专利名称：一种猪防御素pBD2多肽及其在抑制猪病原菌中应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种猪防御素PBD2多肽、编码其的基因及其在抑制猪病原圃中应用。
背景技术：
我国是养猪和猪肉生产大国，生猪饲养量、猪肉产量均位居世界第一，猪肉安全始终是关系到农村经济发展和社会安定的一个根本问题，具有“无猪不稳，猪粮安天下”的战略意义。目前抗生素滥用问题严重制约了我国养猪业的持续健康发展，甚至已经到了影响国计民生的地步。由于我国养殖业长期依赖抗生素，造成了疫情难解和疫苗失效。因此寻找和开发优质、安全、高效、廉价、无公害的抗生素替代品，已成为目前世界和我国关注的焦点和热点。防御素是生物界广泛存在的一类抗菌肽类物质，在哺乳动物体内主要由上皮细胞或免疫细胞产生，除了可以杀死多种细菌、分枝杆菌、真菌、病毒等病原微生物，还能够迅速动员免疫系统，激活固有免疫和获得性免疫反应抵抗动物体外各种生物逆境，是机体抵御外界微生物侵袭的第一道化学屏障(Boman, 1995 ；Ganz,2003 ；Yang et al. ,2007) 防御素的抑菌机理和其蛋白结构特点有关。防御素是富含半胱氨酸的阳离子多肽，可以与带阴离子的细菌细胞膜结合，结合后其分子中的疏水区可插入细胞膜，破坏细胞膜的完整性，使细胞的必需代谢物质外泄，导致病原菌不可逆性死亡。防御素具有抗病毒的作用则是通过与病毒外壳蛋白结合导致病毒失去生物活性(Matsuzaki，2001)。高等动物的细胞由于细胞膜中负电荷含量较低而不会受到防御素的破坏。防御素不直接作用于病原菌的功能蛋白，而是作用于病原菌的细胞膜发挥抑菌作用，因此不会使病原菌对其产生耐药性。而且与抗生素相比，防御素还具有抗病毒、激活机体免疫力的作用。由于具有以上优点， 防御素可以成为全新的抗病菌、提升免疫的饲料添加剂，未来将在动物养殖、疾病预防和提高畜产品品质等方面发挥巨大作用。目前，在脊椎动物、无脊椎动物和植物中发现的防御素已超过500多种。通过基因克隆和基因组同源序列分析，在猪体内已发现12种防御素，均以β-防御素的形式存在。这些防御素在猪体内的表达部位不同，分布于消化道、呼吸道、淋巴器官、肾、脾、睾丸、 附睾及骨髓等器官内以及中性粒细胞和肺泡巨噬细胞内，对猪先天免疫，特别是黏膜先天免疫，发挥着重要作用(Sang et al. , 2006) 研究发现pBDl不仅可以杀死Escherichia coli, Salmonella typhimurium, Listeria monocytogenes 和 Candida albicans 等猪致病菌(Shi et al.，1999)，而且可以激活新生仔猪的先天免疫功能，饲喂500 μ g防御素pBDl 可以使新生仔猪获得对百日咳鲍特菌的免疫能力，预防百日咳鲍特菌引起的支气管肺炎 (Shokrollah et al.，2006)。在肠道中，防御素可以通过增加其表达量直接杀死入侵的致病性细菌，比如猪致病性沙门氏菌Salmonella Typhimurium可以明显使猪空肠上皮细胞系的 pBDl 和 pBD2 的表达量增加(Edwin et al. ,2009), Salmonella Enteritidis 感染可以使猪肠道细胞系PBDl的表达量增加10倍(Edwin et al.，2006)。猪防御素还具有促进动物生长的作用，在日粮中添加PBDl的肉用仔鸡的生长性能、小肠吸收营养能力以及肠道黏膜免疫能力均有明显增强(Bao et al.，2008)。由于防御素在动物体内的天然含量很低，提取步骤繁琐，而化学合成法的生产成本昂贵，严重影响了防御素的研究和应用。基因工程法是获得大量、廉价防御素的最佳途径。防御素在大肠杆菌、酵母菌、昆虫、植物中的表达已有相关报道。彭力(2004)在大肠杆菌中表达了人β防御素2，优化了发酵条件和产物分离的方法。任海清(2009)在毕赤酵母 GS115中表达了猪防御素pBDl。JISHU SHI等人(1999)利用杆状病毒载体，成功的在草地夜蛾体内表达了猪防御素pBDl。王义琴等(2001)人以小球藻作为宿主，成功表达了兔防御素，为兔防御素的产业化奠定了基础，张秀海等(2000)在番茄中成功地表达了兔防御素 NP-1。虽然在以上所述几种生物系统中成功表达了防御素，但是防御素的异源表达量低依然是制约防御素产业化应用的瓶颈。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供一种猪防御素pBD2多肽、编码其的基因及其应用。首先，本发明提供一种猪防御素pBD2多肽，其为由SEQ ID No. 2所示的氨基酸组成的蛋白质。本发明提供的猪防御素pBD2多肽，去除了猪防御素pBD2中的信号肽和部分前导肽，选取了猪防御素PBD2的26 69位氨基酸序列。然而，应当理解，本领域技术人员可根据本发明公开的氨基酸序列，在不影响其活性的前提下，取代、缺失和/或增加一个或几个氨基酸，得到所述蛋白的突变序列。因此，本发明的猪防御素PBD2多肽还包括由SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列中经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等活性的由SEQ ID No. 2所不的蛋白质衍生的蛋白质。优选的，衍生蛋白的氨基酸序列与SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列的同源性可为 70%以上，优选80%以上，更优选90%以上。本发明还提供上述多肽的基因。优选的，本发明根据酵母菌密码子的偏好性，通过大量的改造和筛选，筛选出适合酵母菌表达的基因序列，如SEQ ID No. I所示。本发明还提供的含有猪防御素pBD2多肽基因的载体、细胞系及重组菌均属于本发明的保护范围。优选的重组菌为酵母菌。本发明还提供制备所述猪防御素pBD2多肽的方法，其为通过发酵所述的重组菌进行制备。在本发明的一个实施方案中，通过高密度发酵所述的重组酵母菌制备猪防御素 PBD2多肽，具体包括如下步骤I)将所述的重组菌的种子液以体积百分比4 6%的接种量接种至含有10g/L酵母膏、20g/L蛋白胨、5g/L葡萄糖和lg/L消泡剂的发酵培养基中进行菌体培养；2)当培养基中的溶解氧消耗完后并再度升至80%以上时，以体积百分比I 3% 的流加量每隔5 7小时流加100%甲醇，控制培养基中的溶解氧浓度大于20%，28°C搅拌诱导培养3-6天。本发明提供的猪防御素pBD2多肽或者本发明重组菌，尤其是酵母菌的发酵上清液能有效的抑制猪常见病原菌的活性，如金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、猪链球菌、沙门氏菌和/或副猪嗜血杆菌等。本发明改造了猪防御素pBD2的多肽序列，并利用酵母工程菌进行体外表达，可以大量、廉价获得有生物学活性的防御素，解决了天然防御素难于分离，化学合成法的生产成本昂贵的问题，有利于猪防御素的大规模生产。并且，发酵生产的猪防御素PBD2仍具有较高的生物活性，可抑制多种猪病原菌。
图I :猪防御素pBD2的cDNA片段的克隆(I. 8%琼脂糖凝胶)。I、Marker II ;2、 3猪防御素pBD2的cDNA片段。图2 :酵母重组载体pPIBD的构建过程。图3:酵母重组载体pPIBD的PCR鉴定电泳图谱(I. 8%琼脂糖凝胶)。1、2阳性克隆子；3、阴性对照；4、Marker II。图4 :青霉素效价标准曲线。图5 :酵母分泌表达的猪防御素pBD2对金黄色葡萄球菌的抑制作用。其中I为空白对照；2为10U/mL的青霉素溶液100 μ L ;3为15mg猪防御素pBD2多肽的毕赤酵母发酵液的冻干粉对金黄色葡萄球菌的抑制作用；4为25mg猪防御素pBD2多肽的毕赤酵母发酵液的冻干粉对金黄色葡萄球菌的抑制作用。图6 :酵母分泌表达的猪防御素pBD2的温度和pH的稳定性。其中，A为温度，B为 pH。
具体实施例方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例I猪防御素pBD2的cDNA序列的克隆。采集北京市顺义松林镇某猪场2周龄腹泻长白仔猪的新鲜回肠肠道组织lg，超纯水冲洗后，用天根公司生产的动物细胞RNA提取试剂盒提取回肠肠道组织的RNA，具体步骤见试剂盒的说明书。提取的RNA用TaKaRa公司生产的RNA反转录试剂盒反转录获得cDNA， 具体操作步骤见试剂盒说明书。根据NCBI上公布的猪防御素pBD2的cDNA序列(GenBank序列号AY506573)设计引物扩增 PBD2 的 cDNA 序列，引物序列为pBD2_F :5’ -ACCTGCTTACGGGTCTTG-3’ 和 pBD2_R 5，-CTCTGCT GTGGCTTCTGG-3，。扩增条件为94°C预变性 5 分钟；94°C热变性 30 秒，58°C 退火30秒，72°C延伸30秒，30个循环；72°C延伸3分钟。PCR体系为引物pBD2_F I μ L， pBD2-R I μ L，10 X dNTP 2 μ L，10 X ExTaq Buffer 2 μ L, ExTaq 酶 0· 5 μ L，加超纯水补充体系到20 μ L0 PCR电泳结果如图I所示。PCR产物测序(英骏公司)后，和NCBI上公布的猪防御素pBD2的cDNA序列的同源性是100%。克隆的cDNA序列如SEQ ID No. 3所示。实施例2猪防御素pBD2多肽序列的分析及基因序列的优化用DNAman软件翻译SEQ ID No. 3所示序列编码的多肽序列，如SEQ ID No. 4所示。 用生物信息学软件分析SEQ ID No.4所示的序列，发现序列中1-21位氨基酸残基可能是信号肽序列(SignalP 3. O)，21-33位推测是前导肽序列，34-69位推测是成熟肽序列。
选取猪防御素pBD2(SEQ ID No. 4)中的第26_69位序列(SEQ ID No. 2)，编码其的序列为SEQ ID No. 3所示序列的第76-210位核苷酸。使用软件分析这段序列的酵母密码子偏好性，根据密码子表，改造这段序列的核苷酸，使之成为适合酵母表达的基因，基因序列见SEQ ID No. I,由英骏公司合成。实施例3酵母重组猪防御素pBD2表达载体的构建酵母重组载体pPIBD的构建过程如图2所示。根据序列2，设计上游引物 pBD2-bc-F 5 ‘-TCTGAATTCACTGGTTTGGGTCAAAGATCCGA C-3，和下游引物 pBD2-bc-R-K 5 ‘ -ATCGGTACCTTATCTAATACAACACTTAGCCTTAC-3 ’，在上游引物5’端引入酶切位点EcoRI，在下游引物5 ‘端引入终止密码子TTA和酶切位点ΚρηΙ。 以实施例I中由英骏公司合成的猪防御素PBD2多肽基因为模板进行PCR扩增。PCR扩增条件为94°C预变性5分钟；94°C热变性30秒，60°C退火30秒，72°C延伸30秒，30个循环； 72°C延伸 3 分钟。PCR 体系为引物 pBD2-bc-F I μ L, pBD2-bc-R-Kl μ L, 10X dNTP 2 μ L, IOXExTaq Buffer 2 μ L，ExTaq酶O. 5 μ L，加超纯水补充体系到20 μ L。PCR产物用PCR纯化试剂盒(天根公司)纯化，纯化步骤详见试剂盒说明书。纯化产物送测序公司测序，测序结果用DNAman软件比对正确。用EcoRI和KpnI酶切PCR纯化的产物，酶切体系为PCR纯化产物20 μ L， IOXbuffer 25 μ L，EcoRI和KpnI各3 μ L，灭菌超纯水补充体系到250 μ L，酶切条件是 37°C温育3小时。毕赤酵母表达载体pPICZaA(Invitrogen公司)的酶切体系是PCR纯化产物 25 μ L, IOXbuffer 25 μ L, EcoRI和KpnI各3 μ L，灭菌超纯水补充体系到250 μ L，酶切条件是37°C温育3小时。猪防御素pBD2多肽基因的酶切产物和pPICZaA的酶切产物用PCR纯化回收试剂盒回收。回收后进行连接，连接体系是pPICZaA/EcoRI+KpnI 3 μ L，PCR酶切回收产物 3 μ L，10 X T4DNA连接buffer I μ L，T4-DNA连接酶I μ L，加灭菌超纯水补充体系到10 μ L， 4°C过夜连接。连接产物转化大肠杆菌热激感受态JM109 (天根公司)。大肠杆菌热激转化的方法为将100 μ L感受态细胞在冰上融化，加入IOyL连结产物，轻轻敲打混匀，冰上放置20分钟。42°C水浴热击90秒，取出置于冰上放置5分钟，加 Λ 900 μ L的LB培养基。37°C摇床150rpm震荡培养I小时后，取出200 μ L培养液涂布加 Λ 25 μ g/ μ L Zeocin抗生素的LB平板，37°C过夜培养。挑取单菌落做菌落PCR，PCR体系和条件如上所述。PCR产物经I. 8%琼脂糖凝胶电泳的结果见图3，PCR产物测序后，与预期片段的同源性达到100%。将构建的重组酵母猪防御素pBD2表达载体命名为pPIBD。实施例4猪防御素重组酵母菌的构建和阳性克隆子的筛选将pPIBD重组载体电击转化毕赤酵母GS115的感受态细胞，转化产物涂布含 100 μ g/μ L Zeocin抗生素的YPD平板，30°C培养48小时。挑取克隆子进行PCR验证。验证正确的克隆子是阳性克隆子。GSl 15电转感受态细胞的制备方法如下挑取毕赤酵母GS115 (Invitrogen)单菌落至5mL YPD培养基中，250rpm, 30 °C， 振荡培养过夜；1%的接种量接种振荡培养过夜的毕赤酵母X-33至IOOmL YPD培养基中， 30°C，250rpm,振荡培养至 0D600nm I. 3—1. 5。菌液转入 IOOmL 离心管,4000rpm, 4°C，离心5min,弃上清；用IOOmL冰预冷的无菌水重悬菌体，同上离心,弃上清；用50mL冰预冷的无菌水重悬菌体，同上离心，弃上清；4mL冰浴IM山梨醇重悬菌体，然后转移到5mL离心管中， 同上离心,弃上清；200 μ L IM山梨醇重悬菌体，4°C放置备用。电击转化方法为90 μ L制备的感受态细胞中加入10 μ L线性去磷酸化质粒pPIBD，混匀；转至冰预冷的电转杯中，冰上放置5min进行电转，参数设置为1500V，25uF，400Q。电转后立即加入 ImL冰预冷的IM山梨醇，混匀转入2mL离心管中，30°C复苏2小时；不含有pBD2基因的空载体pPICZaA同时电转化作为阴性对照。实施例5高产猪防御素转化子的诱导表达挑取pPIBD阳性转化子单克隆，接种至IOmL BMGY培养基中，28°C，250rpm摇至 0D600nm 4. O (对数生长期，大约16_18h);室温4000g离心5min，收集细胞，去除上清，用 50mLBMMY培养基重悬细胞至0D600nml. O ;在250mL摇瓶中加入上述培养物，加盖灭菌棉塞， 放入摇床继续生长；每24h，加100%甲醇至终浓度2%，诱导72小时后取ImL培养基至
I.5mL离心管，室温用水平离心机最大转速离心5min，收集上清至新的离心管中。共挑取了 5个克隆进行抑菌试验，以携带空载体pPICZaA的重组酵母为对照。抑菌实验的方法是在每个无菌平皿中等距放入4个牛津杯，配制MH培养基(琼脂含量I. 0% ) 15mL，湿热灭菌后恒温至60°C，加入5%金黄色葡萄球菌ATCC 6538菌液混匀，配制成带金黄色葡萄球菌的琼脂，震荡混匀后直接倒在无菌培养皿中，缓缓转动平板使培养基均匀铺开。待其凝固，用无菌镊子小心夹出牛津杯，4°C备用。每个孔中加入IOOyL 待测发酵上清，盖好皿盖，小心移至37°C培养箱，平皿正放静置培养。培养20小时后，打开皿盖，移去牛津杯，用卡尺测量抑菌圈直径。结果表明，5个克隆的上清液均能抑制金黄色葡萄球菌，不同克隆之间的抑菌圈直径也无显著差异。而空白载体对照的上清液没有出现抑菌圈。实施例6重组猪防御素酵母菌抑菌效价的测定挑取重组酵母菌，发酵培养后收集上清，-80°C冷冻10小时，用真空冻干机冷冻干燥24小时，收集冻干粉测定抑菌效价。抑菌实验方法同实施例5。绘制青霉素的标准曲线，绘制方法为配置浓度为O. lIU/mL、0. 25IU/mL、lIU/mL、 2IU/mL、5IU/mL、20IU/mL的青霉素标准溶液。每个平皿等距4个小孔，间隔的3个中加入 O. 5IU/mL的青霉素O. lmL，将每两个平皿组成一组，共6组，第一组的每个平皿的3个空牛津杯中加入O. lIU/mL的青霉素标准溶液O. lmL，第二组加入O. 25IU/mL的青霉素标准溶液
O.ImL,以此类推，把6个梯度的青霉素标准溶液加入平皿，37°C培养IOh，精确测量各抑菌圈的直径。以6组所有O. 5IU/mL青霉素抑菌圈直径的平均值为r’，各组O. 5IU/mL青霉素抑菌圈直径的平均值与r’的差即为校正值t，梯度各个浓度直径减去t再平方，即为曲线的横坐标X，绘制的标准曲线如图4所示。取2个平皿，每个平皿放4个牛津杯，一个作为空白对照，一个加入10U/mL的青霉素O. ImL,另外2个加入样品(分别含有15mg和25mg的猪防御素pBD2多肽的毕赤酵母发酵液上清的冻干粉)，37°C培养IOh后，精确测量每个抑菌圈直径，分别求出标准品溶液和样品溶液所致的4个抑菌圈直径的平均值，按照上述标准曲线的制备方法求得校正数后， 带入方程求出样品效价。15mg和25mg的猪防御素pBD2多肽的毕赤酵母发酵液上清的冻干粉的效价分别为4. 5U/mL和6U/mL，如图5所示。实施例7酵母分泌表达的猪防御素pBD2的抑菌谱和最小抑菌浓度采用比浊法鉴定猪防御素重组酵母菌菌发酵上清液冻干粉的抑菌谱和最小抑菌浓度，测试菌株是常见猪病原菌金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、猪链球菌、沙门氏菌和副猪嗜血杆菌。比浊法的试验方法为I、检测菌液的制备取各猪病原菌液体培养物，接种于M-H液体培养基中，37°C培养16-17h，并用M-H培养基调整其菌液浓度，使其在650nm处的吸收值为I. O左右；2、样品的准备准备36只试管，分为3组。分别装上4ml的M_H培养基。高压灭菌。 分别两次称取防御素的冻干样品32000μ g，溶解在SmlM-H液体培养基，混匀，过滤除菌后， 从第I管中取4ml的培养基到第2管中，混匀后再从第2管中取4ml加入到第3管中，如此连续稀释至第12管，保存第12管中4ml的M-H培养基(含有防御素)。含有M-H的试管中的防御素的浓度依次为:4000 μ g/ml、2000 μ g/ml、1000 μ g/ml、500 μ g/ml、250 μ g/ml、125 μ g/ ml、62. 5 μ g/ml>31. 25 μ g/ml、15. 625 μ g/ml、7. 813 μ g/ml、3. 906 μ g/ml>I. 953 μ g/ml。3、比池法吸光度测定向各试管中加入100 μ L各病原菌培养液,放入恒温摇床以转速200r/min，37°C震荡过夜培养。取过夜培养物200 μ L，加入2800 μ L M-H液体培养基中，分光光度计测定波长650nm处的吸光值。猪防御素重组菌发酵液冻干粉的抑菌谱和最小抑菌浓度如表I所示。表I酵母分泌表达的猪防御素pBD2对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、猪链球菌、沙门氏菌和副猪嗜血杆菌的抑菌效果和最小抑菌浓度
权利要求
1.一种猪防御素PBD2多肽，其为1)由SEQID No. 2所示的氨基酸组成的蛋白质；或2)在SEQID No. 2所示的氨基酸序列中经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等活性的由I)衍生的蛋白质。
2.编码权利要求I所述多肽的基因。
3.如权利要求2所述的基因，其特征在于，核苷酸序列如SEQID No. I所示。
4.含有权利要求2或3所述基因的载体。
5.含有权利要求4所述载体的重组菌。
6.如权利要求5所述的重组菌，其特征在于，其为酵母菌。
7.一种制备权利要求I所述多肽的方法，其为通过发酵权利要求5或6所述的重组菌进行制备。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，通过高密度发酵权利要求6所述的重组菌进行制备，具体包括如下步骤1)将所述的重组菌的种子液以体积百分比4 6%的接种量接种至含有10g/L酵母膏、20g/L蛋白胨、5g/L葡萄糖和lg/L消泡剂的发酵培养基中进行菌体培养；2)当培养基中的溶解氧消耗完后并再度升至80%以上时，以体积百分比I 3%的流加量每隔5 7小时流加100%甲醇，控制培养基中的溶解氧浓度大于20%，28°C搅拌诱导培养3-6天。
9.权利要求I所述多肽或根据权利要求7或8所述方法发酵得到的上清液在抑制猪病原菌中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述的猪病原菌选自金黄色葡萄球菌、 大肠杆菌、猪链球菌、沙门氏菌和/或副猪嗜血杆菌。
全文摘要
本发明公开了一种猪防御素pBD2多肽、编码其的基因及其应用。本发明提供的猪防御素pBD2多肽，其为1)由SEQ ID No.2所示的氨基酸组成的蛋白质；或2)在SEQ ID No.2所示的氨基酸序列中经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等活性的由1)衍生的蛋白质。本发明改造了猪防御素pBD2的多肽序列，并利用酵母工程菌进行体外表达，可以大量、廉价获得有生物学活性的防御素，解决了天然防御素难于分离，化学合成法的生产成本昂贵的问题，有利于猪防御素的大规模生产。并且，发酵生产的猪防御素pBD2仍具有较高的生物活性，可抑制多种猪病原菌。
文档编号A61K38/17GK102584977SQ201210037950
公开日2012年7月18日 申请日期2012年2月17日 优先权日2012年2月17日
发明者冯秋月, 刘鹏, 吴雅琨, 宋维平, 彭子欣, 王丹玉, 王安如, 王洪彬, 谢飞, 贠桂玲 申请人:北京大北农科技集团股份有限公司, 哈尔滨大北农牧业科技有限公司, 漳州大北农农牧科技有限公司