专利名称：一种含mf59佐剂禽流感病毒裂解疫苗的制备工艺的制作方法
技术领域：
本发明属于疫苗制备领域，尤其是一种含MF59佐剂禽流感病毒裂解疫苗的制备工艺。
背景技术：
禽流感是禽流行性感冒的简称，它是一种由甲型流感病毒的一种亚型(也称禽流感病毒)引起的传染性疾病，被国际兽疫局定为甲类传染病，又称真性鸡瘟或欧洲鸡瘟。是由禽流感病毒引起的一种急性传染病，也能感染人类，人感染后的症状主要表现为高热、咳嗽、流涕、肌痛等，多数伴有严重的肺炎，严重者心、肾等多种脏器衰竭导致死亡，病死率很闻。铝佐剂用于疫苗已有80多年，但近来有资料显示在疫苗制备中使用铝佐剂后出现免疫抑制和中毒现象，使用量过小吸附不完全，过大吸附完全但存在安全性。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，而提供一种含MF59佐剂禽流感病毒裂解疫苗的制备工艺，将R1203禽流感病毒株接种于鸡胚，经培养、收获病毒液、灭活病毒和纯化、裂解、再纯化等生产工艺制成。本发明采用MF59佐剂生产禽流感裂解疫苗，加入该佐剂比不加佐剂和加入氢氧化铝佐剂生产的疫苗更加安全和有效。本发明解决其技术问题采用的技术方案这种含MF59佐剂禽流感病毒裂解疫苗的制备工艺，该方法步骤如下(I)、病毒接种与培养于鸡胚尿囊腔接种经稀释的禽流感工作种子批毒种，置 33 35°C培养48 72小时；(2)、病毒收获筛选活鸡胚，置2 8°C—定时间冷胚后，收获尿囊液于容器内，澄清过滤后逐容器取样进行尿囊收获液检定；(3)、病毒灭活病毒灭活前取样测定蛋白含量，控制蛋白质含量在不超过5mg/ ml的范围内进行病毒灭活，收获的含有病毒的尿囊液加入终浓度为200 μ g/ml的甲醒,置 2_8°C灭活15 24小时，灭活结束分别对每个病毒灭活容器采样，进行病毒灭活验证试验和细菌内毒素含量测定；(4)病毒收获液浓缩灭活后的收获液经澄清处理，然后用截留分子量为1000KD 的超滤膜超滤浓缩不超过10倍；(5)、病毒纯化(5. I)蔗糖速率区带离心在静止时以不超过离心腔容积50%的量泵入50 60%的鹿糖溶液，同时调节机器转速至35000r/min 40000r/min,连续泵入病毒液,进样完毕，泵入缓冲液后，调节转速至Or/min，待机器停稳，在280nm波长监测下，收集病毒峰；(5. 2)柱层析用S印hix)Se-4FF凝胶柱色谱法纯化，上样量不超过凝胶体积的 8%，洗脱液为O. Olmol/L的PBS，pH7. 2，上样及洗脱线性流速为5 6mm/min，检测波长为280nm，收集第一峰，纯化后取样进行蛋白质含量测定；(6)、病毒裂解纯化后的病毒液加入终浓度为O. 3 O. 5% Triton X-100及去氧胆酸钠，混匀后置20 30°C下作用90 120分钟，然后梯度离心2小时，在280nm波长监测下收集第一峰；(7)、除糖除裂解剂将离心后的裂解物用无菌O. OlM pH7. 2PBS溶液进行超滤浓缩，以去除蔗糖并进一步去除裂解剂，最终浓缩至合适液量，取样检测细菌内毒素含量和微生物限度，控制细菌内毒素不高于50EU/ml，微生物限度检测要求不高于lOcfu/ml ；(8)、除菌过滤纯化后的裂解物经O. 22 μ m孔径的滤膜过滤即为单价原液，单价原液应置于2-8 °C保存。更进一步的，半成品配制根据所配制的半成品总量计算原液用量，使血凝素含量为30 μ g/ml，按50%的量加入MF59佐剂，再加入Buffer溶液，混匀后经O. 22 μ m孔径的滤膜过滤，即为半成品。本发明有益的效果是I.用MF59佐剂制备的疫苗免疫原性强，能产生更高的抗体应答；2.对接种常规疫苗后不能产生免疫应答或免疫应答较低的儿童和老年人能增强其免疫力；3.能对不同流感病毒亚型产生交叉免疫；4.在保持免疫力不变的前提下可以降低抗原含量，同时降低了能引起副反应的杂蛋白含量，因而疫苗的副反应更低低、安全性更好，不会出现毒力返强和变异的危险。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明作进一步说明本发明采用MF59佐剂制备禽流感裂解疫苗。MF59是目前全世界公认的最好佐剂， 是一种水包油的乳剂，包含I %鲨烯，O. 5% Tween80和O. 5%三油酸聚山梨脂的水包油乳液。它能激发已经衰退的免疫应答，加强机体对病毒的免疫应答，使机体产生更强大的免疫保护效力，MF59在国外已应用于流感疫苗中，证明能增强儿童和老年人的免疫效力，并能对不同流感病毒亚型产生交叉免疫。本发明所述的这种含MF59佐剂禽流感病毒裂解疫苗的制备工艺，该方法步骤如下(I)、病毒接种与培养于鸡胚尿囊腔接种经稀释的禽流感工作种子批毒种，置 33 35°C培养48 72小时；(2)、病毒收获筛选活鸡胚，置2 8°C—定时间冷胚后，收获尿囊液于容器内，澄清过滤后逐容器取样进行尿囊收获液检定；(3)、病毒灭活病毒灭活前取样测定蛋白含量，控制蛋白质含量在不超过5mg/ ml的范围内进行病毒灭活，收获的含有病毒的尿囊液加入终浓度为200 μ g/ml的甲醒,置 2_8°C灭活15 24小时，灭活结束分别对每个病毒灭活容器采样，进行病毒灭活验证试验和细菌内毒素含量测定；(4)病毒收获液浓缩灭活后的收获液经澄清处理，然后用截留分子量为1000KD 的超滤膜超滤浓缩不超过10倍；
(5)、病毒纯化(5.1)蔗糖速率区带离心在静止时以不超过离心腔容积50%的量泵入50 60%的鹿糖溶液，同时调节机器转速至35000r/min 40000r/min,连续泵入病毒液,进样完毕，泵入缓冲液后，调节转速至Or/min，待机器停稳，在280nm波长监测下，收集病毒峰；(5. 2)柱层析用S印hix)Se-4FF凝胶柱色谱法纯化，上样量不超过凝胶体积的 8%，洗脱液为O. Olmol/L的PBS，pH7. 2，上样及洗脱线性流速为5 6mm/min，检测波长为 280nm，收集第一峰，纯化后取样进行蛋白质含量测定；(6)、病毒裂解纯化后的病毒液加入终浓度为O. 3 O. 5% Triton X-100及去氧胆酸钠，混匀后置20 30°C下作用90 120分钟，然后梯度离心2小时，在280nm波长监测下收集第一峰；(7)、除糖除裂解剂将离心后的裂解物用无菌O. OlM pH7. 2PBS溶液进行超滤浓缩，以去除蔗糖并进一步去除裂解剂，最终浓缩至合适液量，取样检测细菌内毒素含量和微生物限度，控制细菌内毒素不高于50EU/ml，微生物限度检测要求不高于lOcfu/ml ；(8)、除菌过滤纯化后的裂解物经0. 22 μ m孔径的滤膜过滤即为单价原液，单价原液应置于2-8 °C保存。更进一步的，半成品配制根据所配制的半成品总量计算原液用量，使血凝素含量为30 μ g/ml，按50%的量加入MF59佐剂，再加入Buffer溶液，混匀后经0. 22 μ m孔径的滤膜过滤，即为半成品。各项检验项目经检测后，结果显示均符合国家药典标准。注本发明中提到的百分比浓度，除特别标注的，其他均为体积百分比浓度。除上述实施例外，本发明还可以有其他实施方式。凡采用等同替换或等效变换形成的技术方案，均落在本发明要求的保护范围。
权利要求
1.一种含MF59佐剂禽流感病毒裂解疫苗的制备工艺，其特征是该方法步骤如下(1)、病毒接种与培养于鸡胚尿囊腔接种经稀释的禽流感工作种子批毒种，置33 35°C培养48 72小时；(2)、病毒收获筛选活鸡胚，置2 8°C—定时间冷胚后，收获尿囊液于容器内，澄清过滤后逐容器取样进行尿囊收获液检定；(3)、病毒灭活病毒灭活前取样测定蛋白含量，控制蛋白质含量在不超过5mg/ml的范围内进行病毒灭活，收获的含有病毒的尿囊液加入终浓度为200 μ g/ml的甲醒,置2-8°C灭活15 24小时，灭活结束分别对每个病毒灭活容器采样，进行病毒灭活验证试验和细菌内毒素含量测定；(4)病毒收获液浓缩灭活后的收获液经澄清处理，然后用截留分子量为1000KD的超滤膜超滤浓缩不超过10倍；(5)、病毒纯化(5. I)蔗糖速率区带离心在静止时以不超过离心腔容积50%的量泵入50 60%的鹿糖溶液，同时调节机器转速至35000r/min 40000r/min,连续泵入病毒液,进样完毕,泵入缓冲液后，调节转速至Or/min，待机器停稳，在280nm波长监测下，收集病毒峰；(5. 2)柱层析用S印hix)Se-4FF凝胶柱色谱法纯化，上样量不超过凝胶体积的8%，洗脱液为O. Olmol/L的PBS，pH7. 2，上样及洗脱线性流速为5 6mm/min，检测波长为280nm， 收集第一峰，纯化后取样进行蛋白质含量测定；(6)、病毒裂解纯化后的病毒液加入终浓度为O.3 O. 5% Triton X-100及去氧胆酸钠，混匀后置20 30°C下作用90 120分钟，然后梯度离心2小时，在280nm波长监测下收集第一峰；(7)、除糖除裂解剂将离心后的裂解物用无菌O.OlM pH7. 2PBS溶液进行超滤浓缩，以去除蔗糖并进一步去除裂解剂，最终浓缩至合适液量，取样检测细菌内毒素含量和微生物限度，控制细菌内毒素不高于50EU/ml，微生物限度检测要求不高于lOcfu/ml ；(8)、除菌过滤纯化后的裂解物经0.22 μ m孔径的滤膜过滤即为单价原液，单价原液应置于2-8°C保存。
2.根据权利要求I所述的含MF59佐剂禽流感病毒裂解疫苗的制备工艺，其特征是半成品配制根据所配制的半成品总量计算原液用量，使血凝素含量为30yg/ml，按50%的量加入MF59佐剂，再加入Buffer溶液，混匀后经0. 22 μ m孔径的滤膜过滤，即为半成品。
全文摘要
本发明公开了一种含MF59佐剂禽流感病毒裂解疫苗的制备工艺，将R1203禽流感病毒株接种于鸡胚，经病毒接种与培养、收获病毒液、灭活病毒和纯化、裂解、再纯化、除菌过滤等生产工艺制成。本发明有益的效果是用MF59佐剂制备的疫苗免疫原性强，能产生更高的抗体应答；对接种常规疫苗后不能产生免疫应答或免疫应答较低的儿童和老年人能增强其免疫力；能对不同流感病毒亚型产生交叉免疫；在保持免疫力不变的前提下可以降低抗原含量，同时降低了能引起副反应的杂蛋白含量，因而疫苗的副反应更低低、安全性更好，不会出现毒力返强和变异的危险。
文档编号A61P31/16GK102600468SQ20121005121
公开日2012年7月25日 申请日期2012年3月1日 优先权日2012年3月1日
发明者姚伟, 朱智勇, 苏波, 蒋正东, 郭志军, 钟建琴 申请人:浙江天元生物药业有限公司