专利名称：参与细胞周期调控的tRNA结合蛋白、编码基因及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种参与细胞周期调控的tRNA结合蛋白、编码基因及应用。
背景技术：
基因表达在转录和转录后水平上受到复杂而精密的调控。转录水平上涉及到的各种因子和机制在很大程度上已经得到了阐释，而对转录后水平上的调控则了解的很少。类似于通过对各种转录因子的研究阐述转录机制，对于转录后水平调控的研究则需要探讨各种RNA结合蛋白的作用。与转录因子的作用相仿，RNA结合蛋白主要涉及到从RNA转录到蛋白表达这一过程的调控，它可以通过多种机制来决定与之结合的RNA (包括mRNA或非编码的RNA)的命运，例如，RNA的剪切机制的改变，RNA稳定性的增加或者减少，翻译效率的改变以及RNA在细胞内的不同定位等。在所有的RNA中，非编码的RNA(noncoding RNA,ncRNA) 数目众多，其转录水平在不同的环境下变化很大，而且有许多证据表明这些变化往往与肿瘤的发生有关。RNA结合蛋白对转录后水平上的调控在生物体处于不利条件时进行的应激反应中起到重要作用，许多RNA结合蛋白通过调控非编码RNA帮助其识别它们的mRNA靶目标实现对转录的调控。在受到遗传毒性或其它环境压力时，酵母细胞的tRNA在细胞核内累积，导致细胞蛋白合成停止，细胞停滞在Gl期，影响到细胞周期。这些非编码的RNA如何参与调控基因表达正在引起越来越多研究者的注意。生物体内的非编码RNA主要来自RNA聚合酶III转录产物，对应的结合蛋白家族 La蛋白在调控这些蛋白的成熟、定位和转运中起到重要作用。tRNA作为一种重要的RNA聚合酶III转录产物，最近的研究显示其成熟和定位可能对细胞周期以及细胞对外界环境的适应起到调控作用。卤虫具有很强的环境适应能力，在不同的环境下采用不同的生殖方式。既可以在环境适宜的条件下通过卵胎生的途径直接产下无节幼体，也可以在环境恶化时通过卵生途径产下包被坚硬外壳的休眠卵，通过这独特的休眠胚胎来抵御恶劣环境。与以往用于研究细胞周期的模式生物相比，卤虫的休眠卵长时间停滞于细胞周期的Gl期，为细胞周期调控机制的研究提供了一个优质的实验素材。
发明内容
本发明目的是提供一种参与卤虫休眠卵形成及维持的一种新型的tRNA结合蛋白及其编码基因，该蛋白通过与tRNA结合使其定位于细胞核，从而参与细胞周期的调控。本发明采用的技术方案是一种参与细胞周期调控的tRNA结合蛋白(Afu蛋白)，其氨基酸序列如SEQ ID No. 1所示。该蛋白具有tRNA结合活性，定位于细胞核，参与调控tRNA转运并造成细胞周期停滞。本发明还涉及一种所述tRNA结合蛋白的编码基因。该cDNA全长142^p，相应编码蛋白质有4(Maa。
具体的，所述基因序列如SEQ ID No. 2所示。本发明还涉及所述的tRNA结合蛋白在制备调控肿瘤细胞细胞周期的药物中的应用。本发明的有益效果主要体现在提供了一种参与卤虫休眠卵形成及维持的一种新型的tRNA结合蛋白及其编码基因，对该蛋白通过控制tRNA的运输以调控多种肿瘤细胞细胞周期的功能进行了鉴定，发现该蛋白具有tRNA结合活性，定位于细胞核，参与调控tRNA 转运并造成细胞周期停滞，可用于制备调控肿瘤细胞细胞周期的药物，为肿瘤药物研究提供了新的方向。
图1为Afu基因及编码蛋白的电泳图；a为Afu基因编码区PCR产物，c为纯化的 GST融合的Afu蛋白，b为GST蛋白对照；图2为Afu基因的干涉对卤虫发育的影响；，a为使用不同量的Afu双链RNA干涉后检测的Afu mRNA的变化，b为干涉后Afu蛋白的表达量变化，c说明在800ng双链RNA 干涉后卤虫产生的休眠卵的休眠状态被打破；图3为Afu蛋白与tRNA的体外结合活性；a为使用GoldView染色检测，b为使用不同tRNA探针检测的结果；图4为GFP融合的Afu蛋白在不同的肿瘤细胞中的核定位；标尺，50 μ m ；图5为Afu蛋白与tRNA的体内结合活性；a为Afu蛋白与tRNA在不同发育时期的卤虫细胞中结合活性，b为GFP融合的蛋白与tRNA在HeLa细胞中的结合活性；图6为GFP融合的Afu蛋白在HeLa细胞中表达后，细胞中tRNA分布的变化；a为使用正常tRNA探针(可以同时检测含有intron以及不含intron的tRNA)，b为intron区探针；标尺，IOOym ；图7为使用BrdU检测GFP融合的Afu蛋白在不同的肿瘤细胞中表达后，细胞周期的变化；当细胞中能检测到BrdU信号时，说明细胞可以通过S期，反之说明细胞停滞在Gl/ S期；标尺，100 μ m。图8为使用流式细胞分析检测GFP融合的Afu蛋白在HeLa细胞中表达后，细胞周期的变化；a为处理的细胞中DNA含量的变化，b为HeLa细胞在转染后18h到Mh间Gl，S 和G2/M期细胞所占比例的变化；图9为Afu蛋白对HeLa细胞增殖的影响；图10为GFP融合的Afu蛋白在爪蟾和斑马鱼幼体细胞中的表达及其造成的细胞周期的停滞；箭头指示的为BrdU的检测信号，只在对照组细胞中出现；图11为卤虫不同发育时期以及GFP融合的Afu蛋白在HeLa细胞中表达Mh，36h 和4 后，细胞内细胞周期相关蛋白的表达及磷酸化水平的变化；图12为预测的Afu蛋白参与调控细胞周期的信号通路；图13为Afu蛋白对裸鼠皮下肿瘤的生长抑制及细胞周期调控。a，Afu蛋白抑制了 HeLa和HT1080两种肿瘤的生长。b，使用BrdU检测Afu蛋白在不同的肿瘤细胞中表达后，细胞周期的变化；当细胞中能检测到BrdU信号时，说明细胞可以通过S期，反之说明细胞停滞在G1/S期；标尺，50 μ m。c, Afu蛋白在肿瘤细胞中后，细胞内细胞周期相关蛋白的表达及磷酸化水平的变化。 具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此实施例1 :Afu基因及编码蛋白的获得1.获得Afu基因的材料、方法及结果1. 1.利用Trizol试剂提供的方法，提取卵生途径卤虫的总RNA，并以此为模板利用反转录酶合成第一链cDNA。1. 2.根据抑制性消减杂交得到的差异表达基因的EST序列数据库中获得一种在卤虫无节幼体发育过程中表达量下调的基因的部分序列设计一对特异性引物rbpFl =TAG TCT CCC TTC CAA ATACAAAiPrbpRl :TAC CTA AAC TGA GTG CGG ACA T01. 3.以第一链cDNA为模板，rbpFl和rbpRl为引物完成PCR反应。反应体系为 cDNA 模板 1 μ L，引物各 1 μ L, 10XPCR Buffer 2. 5 μ L，Mcgl2 1. 5 μ L，dNTPs 1 μ L, TaqE 0. 25 μ L，去离子水补足25 μ L。PCR程序为:95C变性5min,接着30个扩增循环(95C变性 30sec, 58C 退火 30sec, 72C 延伸 30sec)，最后 72C 延伸 lOmin。序列连接到pMD18-T载体，测序。1. 4.根据测序得到的序列，设计一对特异性引物rbpF2 =ACG AGG GACATA TAA AGG TAA T禾口 rbpR2 :CGG ACA TCC TCT TTT GTGACT Τ。采用1. 3中的PCR体系及程序扩增部分片段，并利用DIG High prime labeling试剂盒提供的方法标记成筛选探针。1. 5.利用ZAP-eDNA synthesis Kit试剂盒及其提供的方法，构建卵生途径卤虫的cDNA文库。1. 6.使用1. 4中的探针从1. 5构建的文库中筛选得到阳性信号并测序，得到完整的Afu基因序列5’ -GGCACGAGGGCAAATGCGAGTTTCCTTACAAGAAGAAAAAGAAATGGCAGAAAATATCCAACATGATGAACGCATACTTCGAAAAGTTAGGAAGCAAATTGAATTTTACTTAAGTGATGCAAACTTGTCTAAAGACCGGGTAACTTGCTGTACTTACTCTGAGGCCATCTCAAGTGGAGGTATTCCCGCAGATTTCTTCTTGAAATGCAATAGAGTAAAAGAACGCATTACAACAGTTGCTGAAATTGAAGAAGCGCT
GAAGACATCTAAATATTTGCAATTTGCAGATGGAAAAGTCTCCAGAAAATTTCCTTTTCAACCTCGAACAAACCAGGATAGATGCACCATTTATGTGGAAAATATTCCCACGTATGCAACGCAAGAGAAAGTTCGTAAATGGTTCCGACCTTACGGAAAGGTAGTTTATGTCTCCCTTCCTAAATCAAAAGTAGGGACAATTAAAGGATATGCTTTTGTTGAGTTCAATACAGAAGAAGAAGCAGAAATCTGCATGTTATCCTATCAAGAATCTGGGAGATATATTGAAAACCGTGACCCAGCGGAGCTGTTATCAGTTAAAACGTTTGAAGGATTTGAAGATGCTGAGGTTGAAACTGAAACAGCGGAACCTGAATATCAGCCCTTTGAG
AGCGCTGAAGAGGCCCATCCTCAGGAAGTCACAAAAGAGGATGTCACCACTCAGTTTAGGATTCTTAGTAGGAACGATTGGAAAAAGGAGAGAAACAAGTACCTGAATAACTGGAGGAAAGAAGGAAAGGCACGTAGGCAAGAAATTTGGAGGCAGCAGATGAAAATTAACCGAAGGAGGAAAATAGCCGAGGAGGAAAAAGCTTTACAGCCTAAAACGGAACTAAACTTCCAAAGCGGCTTGATTGTCAAGATTTCTTTGAAGGAAGAAATTCATGATCCAAAATCTATAAAGGAACAATTAAAAGCTATTGGCGGCATAAAATATGTTGAAGCCATGCAAGGTGCAGTGGAAGCAATTGTCCGTACAGAAAGCCCAGATGTGGCCAGCTCACTTATCAAAAATCCATTAGGAAAGGGTGAAGTCCTTACTGGTGCTGAGGAACTAGAATATTGGTTTAAAATACTTTCAGGCAAGGAAGCGAAGCTTTCGGCATCAAAAGAAGTCAATAAAGTAAAGGTGAAGAAGAAGAAGAAAAAGGCTCAGCATATTCGGTTTGATGATGATGAAAATACAAAATCGGAAATAGAAACAACAGACGTGATTTGATAAGCTGTTTTCCGAAAAGCGTAGTTTATTGACGTGCATTATTTTTTTATGTATTTTACTTTTTTACTTTTTACAATATTTATTTTTTACTTTCTTGTAAGATTACATTTATACGTCAATACATTACATGATTAATAGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA(SEQ ID No. 2)该基因全长为1425bp,由43_bp的5，非翻译区(5，-UTR)，167-bp的3，非翻译区 (3’-UTR)和1215bp的开放阅读框组成。其中开放阅读框可以编码404个氨基酸组成的蛋白质，推测的分子量为46. 81kDa，等电点为8. 6，其氨基酸序列为MAENIQHDERILRKVRKQIEFYLSDANLSKDRVTCCTYSEAISSGG
IPADFFLKCNRVKERITTVAEIEEALKTSKYLQFADGKVSRKFPFQPRTNQDRCTIYVENIPTYATQEKVRKWFRPYGKVVYVSLPKSKVGTIKGYAFVEFNTEEEAEICMLSYQESGRYIENRDPAELLSVKTFEGFEDAEVETETAEPEYQPFESAEEAHPQEVTKEDVTTQFRILSRNDWKKERNKYLNNWRKEGKARRQEIffRQQMKINRRRKIAEEEKALQPKTELNFQSGLIVKISLKEEIHDPKSIKEQLKAIGGIKYVEAMQGAVEAIVRTESPDVASSLIKNPLGKGEVLTGAEELEYWFKILSGKEAKLSASKEVNKVKVKKKKKKAQHIRFDDDENTKSEIETTDVI*(SEQ ID No. 1)2. Afu蛋白的表达与纯化2. 1.根据获得的Afu基因序列，设计一对含有酶切位点的引物rbpeF =CCG GGA TCC TAGCGA GAA ATA TAC CAA CTA 和 rbpeR :CCG CTC GAG TTA TCAATA CAC GTC TGT TGT TTC0以测序质粒为模板，rbpeF和rbpeR为引物进行PCR扩增。扩增产物经过BamHI和 XhoI双酶切后连接到含有GST标签的原核表达载体pGEX-4T-l中。重组质粒转化到含有 ileX和argU基因的质粒pSJS1240的E.coli BL21(DE3)细胞中，测序鉴定。2. 2.利用终浓度为0. ImM的IPTG在25C下诱导含有重组质粒的DE3细胞，表达具有活性的GST融合的Afu蛋白。2. 3.表达产物利用谷胱甘肽kperose 4B纯化，其电泳结果见图1。实施例2 RNA干涉对Afu功能的验证1.根据获得的Afu基因序列，设计一对含有酶切位点的引物RNAif =CGT CTA GAA CCT CGA ACA AAC CAG GTA AGA 禾口 RNAir :GGA TAT CTA TTT TTA CGC CGC ATAACG TT。以测序质粒为模板，RNAif和RNAir为引物进行PCR扩增。扩增产物)(bal和EcoRI双酶切后连入pET-T7载体，构建出针对tRBP基因的dsRNA表达质粒。对照质粒为GFP基因序列。2.将构建的质粒转化到E. coli HT115菌株。在LB培养基(含100ug/ml Amp, 10ug/ml Ter)中培养至OD600为0. 4，加入IPTG使其终浓度为0. 4mM，37°C诱导4h。3.使用苯酚(pH4. 5)氯仿抽提纯化双链RNA，溶解到50ul DEPC处理水中，电泳检测，测定浓度，保存在-20°C。4.使用显微注射仪 UltraMicroPump II equipped with the Micro4TM MicroSyringe Pump Controller对出现卵囊前的卤虫个体进行显微注射。注射量为每只 800ng双链RNA或对照双链RNA。注射后的卤虫在8%人工海水、^°C、短光照周期(光照 4h，黑暗20h)下进行培养。观察其生长发育及产卵情况，结果见图2。结论由图2可见，800ng双链RNA干涉后卤虫产生的休眠卵中Afu mRNA的量只有对照组的15%，其蛋白表达量通过western blotting几乎检测不到。产出卵的休眠状态被打破，可以直接孵化成幼虫。结果表明Afu蛋白在维持卤虫休眠卵的休眠状态中起到关键作用。实施例3 =Afu蛋白与tRNA的体外结合活性研究(凝胶阻滞实验和免疫共沉淀实验)1.将GST融合的Afu蛋白与tRNA在如下体系中混合Yeast tRNAs20ug,GST-Afu/ GST对照体蛋白 0-10ug，20XRNA Binding Buffer (RBB) Iul, RiboLockTM RNase inhibitor 0. 5ul，使用DEPC处理水将体系调整至20ul。2.将结合体系轻柔混勻，室温结合30min后，上样到非变性的聚丙烯酰胺胶，80V 下电泳约池。3.电泳后的凝胶分别进行1. GoldView染色分析；2.转到尼龙膜使用tRNA特异性探针 tRNA Arg ACG (gR-ACG :TAT AGA AGT CAGACG CGT TCG CTA TAC CGC ACG CG)，tRNA Ile ATA(gI-TAT :TTA CGA CGG TCG CTT MC CAA CTG GCG CAA GAG AC), tRNA Leu CAA(gL-CM CTA AGA GTA TCG AAC TCT TCG TACTTA CGA TAC CT)，tRNA Lys TTT (gK-TTT :AAA CGC GAA CCGTCT ACC AAC TGA CGT AAC AAG GA)，tRNA Tyr GTA (gY-GTA :CAG TCT TCG CGC TTAAAC CMCTT GCG TAC CGAGA)，以及 tRNA Ser AGA (gS-AGA :TCG AGT CTC TCG CCT TAA CCA CTCGCG CTAAGT CG)进行 Northern blotting 分析，结果见图 3。结论由图3可见，与Afu蛋白共同孵育后，tRNA的电泳速度慢于自由的tRNA，表明Afu蛋白与tRNA在体外结合形成了复合物，Afu蛋白具有tRNA结合活性。实施例4 =Afu基因转染到肿瘤细胞及Afu蛋白的核定位1.根据获得的Afu基因序列，设计一对含有酶切位点的引物GFPz-rbpeF =CCG CTC GAG AAA TGG CAG AAA TAA TCC AACTA和 GFPz_rbpeR :CCG GGA TCC TTA TCA ATA CAC GTC TGTTGT TTC0以测序质粒为模板，GFPz-rbpeF和GFPz-rbpeR为引物进行PCR扩增。扩增产物使用》ιοΙ和BamHI双酶切后连入pEGFP-Cl载体，构建出可以在肿瘤细胞中表达GFP融合的Afu蛋白的质粒，测序鉴定。2.在肿瘤细胞汇合度达90%左右时，使用Lipfectamine 2000转染试剂进行细胞转染，对于每孔(6孔板)细胞，取4ug质粒DNA，IOulLipfectamine 2000转染试剂分别稀释于250ul无血清的培养基中，轻轻混勻；室温放置5min后混合，静置20min后加入到正常培养的细胞培养基中。将细胞置于37°C，5% CO2培养箱中培养18-4 后使用荧光显微镜进行观察，结果见图4。结论在肿瘤细胞中表达的Afu蛋白定位于细胞核内。实施例5 =Afu蛋白与tRNA的体内结合活性研究(免疫共沉淀实验)1.在保持蛋白质相互作用的条件下，使用不同的方法分别获取卤虫休眠卵和转染后的HeLa细胞的细胞裂解液。对卤虫休眠卵，首先使用50%的次氯酸钠脱壳，然后在含有 0. 1% Triton X-100和1 %脱氧胆酸钠的裂解液作用下研磨收集细胞裂解液；而对于HeLa 细胞则使用0. 5%的NP40进行裂解。裂解体系中均加入适量的蛋白酶抑制剂和RNA酶抑制剂。2.加入50 μ 1 proteinA sepharose在4°C下摇浊，对细胞裂解液进行预沉淀。3.在裂解液中加入15 μ g Anti-Afu兔源抗体，4°C摇过夜。4.力口入 200μ1 proteinA s印harose，4°C摇 4h 收集复合体。5.抽提RNA，转膜后使用tRNA探针检测，结果见图5。结论免疫共沉淀结果显示，Afu蛋白在活体细胞核中是以复合体的形式存在的， 这种复合体可能参与了 tRNA在细胞核质间运输的调控。实施例6 通过荧光原位杂交研究Afu蛋白对tRNA在细胞核质间转运的调控1.将灭过菌的盖玻片放入6孔板的培养孔中；2.将细胞按正常比例传代到盖玻片上，将细胞置于37°C，5% CO2培养箱中培养 24h至细胞汇合度达90%左右，进行转染；3.当融合蛋白表达后(约18_24h)，弃去培养基，用PBS漂洗1次；4.用4%的多聚甲醛室温固定lh，用预冷的PBS漂洗2次，每次15min;5.加入2ml预冷的丙酮，-20°C处理;3min ；随后用PBS漂洗2次，每次5min ；6.加入2ml预杂交液，39°C作用Ih ；7. 75°C处理lOmin，立即置于冰上；8.加入 DIG 标记的 tRNA 探针(tRNA Leu CAA(hL_CAA :TTG AGTCTG CGG CCT TAG ACC ACT CGG CCA TCC TGA C)，tRNA TyrGTA(hY-GTA :CTA CAG TCC TCC CGT CTA CCG CTG ACG TTACGA AGG), tRNA Gly CGC (hG-CGC :TCG TAT GCG CGG GAATCG MC CCG GG), tRNA Phe GAA QiF-GAA :CCG TCT CCCAAC TGA CGT TAT TCG CG)，tRNA Ser AGAQiS-AGA :CGC TTAACC ACT CGG CCA CGA CTA C),tRNA Lys CTT(hK-CTT :TCGTCT ACC GAC TGA CGT ACG CGG CG), 以及前体 tRNA LeuCAA (hL-CAA-pre :CAG ATA CCC CAC CCG GGA GGA ACG TTACGT TGA)，前体 tRNA Tyr GTA (hY-GTA-pre :AAG GTA GCG CACGGG CCG CGG CCT ACA G))，39°C 杂交过夜；9.分别用2XSSC漂洗3次，45°C，每次IOmin ；用IXSSC漂洗3次，室温，每次 IOmin ；用含有 Triton X-100 的 4XSSC 漂洗 1 次；10.加入含有 BSA 的 4XSSC 封闭 2h ；
11.加入含有罗丹明标记的anti-DIG抗体，避光(以下步骤都要避光)作用池；12.分别用4XSSC漂洗2次，室温，每次IOmin ；用含有Triton X-100的 4 X SSC漂洗2次，每次IOmin ；用4 X SSC漂洗1次后，加入IOOul DAPI作用15min染细胞核；13.用PBS漂洗一次，在载玻片上滴加抗荧光淬灭封片液，盖上附有细胞的盖玻片，指甲油封片后在荧光显微镜下观察，结果见图6。结论由荧光原位杂交结果可见，定位于细胞核的Afu蛋白与细胞核内的tRNA结合形成复合体后，将tRNA滞留于细胞核内，限制了 tRNA从细胞核向细胞质的转运，导致了细胞质中成熟tRNA的减少。实施例7 通过BrdU标记检测Afu蛋白对肿瘤细胞的细胞周期的调控1.将灭过菌的盖玻片放入6孔板的培养孔中，按正常比例将细胞传代到盖玻片上，置于37°C，5% C02培养箱中培养约24h至细胞汇合度达90%左右，进行转染；2.将转染后24h的HeLa细胞培养基换成含有12mM BrdU的DMEM培养基，37°C继续培养2 Ih ；3.细胞用4%多聚甲醛室温固定Ih ；4.室温下用PBS漂洗15min ；5.加入适量3%浓度的H202，37°C作用IOmin ；6.室温下用PBS漂洗3次，共15min，加入适量2N HC1，37°C作用30min ；7.室温下用PBS彻底漂洗干净，加入封闭液(1% BSA, 0.5% Tween 20，0. 叠氮化钠，5% FBS)，37°C作用 15min ；8.换成BrdU单克隆抗体，37°C继续作用2h，回收抗体；9.室温下用PBS漂洗3次，共15min，然后加入罗丹明标记的羊抗鼠荧光二抗， 37°C作用2h，回收二抗；10.室温下用PBS漂洗3次，共15min，加DAPI染细胞核，室温作用15min ；11.室温下用PBS漂洗，在载玻片上滴加抗荧光淬灭封片液，盖上附有细胞的盖玻片，指甲油封片后在荧光显微镜下观察，结果见图7。结论由图7可见，在表达有Afu蛋白的细胞中，几乎检测不到BrdU的信号，表明这些细胞没有能够通过细胞周期的DNA复制阶段，即细胞没有能够通过S期。结果显示，Afu 蛋白的表达使得肿瘤细胞的细胞分裂周期受到了调控，细胞停滞在G1/S期。实施例8 通过流式细胞分析检测Afu蛋白对细胞周期的调控1.取转染后1 和24h的HeLa细胞，用0.25%的胰酶室温处理消化下来之后，加血清终止反应。收集的细胞用PBS溶液清洗3-5次，轻轻吹打，镜检细胞并计数；2.所得单细胞悬液用70%乙醇4°C固定过夜；3.离心收集固定后的细胞，用PBS溶液清洗2次；4.加入 RNase A(100ug/ml) 37°C反应 30min ；5.加入 PI 染料(50ug/ml)4°C避光反应 30min ；6. Ih内上流式细胞仪检测，激发波长为488nm，使用Cell QuestTM software version 3. 1软件进行细胞周期分析。每个时期的样品重复制备三次，结果见图8。结论由图8可见，，处于G1/G0期的Afu-Hela和GFP细胞分别减少了 10. 34%(50. 83% -40. 49% )和 18. 73% (68. 20%-49. 47% )，说明 Afu 蛋白使得 Hela 细胞倾向于停滞在G1/G0期而不向S期转变。与之形成明显对比的是Afu-Hela细胞中G2/M期的细胞在转染后18h到24h之间几乎没有变化，并且维持一个极低的比例(2. 9% -3. 77% )，而对照细胞中G2/M期的细胞在起始比例几乎相同的情况下增长了 15. 71% (2. 92% -18. 63% )。 说明在表达Afu蛋白的肿瘤细胞中，细胞周期通过S期向G2/M期转变的过程受到了阻滞。实施例9 =Afu蛋白对HeLa细胞增殖的调控取转染后Mh的HeLa细胞，用0. 25%的胰酶室温处理消化下来之后，加血清终止反应。收集的细胞稀释后计数，取4000个细胞重悬于含有0.35% soft agar的DMEM培养基中，继续培养在底层含有0. 5% soft agar的35mm培养板上。4周后观察其形成细胞群落的情况，结果见图9。结论由图9可见，经过4周的生长之后，表达有Afu蛋白的肿瘤细胞几乎没有分裂形成细胞群落，而对照细胞的分裂正常。实施例10 通过BrdU标记检测Afu蛋白对爪蟾和斑马鱼胚胎细胞的细胞周期的调控1.将选取的爪蟾和斑马鱼的受精卵移到培养皿中，于一细胞期之前使用 UltraMicroPump II equipped with the Micro4 MicroSyringe Pump Controller显微注射仪注射外源DNA，浓度为0. 15 μ g/ μ L，DNA体积约2. 3nL。受精卵的动物极注射完毕后， 慢慢抽出注射针，将受精卵放入装有lXHalf’ s培养液的培养皿中，使其恢复发育。2.将经过显微注射后的幼体(爪蟾19期，斑马鱼14h)放置于含有3mM BrdU的培养液中培养2-3d(爪蟾40期，斑马鱼72h)。3.取出处理后的个体用4%多聚甲醛固定过夜4.用含0. 5% NP40的PBS溶液漂洗2次，每次IOmin ；5.依次使用25%，50%，75%，100%的乙醇(稀释在PBS中)脱水，每个梯度处理时间为15min，冰上操作；6.用5%的H202在4°C漂白l_2h，室温摇动；7.乙醇漂洗IOmin后依次使用25%，50%，75%，100%的PBS (稀释在乙醇中)脱水，每个梯度处理时间为15min，冰上操作；8.用 PBSST (PBS 中加入 5% sera,0. 1% Triton)漂洗，4°C Ih ；9.加入含有BrdU —抗的PBSST，4°C过夜，对照组不加一抗；10.用PBSST漂洗2次，每次15min，室温摇动；继续漂洗4次，每次15min，4°C摇动；11.加入含有二抗(AP-conjugtaed gota anti-mouse IgG)的 PBSST，4°C过夜；12.用PBSST漂洗2次，每次15min，室温摇动，然后在4°C继续漂洗4次；13.用TM缓冲液漂洗15min后加入NBT/BCIP显色，结果见图10。结论在对照个体尾端有丝分裂旺盛的区域可以检测到BrdU的掺入，而在表达 Afu蛋白的个体中则检测不到，说明这些细胞没有完成DNA复制而通过S期。这一结果证明，无论在肿瘤细胞还是正常细胞中，tRBP蛋白都能够造成细胞周期的紊乱。实施例11 通过Wfestern blotting分析Afu蛋白对细胞周期调控涉及的信号通路检测不同发育时期的卤虫个体(a)以及表达Afu蛋白24h，3 和4 后的HeLa细胞(b)中如下细胞周期相关蛋白的表达及磷酸化情况(图11)，寻找这一调控过程所涉及的信号通路:cyclinA, cyclin Dl, D2, D3, cyclinE2, CDK4, CDK6, chk2，4EBPl，E2F1, E2F2, E2F3, pl5, c-Jun and phosphor-specific antibodies against Rb(T356, S807/811and T780), Akt(T308), ERK1/2(T202/Y204)， F0X03a(T32, S318/321, and S253)， RSK(S221 and S380), MEK(T286, T292 and S298)，p38 (T180/Y182)，JNK(T183/Y185)，Fos(S32)， FOXOl (S256) and RNA POL II (S2)。关于Afu蛋白参与调控的信号通路简示如图12。结论Afu蛋白在细胞核内累积，调控tRNA的核质转运并由此调控肿瘤的细胞周期在 G1/S 期的停滞是通过 MAPK，PI3K-AKT and FKHR/FoxO to cyclin D/CDK6/Rb 等信号通路完成的。实施例12 =Afu蛋白对裸鼠皮下肿瘤的生长抑制及细胞周期调控1.使用Adenovirus Dual Expression Kit将Afu基因连接到Ad5病毒载体中，包装，纯化至109pfu ；2.收集HeLa及HT1080细胞，注射到BALB/c裸鼠皮下，成瘤后将肿瘤剪成小块扩大到各30只小鼠；3.选择荷有IOOmm3肿瘤的小鼠分成实验组和对照组，分别注射IOSpfu的含有Afu 基因的腺病毒及对照病毒，每周2次。测定肿瘤大小；4.最后一次注射病毒前，向小鼠腹腔注射BrdU(50mg/kg)，10小时后取样，多聚甲醛固定后石蜡包埋切片，检测BrdU的掺入；5.取未经BrdU处理的肿瘤进行信号通路蛋白的Wfestern blotting检测。结果见图13。结论Afu蛋白对两种肿瘤细胞的生长都有明显的抑制效果，通过BrdU检测表明， 表达有Afu蛋白的肿瘤细胞均无DNA复制，即停滞在G1/S期。Western blotting的检测表明，Afu蛋白对肿瘤的细胞周期调控及生长抑制是通过MAPK，PII-AKT and FKHR/FoxO to cyclin D/CDK6/Rb等信号通路完成的。
权利要求
1.一种参与细胞周期调控的tRNA结合蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID No. 1所示。
2.—种权利要求1所述tRNA结合蛋白的编码基因。
3.如权利要求2所述的编码基因，其特征在于所述基因序列如SEQID No. 2所示。
4.如权利要求1所述的tRNA结合蛋白在制备调控肿瘤细胞细胞周期的药物中的应用。
全文摘要
本发明提供了一种参与卤虫休眠卵形成及维持的一种新型的tRNA结合蛋白及其编码基因，该蛋白通过与tRNA结合使其定位并滞留于于细胞核，通过MAPK，PI3K-AKT and FKHR/FoxO to cyclin D/CDK6/Rb等信号通路参与细胞周期的调控，使细胞(正常细胞及肿瘤细胞)停滞于G1/S期。这一机制将为肿瘤药物研究提供新的方向。
文档编号A61P35/00GK102558331SQ20121003362
公开日2012年7月11日 申请日期2012年2月15日 优先权日2012年2月15日
发明者杨卫军, 陈佃福 申请人:浙江大学