫苗的开发工作，特别是开发一种既能诱导较高水平抗体，又能降低疫苗免疫后肺部T淋巴细胞大量浸润的新型疫苗制剂已经成为了迫在眉睫的研究重点。
发明内容
本发明的目的是提供一种预防和/或治疗呼吸道合胞病毒感染所致疾病的共免疫疫苗。所述共免疫疫苗是由两种或两种以上疫苗混合而制成的疫苗。本发明所提供的预防和/或治疗呼吸道合胞病毒感染所致疾病的共免疫疫苗由DNA疫苗和亚单位疫苗组成；所述DNA疫苗为表达序列表中序列2所示蛋白质的编码基因的重组表达载体；所述亚单位疫苗为序列表中序列2所示蛋白质。在实际应用中，所述DNA疫苗和所述亚单位疫苗的使用质量配比为如下a)或b)或c):a) (I: 5)-(5: I)；b) (I: 2)-(2: I)；c) I: I 或 1: 2 或 2: I。所述重组表达载体中启动所述序列表中序列2所示蛋白质的编码基因转录的启动子是T7启动子，其核酸序列为5’ -TAATACGACTCACTATAGG-3’。在本发明的一个 实施例中，所述重组表达载体具体为在proVAX质粒的多克隆位点插入序列表中序列2所示蛋白质的编码基因所得到的重组质粒；所述多克隆位点具体为EcoR I 和 Xba I。在本发明的实施例中，在所述DNA疫苗中，序列表中序列2所示蛋白质的编码基因的编码序列具体如序列表中序列I的第7-708位所示，所述DNA疫苗命名为proVAX/G ;在所述亚单位疫苗中，序列表中序列2所示蛋白质由编码序列为序列表中序列3的第7-708位所示基因经原核表达得到，所述亚单位疫苗命名为His-G。在本发明的一个实施例中，进行所述原核表达的菌株具体为大肠杆菌BL21 (DE3)。其中，序列表中序列2由233个氨基酸组成。由序列2所示氨基酸序列组成的蛋白质在真核细胞中的编码基因如序列表中序列I的第7-708位所示(对应所述DNA疫苗)，序列I的第7-708位即为序列2所示蛋白质的编码序列。由序列2所示氨基酸序列组成的蛋白质在原核细胞(如大肠杆菌)中的编码基因如序列表中序列3第7-708位所示(对应所述亚单位疫苗)，序列3的第7-708位即为序列2所示蛋白质的编码序列。上述预防和/或治疗合胞病毒感染所致疾病的共免疫疫苗在制备预防和/或治疗呼吸道合胞病毒感染所致疾病产品中的应用也属于本发明的保护范围。上述预防和/或治疗合胞病毒感染所致疾病的共免疫疫苗在制备具有如下1)-8)中任一所述功能的产品中的应用也属于本发明的保护范围:I)提高哺乳动物的呼吸道合胞病毒特异性IgG抗体水平；2)提高哺乳动物的呼吸道合胞病毒特异性中和抗体水平；3)抑制哺乳动物的呼吸道合胞病毒表面糖蛋白G特异性T淋巴细胞增殖；4)诱导哺乳动物的呼吸道合胞病毒表面糖蛋白G特异性调节性T细胞的产生；所述调节性T细胞的表型为⑶4+⑶25-Foxp3+IL-10+ ；
5)降低哺乳动物的呼吸道合胞病毒的病毒载量；6)抑制哺乳动物的炎症细胞的增殖；7)降低呼吸道合胞病毒感染哺乳动物所产生的呼吸阻力；8)降低呼吸道合胞病毒对哺乳动物肺部组织的损伤。所述炎症细胞为如下细胞中的至少一种:嗜酸性粒细胞、单核细胞、淋巴细胞。所述哺乳动物可为小鼠，在本发明的实施例中，所述小鼠具体为BALB/c小鼠。实验证明，用本发明所提供的预防和/或治疗合胞病毒感染所致疾病的共免疫疫苗按照如下方法免疫小鼠:第0、15和30天，每只小鼠分别前后三次肌肉注射proVAX/G与His-G的混合物(共100 μ I)。结果显示，本发明所提供的预防和/或治疗合胞病毒感染所致疾病的共免疫疫苗(proVAX/G和His-G)能够提高呼吸道合胞病毒表面糖蛋白G特异性IgG抗体水平；提高呼吸道合胞病毒特异性中和抗体水平；抑制呼吸道合胞病毒表面糖蛋白G特异性T淋巴细胞增殖；诱导呼吸道合胞病毒表面糖蛋白G特异性调节性T细胞(CD4+CD25Toxp3+IL-10+)的产生；降低呼吸道合胞病毒的病毒载量；抑制炎症细胞(嗜酸性粒细胞、单核细胞和淋巴细胞)的增殖；预防呼吸道合胞病毒感染产生呼吸阻力；预防呼吸道合胞病毒感染破坏肺部组织。·本发明与现有技术相比，其优点在于:1、本发明将联合免疫技术应用于呼吸道合胞病毒疫苗的开发研究中。实验证明，本发明所提供的预防和/或治疗呼吸道合胞病毒感染所致疾病的共免疫疫苗不但能增强免疫动物后的体液免疫反应，同时还能抑制过强的细胞免疫反应，有效和特异性的抑制炎症相关反应。2、本发明将呼吸道合胞病毒表面糖蛋白G的基因进行了修饰，经过全基因密码子优化，在大肠杆菌原核表达系统中成功高效表达，并且通过亲和层析的方法，方便、大量的获得了 G蛋白抗原。为新型RSV疫苗的研究开发指出了新的方向。3、本发明的新型疫苗，技术成熟，成本低，无副作用，易于推广。
图1为proVAX/G转入BHK细胞后反转录PCR检测结果。其中，泳道I代表转染proVAX/G的BHK细胞，泳道2代表转染proVAX空载体的BHK细胞，泳道3代表未转染质粒的BHK细胞。图2为SDS-PAGE电泳检测重组蛋白(G蛋白)在大肠杆菌中的表达及纯化结果。其中，A中泳道M为蛋白marker ;泳道I是无诱导下E.coli BL21(DE3)裂解液；泳道2是在IPTG 0.5mM 诱导下 E.coli BL21 (DE3)裂解液；泳道 3 是无诱导下 BL21 (DE3)/pET_28a(+)裂解液；泳道4是在IPTG 0.5mM诱导下BL21 (DE3)/pET_28a (+)裂解液；泳道5是无诱导下 BL21(DE3)/pET-28a(+)-G 裂解液；泳道 6 是在 IPTG 0.5mM 诱导下 E.coli BL21(DE3)/pET-28a(+)-G菌体裂解后的总蛋白(可溶性蛋白加包涵体蛋白)；泳道7是BL21 (DE3) /pET-28a(+)-G裂解液上清经过镍柱纯化后的蛋白。B中泳道M为蛋白marker ;泳道8是IPTG 0.5mM诱导下BL21(DE3)/pET-28a(+)-G裂解液上清(可溶性蛋白);泳道9是IPTG
0.5mM诱导下BL21 (DE3)/pET_28a (+)-G裂解液的沉淀物(包涵体蛋白)。图3为Western Blot检测重组蛋白(G蛋白)的抗原性。其中，泳道I为可溶性蛋白；泳道2为包涵体蛋白；泳道3为纯化后的重组蛋白His-G。图4为ELLISA检测联合免疫后小鼠的IgG抗体水平检测。A中，以紫外灭活RSV作为ELISA包被抗原，I表示PBS对照组(组I) ；2表示F1-RSV组(组2) ；3表示DNA疫苗组(proVAX/G,组3) ;4表示亚单位疫苗组(His-G,组4) ;5表示亚单位疫苗加真核表达载体对照组(proVAX+His-G，组5) ；6表示DNA疫苗加无关蛋白组(proVAX/G+OVA，组6) ；7表示DNA疫苗组加亚单位疫苗1:1共免疫组(proVAX/G+His-G，组7)。B中，以原核表达产物His-G作为ELISA检测抗原，I表示PBS对照组(组I) ；7表示DNA疫苗组加亚单位疫苗I: I共免疫组(proVAX/G+His-G，组7) 8表示DNA疫苗组加亚单位疫苗2: I共免疫组(组8), 9表示DNA疫苗组加亚单位疫苗1: 2共免疫组(组9)。图5为联合免疫抑制抗原特异性细胞免疫反应的T淋巴细胞扩增的检测结果。其中，I表示阳性对照组(naiVe小鼠细胞，PMA+1n刺激)；2表示阴性对照组(naiVe小鼠细胞，BSA刺激);3表示PBS对照组(组I) ；4表示DNA疫苗组(proVAX/G，组3) ；5表示亚单位疫苗组(His-G，组4) ;6表示亚单位疫苗加真核表达载体对照组(proVAX+His-G，组5) ；7表示DNA疫苗加无关蛋白组(proVAX/G+OVA，组6) ；8表示DNA疫苗组加亚单位疫苗1:1共免疫组(proVAX/G+His-G，组7) ;9表示DNA疫苗组加亚单位疫苗2: I共免疫组(组8)；10表示DNA疫苗组加亚单位疫苗1: 2共免疫组(组9)。图6为流式细胞仪检测联合免疫后抗原特异性调节性T细胞iTreg(⑶4+CD25_Foxp3+IL-10+)的产生情况。其中，A为流式细胞检测结果，Al为PBS对照组(组I) ；A2 为DNA疫苗组(proVAX/G，组3) ；A3为亚单位疫苗组(His_G，组4) ；A4为亚单位疫苗加真核表达载体对照组(proVAX+His-G，组5) ;A5为DNA疫苗加无关蛋白组(proVAX/G+OVA,组6) ；A6为DNA疫苗组加亚单位疫苗1:1共免疫组(proVAX/G+His-G，组7) ；A1-A6中右上角的数值表示Foxp3+和IL-10+占CD4+CD25_iTreg细胞的百分含量。B为⑶47⑶25_的T细胞中FoXp3+IL-10+表型的百分含量的柱状图，具体的，I表示PBS对照组(组I) ;2表示DNA疫苗组(pix)VAX/G，组3) ;3表示亚单位疫苗组(His_G，组4) ；4表示亚单位疫苗加真核表达载体对照组(proVAX+His-G,组5) ;5表示DNA疫苗加无关蛋白组(proVAX/G+0VA，组6) ;6表示DNA疫苗组加亚单位疫苗1:1共免疫组(proVAX/G+His-G，组7)。图7为RSV病毒攻击免疫后小鼠,小鼠肺部冲洗液炎症相关细胞的数量分析。其中，A为嗜酸性粒细胞；B为单核细胞；C为淋巴细胞；D为总细胞。A-D中I均表示没有攻毒的naiVe小鼠；2均表示PBS对照组(组I) ；3均表示F1-RSV组(组2) ；4均表示DNA疫苗组(proVAX/G,组3) ;5均表示亚单位疫苗组(His-G,组4) ;6均表示亚单位疫苗加真核表达载体对照组(proVAX+His-G，组5) ;7均表示DNA疫苗加无关蛋白OVA对照组(proVAX/G+0VA,组6) ；8均表示DNA疫苗加亚单位疫苗1:1共免疫组(proVAX/G+His-G，组7)。图8为RSV病毒攻击免疫后小鼠,小鼠肺功能检测。图9为RSV病毒攻击免疫后小鼠，小鼠的肺部组织切片图。其中，A为小鼠肺部组织切片图为病理打分(总分)情况。A和B中的I均表示没有攻毒的naiVe小鼠；2均表示PBS对照组(组I) ；3均表示F1-RSV组(组2) ；4均表示DNA疫苗组(proVAX/G，组3) ;5均表示亚单位疫苗组(His-G，组4) ;6均表示亚单位疫苗加真核表达载体对照组(proVAX+His-G，组5) ；7均表示DNA疫苗加无关蛋白OVA对照组(proVAX/G+0VA，组6) ；8均表示DNA疫苗加亚单位疫苗1:1共免疫组(proVAX/G+His-G，组7)。
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1、DNA疫苗的制备呼吸道合胞病毒表面糖蛋白G(简称G蛋白)经过真核细胞密码子优化后，通过全基因合成的方法获得。将含有呼吸道合胞病毒表面糖蛋白G编码基因的DNA片段(如序列表中序列I所示，其中第7-708位为G蛋白的编码序列，编码序列表中序列2所示蛋白)用限制性内切酶EcoR I和Xba I酶切，连接到经相同酶切的真核表达载体proVAX(Xiaogang Du, Guoxing Zheng, Huali Jin, Youmin Kang, Junpeng Wang, ChongXiao, Shuo Zhang, Mingyu Liu, Lin Zhao, Aoshuang Chen and Bin Wang.The adjuvanteffects of co-stimulatory molecules on cellular and memory responses to HBsAgDNA vaccination.J.Gene Medicine, 2007 ；9: 136-146.)上，形成重组质粒。将所得重组质粒用限制性内切酶EcoR I和Xba I酶切后，经琼脂糖凝胶电泳得到大小约为708bp目的片段，和大小约为3600bp的载体片段，与预期结果相一致。通过测序进一步证实所得到的重组质粒已经成功插入呼吸道合胞病毒表面糖蛋白G的编码基因，将其命名为proVAX/G。pix)VAX/G中，由T7启动子驱动呼吸道合胞病毒表面糖蛋白G编码基因的转录。质粒纯化使用德国Qiagen公司去内毒素质粒大量提取试剂盒(EndoFree Plasmid Giga kit)按其说明书进行提取，获得所述重组质粒proVAX/G即为DNA疫苗。使用invitrogen公司的Lipofectamine 2000试剂将上述制备所得的proVAX/G转染到真核细胞BHK细胞(ATCC)中:BHK细胞消化后计数，稀释至IO7个细胞/mL，加入I块24孔板细胞培养板中，2mL/孔。37 °C，5 % CO2培养24小时。待细胞长至汇合度约70% -80%时，将细胞用无血清培养基洗三次，加入无血清的新鲜RPM1-1640培养基待转染。用RPM1-1640培养基溶解质粒，调节其浓度为I μ g/ μ 1，与Lipofectamine 2000混合充分，转染具体操作见LipofectamineTM2000说明书。未转染质粒的BHK细胞为空白对照组。培养24-48h后，将细胞用胰蛋白酶消化后，收集到EP管中，2000rpm离心lOmin，弃上清，提取细胞总RNA，反转录成cDNA，通过PCR扩增，验证了目的基因表达，PCR扩增所用引物为5，-CCGGAATTCATGCATAAGGTGACTCCTA-3’ 和 5’ -GCTCTAGATTACTGCCGTGGGGTGTTT-3’。结果如图1所示，转染了 proVAX/G的BHK细胞中检测到大小约为700bp的目的条带(G蛋白的编码序列);而转染了 proVAX空载体的BHK细胞以及未转染质粒的BHK细胞均未检测到目的条带。以上技术的详细描叙可在Sambrook等人的"Molecular Cloning "(第二版1998, Cold Spring Harbor Laboratory Press,纽约)和厉朝龙等编，《生物化学与分子生物学实验技术》浙江大学出版社查寻。实施例2、亚单位疫苗的制备呼吸道合胞病毒表面糖蛋白G经过大肠杆菌细胞密码子优化后，通过全基因合成的方法获得。将含有呼吸道合胞病毒表面糖蛋白G编码基因的DNA片段(如序列表中序列3所示，其中第7-7 08位为G蛋白的编码序列，编码序列表中序列2所示蛋白)用限制性内切酶EcoR I和Xho I酶切，连接到经相同酶切的原核表达载体pET-28a(+)上，形成重组质粒。将所得重组质粒用限制性内切酶EcoR I和Xho I酶切后，经琼脂糖凝胶电泳得到大小约为708bp目的片段，和大小约为5400bp的载体片段，与预期结果相一致。通过测序进一步证实所得到的重组质粒已经成功插入呼吸道合胞病毒表面糖蛋白G的编码基因，将其命名为 pET-28a (+) -G0用pET-28a(+)_G转化大肠杆菌原核表达菌株BL21(DE3)，转化后的菌株命名为BL21(DE3)/pET-28a(+)-G(同时设置转化pET_28a(+)空载体的BL21 (DE3)对照，转化后的菌株命名为BL21(DE3)/pET-28a(+))。使用异丙基巯基半乳糖苷(IPTG)诱导目的蛋白(呼吸道合胞病毒表面糖蛋白G)表达，诱导的具体条件为:挑取过夜生长的单菌落，接种于LB培养基中，37°C震荡培养至对数生长期(0D_ = 0.5)，加入终浓度为0.5mmol/L的IPTG，于37°C诱导4小时。 将在上述条件下诱导所得的菌体(BL21 (DE3) /pET_28a (+) -G和BL21 (DE3) /pET-28a(+))裂解后，进行SDS-PAGE电泳检测(同时设置未诱导的对照)，具体操作如下:使用PBS (磷酸盐缓冲液)冲洗菌体3次，IOOOOrpm离心5分钟回收菌体沉淀，使用小体积PBS重悬菌体，超声裂解，取出少量裂解物SDS-PAGE检测上样备用，其余裂解物13000rpm离心10分钟，将上清吸入另一个管中(可溶性蛋白)，沉淀物中加入等体积的PBS(包涵体蛋白)，重悬。取等量上清和沉淀SDS-PAGE检测。结果如图2中A和B所示，转化了重组质粒pET-28a(+) -G的大肠杆菌BL21 (DE3)在37°C、0.5mM IPTG诱导4h可以得到大量原核表达的呼吸道合胞病毒表面糖蛋白G (约35kDa)。用Western Blot方法鉴定上述原核表达产物的抗原性是否与天然蛋白一致。具体方法为:将上述样品经SDS-PAGE电泳分离后，转移到PVDF膜上，使用5%脱脂奶粉封闭过夜，一抗使用商业化山羊抗RSV多克隆抗体(美国Meridian公司)，二抗使用牛抗羊HRP (美国Santa Cruz公司)。检测结果如图3所示，上述原核表达产物，无论是上清中的可溶性蛋白(图3泳道I)，沉淀中的包涵体蛋白(图3泳道2)均可以与商业化山羊抗RSV多克隆抗体(美国Meridian公司)杂交产生反应,显示大小一致的目的条带(约35kDa),可见上述原核表达产物与天然蛋白具有一致的抗原性。将经过SDS-PAGE和Western Blot鉴定的原核表达产物(呼吸道合胞病毒表面糖蛋白G)进行亲和层析纯化，具体方法为:将超声后的上清过填充有His-tag亲和纯化树脂的层析柱，待目的蛋白与树脂结合后，加入200mmol/L的咪唑洗脱目的蛋白。SDS-PAGE鉴定结果(图2A中第7泳道)表明，经亲和层析纯化后，所述原核表达产物(呼吸道合胞病毒表面糖蛋白G)目的条带单一,有效的去除了杂蛋白；Western Blot鉴定结果(图3中第3泳道)显示经亲和层析纯化后，所述原核表达产物(呼吸道合胞病毒表面糖蛋白G)仍保留有与天然蛋白G相一致的抗原性。纯化后的原核表达产物(呼吸道合胞病毒表面糖蛋白G)即为亚单位疫苗，命名为His-G。实施例3、DNA疫苗和/或亚单位疫苗免疫模式动物后的抗体水平检测一、DNA疫苗和/或亚单位疫苗免疫模式动物的实验模式动物:6-8周龄雌性BALB/c小鼠，购自北京华阜康生物科技股份有限公司，为清洁级，分9组，每组5只。免疫用疫 苗及对照:PBS、作为灭活病毒疫苗的代表福尔马林灭活疫苗F1-RSV (IO7TCID5qRSV 病毒(美国 ATCC，catalog n0.VR-26 ,经甲醛 72 小时 37°C反应后，利用50000g高速离心I小时纯化制得)、DNA疫苗proVAX/G、亚单位疫苗His_G、DNA疫苗的空载体对照proVAX与亚单位疫苗His-G的等质量混合物、DNA疫苗proVAX/G与无关蛋白的卵白蛋白OVA (Sigma公司产品)的等质量混合物、发明技术组(共免疫)DNA疫苗proVAX/G与亚单位疫苗His-G的等质量混合物，及DNA疫苗与亚单位疫苗按照质量计配比为2: I和1: 2的混合物。实验分组及各组的免疫情况见表I。每种疫苗或对照溶解在PBS中，分别于第O天，15天和30天注射3针，每只小鼠每次肌肉注射100微升。表IDNA疫苗和/或亚单位疫苗免疫小鼠的实验分组及各组的免疫情况
权利要求
1.预防和/或治疗呼吸道合胞病毒感染所致疾病的共免疫疫苗，由DNA疫苗和亚单位疫苗组成；所述DNA疫苗为表达序列表中序列2所示蛋白质的编码基因的重组表达载体；所述亚单位疫苗为序列表中序列2所示蛋白质。
2.根据权利要求1所述的共免疫疫苗，其特征在于:所述DNA疫苗和所述亚单位疫苗的使用质量配比为如下a)或b)或c):a)(I: 5)-(5: I)；b)(I: 2)-(2: I)；c)l: I 或 1: 2 或 2: I。
3.根据权利要求1或2所述的共免疫疫苗，其特征在于:所述重组表达载体中启动所述序列表中序列2所示蛋白质的编码基因转录的启动子是T7启动子。
4.根据权利要求1-3中任一所述的共免疫疫苗，其特征在于:所述重组表达载体为在proVAX质粒的多克隆位点插入序列表中序列2所示蛋白质的编码基因所得到的重组质粒。
5.根据权利要求1-4中任一所述的共免疫疫苗，其特征在于:在所述DNA疫苗中，所述序列表中序列2所示蛋白质的编码基因的编码序列如序列表中序列I的第7-708位所示。
6.根据权利要求1所述的共免疫疫苗，其特征在于:在所述亚单位疫苗中，序列表中序列2所示蛋白质由编码序列为序列表中序列3的第7-708位所示基因经原核表达得到。
7.根据权利要求6所述的共免疫疫苗，其特征在于:所述原核表达为在大肠杆菌中表达。·
8.权利要求1-7中任一所述的共免疫疫苗在制备预防和/或治疗呼吸道合胞病毒感染所致疾病产品中的应用。
9.权利要求1-7中任一所述的共免疫疫苗在制备具有如下I)-8)中至少一种功能的产品中的应用: 1)提高呼吸道合胞病毒特异性IgG抗体水平； 2)提高呼吸道合胞病毒特异性中和抗体水平； 3)抑制呼吸道合胞病毒表面糖蛋白G特异性T淋巴细胞增殖； 4)诱导呼吸道合胞病毒表面糖蛋白G特异性调节性T细胞的产生；所述调节性T细胞的表型为 CD4+CD25_Foxp3+IL-10+ ； 5)降低呼吸道合胞病毒的病毒载量； 6)抑制炎症细胞的增殖； 7)降低呼吸道合胞病毒感染所产生的呼吸阻力； 8)降低呼吸道合胞病毒对患者肺部组织的损伤。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于:所述炎症细胞为如下细胞中的至少一种:嗜酸性粒细胞、单核细胞和淋巴细胞。
全文摘要
本发明公开了一种用于预防和/或治疗呼吸道合胞病毒感染所致疾病的共免疫疫苗。由DNA疫苗和亚单位疫苗组成；所述DNA疫苗为含有序列表中序列2所示蛋白质的编码基因的重组表达载体；所述亚单位疫苗为序列表中序列2所示蛋白质。实验证明，本发明所提供的共免疫疫苗能增强免疫动物后的体液免疫反应，还能抑制过强的细胞免疫反应，有效抑制炎症反应，很好的保护哺乳动物的肺部组织及功能不因RSV的感染而被破坏。
文档编号A61K39/155GK103239734SQ20121003032
公开日2013年8月14日 申请日期2012年2月10日 优先权日2012年2月10日
发明者王宾, 陈璇, 俞庆龄 申请人:北京艾棣维欣生物技术有限公司