专利名称：一种可高效高特异灭杀乳腺癌细胞的药物t-visa-pea15的制作方法
技术领域：
本发明属于医药生物领域，具体涉及一种可高效高特异灭杀乳腺癌细胞的药物T-VISA-PEA15。
背景技术：
乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤，发病率呈逐年上升趋势，严重危害了人类的身 心健康。中晚期和复发转移的乳腺癌患者容易对现有的放化疗产生耐受，其愈后很差。因此，迫切需要研究一种具有高效靶向杀灭乳腺癌的新药。基因治疗已有20余年的发展历史，人们寄希望其能成为继手术、放化疗和靶向治疗之外的有效的替代疗法。目前肿瘤基因治疗中广泛采用的巨细胞病毒启动子(CMV)是目前活性最高的启动子，但该启动子没有组织特异性，在正常细胞中也高表达目的基因，目前所开发的临床试验产品虽然有一定的疗效，但由于毒副作用大，无法得到SFDA(中国食品与药品管理局)和美国FDA(食品与药品管理局)的批准进入临床使用。也有部分研究者使用肿瘤特异性启动子替代CMV进行基因治疗研究，结果发现，基因治疗的毒副作用大大降低，但由于其启动子活性低，其疗效也变得非常有限。因此，提高肿瘤特异性启动子的活性，开发一种高效高特异靶向杀灭乳腺癌的基因治疗药物前景广阔，具有重要的实用价值。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一种高效靶向乳腺癌ERK靶点，可高效高特异灭杀乳腺癌细胞的T-VISA-PEA15治疗载体。本发明的T-VISA-PEA15治疗载体，其特征在于，该T-VISA-PEA15治疗载体的核苷酸序列如SEQ ID NO. I所示。本发明的T-VISA-PEA15治疗载体是按照以下方法构建的本发明克隆端粒酶启动子hTERT，长度为418bp，具有肿瘤细胞特异性，但其活性在肿瘤细胞中不到CMV启动子活性的I %，因此无法广泛应用，本发明首先将hTERT启动子控制Gal4-VP2(两个拷贝的VP16，具有强烈的转录激活特性)融合蛋白基因；再将Gal4-VP2融合蛋白与Gal4效应元件G5E4T结合，启动靶基因或目的基因的大量转录；然后将WPRE位于目的基因的3-UTR，增强mRNA稳定性的作用，由此构建得到hTERT-VP16-GAL4-WPRE (VP16-GAL4-WPRE IntegratedSystemic Amplifier, VISA，整合性系统放大器)调控系统，简称为T-VISA (整合性系统放大器)系统，最后，结合PEA15基因(抑制ERK1/2进入胞核，促进肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤生长)作为治疗基因，建立T-VISA-PEA15载体，该T-VISA-PEA15治疗载体的核苷酸序列如SEQ ID NO. I 所示。本发明的第二个目的是提供一种可高效高特异杀灭乳腺癌细胞的药物T-VISA-PEA15脂质体，其特征在于，包括脂质体和被脂质体包被的T-VISA-PEA15治疗载体，所述的T-VISA-PEA15治疗载体的核苷酸序列如SEQ ID NO. I所示。所述的脂质体可以使用按照常规方法制备的脂质体，优选是通过以下方法制备的脂质体按照I摩尔胆固醇对应I. 7摩尔磷脂酰胆碱的比例，秤取磷脂酰胆碱与胆固醇，用磷脂酰胆碱质量1/4的氯仿作为溶剂溶解磷脂酰胆碱与胆固醇，将上述溶液置于旋转烧瓶中，旋转烧瓶使其混合均匀，再用真空抽吸器吸干溶剂，得到一层附着在烧瓶壁上的脂膜；然后再用按8. 9/100ml/g磷脂酰胆碱的量加入质量分数为5%的葡萄糖溶液溶解已干燥的脂膜，旋转真空干燥，然后再加入双蒸水至上述质量分数为5 %的葡萄糖溶液的体积，在500C的超声水浴箱中进行超声处理lmin，再在50°C下收集通过O. I μ m的聚碳酸酯膜滤膜的脂质体。通过该方法制备的脂质体粒径为ISOnm左右，容许其穿透肿瘤细胞中极细的毛细血管并被细胞摄取。所述的药物T-VISA-PEA15脂质体优选通过以下方法制备的，将上述脂质体加入至IJ 5%的葡萄糖溶液中使脂质体的浓度为8mM，将T-VISA-PEA15治疗载体加入到5%的葡萄糖溶液中使T-VISA-PEA15治疗载体的浓度为I μ g/ul，然后将脂质体溶液和T-VISA-PEA15 治疗载体溶液混合静置20min，由此得到药物T-VISA-PEA15脂质体。利用该方法制备得到的药物T-VISA-PEA15脂质体的粒径200 300nm，稳定性好，在4 8°C，1-2年无降解。本发明的药物T-VISA-PEA15脂质体在体外能高效杀灭一般乳腺癌细胞、三阴乳腺癌细胞系，而对正常细胞无杀灭作用，在动物模型中可抑制乳腺癌细胞的生长，延长小鼠的生存时间，对小鼠行为无明显影响，无死亡发生，无肝肾毒性。由此可见，本发明的T-VISA-PEA15治疗载体经脂质体包裹输送后，在乳腺癌部位富集，可高效靶向乳腺癌ERK靶点，抑制其进入细胞核，从而促进肿瘤细胞的凋亡，而对正常细胞无杀灭作用，可全身给药，基因表达量高、时间长、效率高，药效确切，毒副作用低，无肝肾毒性，在治疗乳腺癌的具有广阔的前景。
图I是T-VISA-PEA15治疗载体的结构示意图，它是以pUK-21为基本骨架，kana抗性的可治疗性载体；图2是药物T-VISA-PEA15脂质体在体外杀灭一般乳腺癌细胞、三阴乳腺癌细胞的结果图，其中Ctrl表示没有做任何处理的空白对照。图3是药物T-VISA-PEA15脂质体在动物模型中抑制乳腺癌生长的示意图，其中Ctrl表示没有做任何处理的空白对照；图4是药物T-VISA-PEA15脂质体在动物模型中的肝肾毒性，其中Ctrl表示没有做任何处理的空白对照。
具体实施例方式以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。一、T-VISA-PEA15 脂质体的制备实施例I :T-VISA_PEA15治疗载体的构建(一)pCRII-TOPO-hTERT 质粒克隆I、常规方法提取乳腺癌MCF-7细胞(从美国ATCC公司购买)的DNA。2、以该DNA作为模板，设计扩增hTERT的PCR引物，hTERT PCR上游(Forward)和下游(Reverse)引物
Forward :5' -ata tct aga ggc ccc tcc ctc ggg tta ccc cac agc~3' (XbaI)Reverse :5' -ata gat ctt atg egg ccg ccc acg tgc gca gca gga cgc agegc-3/ 。3、以乳腺癌 MCF-7 细胞 DNA 为模板，hTERT PCR 引物(Forward :5' -ata tct agaggc ccc tcc ctc ggg tta ccc cac agc~3' ；Reverse :5' -ata gat ctt atg egg ccgccc acg tgc gca gca gga cgc age gc~3' )、Pfu DNA polymerase、dNTP 和 PCR 反应液，扩增获得hTERT启动子(-416 to +1)产物，其序列如SEQ ID NO. 2所示。其PCR反应体系10XPCR buffer5 μ 1，上游(Forward)和下游(Reverse)引物各 I μ 1，MCF_7 细胞 DNA 为模板 IOOng DNA, 25mM MgCl2 3 μ I, IOmM dNTPs I μ I, Pfu-Taq(IU/μ I)，最后补水至 50 μ I。PCR反应条件94°C热变性5min，94°C变性lmin，55°C退火lmin，72°C延伸2min，共进行30次循环；最后72°C延伸IOmin。 4、PCR产物用Qiangen公司(美国)PCR DNA回收试剂盒回收，回收约418bp大小片断。方法参考其说明书。5、将回收的 PCR 产物 2 μ 1，pCRII-TOPO (Invitrogen, Carlsbad, CA) I μ I, DNAligase buffer I μ 1，最后补水至 10 μ 1,4°C 连接反应 IOmin06、将2μ I连接产物与50μ I E. coll DH5 α感受态细胞混合后，冰浴30min。42 °C水浴热激动反应45sec，然后冰上放置3min。加入预热的LB培养基500 μ 1，在37 °C下250rpm 震摇 30min。7、取200 μ I LB培养基细菌液，涂布ampicillin LB培养板上，在37°C下培养16小时。挑取阳性单克隆，提取质粒。8、酶切质粒鉴定，进行测序分析，证实hTERT启动子(其序列如SEQ ID NO. 2所示)已经插入克隆载体pCRII-TOPO中，命名为pCRII-TOPO-hTERT。( 二 ) pGL3-hTERT-Luc 质粒克隆I、用 KpnI/Xhol 酶切 pCRII-TOPO-hTERT 质粒，用 KpnI/Xhol 酶切 pGL-3-basic质粒(Promega公司，麦迪逊，WI),该质粒中含有突光素酶Luciferase基因。酶切体系IOXBuffer A 2 μ I, KpnI/Xhol I μ 1，质粒 5 μ g，补水至 20 μ 1，37°C水浴 I 小时。2、酶切产物在IXTAE Agarose凝胶中电泳，120v电泳30分钟，回收hTERT (418bp大小)片断和pGL-3-Basis(4792bp大小)片断。3、酶切产物用Qiangen公司(美国)PCR DNA回收试剂盒回收，方法参考其说明书。4、回收的 hTERT 产物 6μ 1，回收的 pGL-3-basic 产物 2μ 1，DNA ligase I μ I,buffer I μ 1，最后补水至10 μ 1，4°C连接反应4小时。5、将2μ I连接产物与50μ I E. coli DH5 α感受态细胞混合后，冰浴30min。42 °C水浴热激动反应45sec，然后冰上放置3min。加入预热的LB培养基500 μ 1，在37°C下250rpm 震摇 30min。6、取200 μ I LB培养基细菌液，涂布Ampicillin LB培养板上，在37°C下培养16小时。挑取阳性单克隆，提取质粒。7、酶切质粒鉴定,进行测序分析，证实hTERT启动子已经插入载体pGL_3_basic中，命名为pGL3-hTERT-Luc质粒。(三)pGL3-Luc-WPRE质粒克隆
I、用 Asp718/Sall 酶切 pGEM_3Z_WPRE 质粒(Promega 公司，麦迪逊，WI)，然后用DNA polymerase 平端；用 Small 酶切 pGL-3-basic 质粒(Promega 公司，麦迪逊,WI)。酶切体系10X Buffer A 2μ 1，Asp718 I μ 1/SalI I μ 1，质粒 5 μ g，补水至 20 μ 1，37°C 水浴 I小时。
2、酶切产物在IXTAE Agarose凝胶中电泳，120v电泳30分钟，回收WPRE (590bp大小)片断和pG_L3_Basis (约4800bp大小)片断。3、酶切产物用Qiangen公司(美国)PCR DNA回收试剂盒回收，方法参考其说明书。4、回收的 WPRE 产物 6μ 1，回收的 pGL-3-basic 产物 2μ 1，DNA ligase I μ I,buffer I μ 1，最后补水至10 μ 1，4°C连接反应4小时。5、2 μ I连接产物与50 μ I E. coli DH5 α感受态细胞混合后，冰浴30min。42°C水浴热激动反应45sec，然后冰上放置3min。加入预热的LB培养基500 μ 1，在37°C下250rpm震摇30min。6、取200 μ I LB培养基细菌液，涂布Ampicillin LB培养板上，在37°C下培养16小时。挑取阳性单克隆，提取质粒。7、酶切质粒鉴定，进行测序分析，证实WPRE插入了 pGL-3-basic中，命名为pGL3-Luc-WPRE 质粒。(四)pGU-hTERT-TSTA-Luc质粒克隆I、用 Hindlll/Notl 酶切 pCRII-TOPO-hTERT质粒(见上)，然后用 DNA polymerase平端；用 MSCI/Nhel 酶切 pGL3_TSTA_Luc 质粒(Invitrogen, Carlsbad, CA)，然后用 DNApolymerase 平端。酶切体系10X Buffer A 2 μ I, Hindlll/Notl or MSCI/Nhel I μ I,质粒5 μ g，补水至20 μ 1，37°C水浴I小时。2、酶切产物在IXTAE Agarose凝胶中电泳，120v电泳30分钟，回收hTERT (418bp大小)片断和pGL3-TSTA-Luc(7300bp大小)片断。3、酶切产物用Qiangen公司(美国)PCR DNA回收试剂盒回收，方法参考其说明书。4、回收的 hTERT 产物 6μ 1，回收的 pGL33-TSTA-Luc 产物 2μ 1，DNA ligase I μ I,buffer I μ 1，最后补水至10 μ 1，4°C连接反应4小时。5、2 μ I连接产物与50 μ I E. coli DH5 α感受态细胞混合后，冰浴30min。42°C水浴热激动反应45sec，然后冰上放置3min。加入预热的LB培养基500 μ 1，在37°C下250rpm震摇30min。6、取200 μ I LB培养基细菌液，涂布Ampicillin LB培养板上，在37°C下培养16小时。挑取阳性单克隆，提取质粒。7、酶切质粒鉴定，进行测序分析，证实hTERT启动子插入了载体pGL33_TSTA-Luc中，命名为 pGL3-hTERT-TSTA-Luc 质粒。(五)T-VISA-Luc质粒克隆I、用 Notl/Bglll 酶切 pGL3-Luc_WPRE 质粒(见上)；用 Notl/Bglll 酶切pGL3-hTERT-TSTA-Luc 质粒(见上)。酶切体系10X Buffer A 2 μ I, NotI I μ I, BglII1μ 1，质粒5yg，补水至20μ 1，37°C水浴I小时。2、酶切产物在IXTAE Agarose凝胶中电泳，120v电泳30分钟，回收WPRE (590bp大小)片断和 pGL3-hTERT-TSTA-Luc(7593bp 大小)片断。
3、酶切产物用Qiangen公司(美国)DNA回收试剂盒回收，方法参考其说明书。4、回收的 WPRE 产物 6 μ 1，回收的 pGL3-hTERT-TSTA_Luc 产物 2 μ 1，DNA ligase1μ 1，buffer I μ 1，最后补水至10 μ 1，4°C连接反应4小时。5、2 μ I连接产物与50 μ I E. coli DH5 α感受态细胞混合后，冰浴30min。42°C水浴热激动反应45sec，然后冰上放置3min。加入预热的LB培养基500 μ 1，在37°C下250rpm震摇30min。
6、取200 μ I LB培养基细菌液，涂布Ampicillin LB培养板上，在37°C下培养16小时。挑取阳性单克隆，提取质粒。7、酶切质粒鉴定，进行测序证实，命名为pGL3-hTERT-TSTA-Luc-WPRE质粒，简称pGL3-hTERT-VISA-Luc 质粒，即 T-VISA-Luc 质粒。(六)pGL3-T-VISA-PEA15质粒I、用 BamHI/EcoRV 酶切 pGL3_CMV_PEA15 质粒(购自美国 M. D. Anderson 癌症中心)平端，酶切体系IOX Buffer A 2 μ I, BamHI I μ I, EcoRV I μ 1，质粒 5 μ g，补水至20μ 1，37°C水浴I小时。用Bglll/Nhel酶切pGL3_hTERT_VISA-Luc质粒平端，酶切体系IOX Buffer A2 μ 1，BglII I μ 1，NheI I μ 1，质粒 5 μ g，补水至 20 μ 1，37°C水浴 I 小时。2、酶切产物在IXTAE Agarose凝胶中电泳，120v电泳30分钟，回收PEA15片段(426bp)和pGL3-hTERT-VISA片断(1650bp)(酶切去除了荧光素酶基因)。3、酶切产物用Qiangen公司(美国)DNA回收试剂盒回收，方法参考其说明书。4、回收的PEA15产物6μ 1，回收的pGL3-hTERT-VISA产物2μ 1，DNA ligase I μ I,bufferly 1，最后补水至10 μ 1，4°C连接反应4小时。5、2 μ I连接产物与50 μ I E. coli DH5 α感受态细胞混合后，冰浴30min。42°C水浴热激动反应45sec，然后冰上放置3min。加入预热的LB培养基500 μ 1，在37°C下250rpm震摇30min。6、取200 μ I LB培养基细菌液，涂布Ampicillin LB培养板上，在37°C下培养16小时。挑取阳性单克隆，提取质粒。7、酶切质粒鉴定，进行测序证实，PEA15基因插入到pGL3_hTERT_VISA中，命名为PGL3-T-VISA-PEA15 质粒。(七)pUK21-T-VISA-PEA15治疗载体I、用 Notl/Sall 酶切 pGL3-T-VISA-PEA15 质粒，酶切体系10X Buffer A 2μ I,NotI I μ I, Sail I μ I，质粒 5 μ g，补水至 20 μ 1，37°C水浴 I 小时。用 Notl/Sall 酶切 pUK21质粒，酶切体系为10X Buffer A 2 μ I, NotI I μ 1，Sail I μ 1，质粒 5 μ g，补水至 20 μ 1，37°C水浴I小时。2、酶切产物在IXTAE Agarose凝胶中电泳，120v电泳30分钟，回收T-VISA-PEA15片段(6905bp)和 pUK21 片段(816bp)。3、酶切产物用Qiangen公司(美国)DNA回收试剂盒回收，方法参考其说明书。4、回收的 T-VISA-PEA15 产物 6μ 1，回收的 pUK21 产物 2μ 1，DNA ligase I μ I,buffer I μ 1，最后补水至10 μ 1，4°C连接反应4小时。5、2 μ I连接产物与50 μ I E. coli DH5 α感受态细胞混合后，冰浴30min。42°C水浴热激动反应45sec，然后冰上放置3min。加入预热的LB培养基500 μ 1，在37°C下250rpm震摇30min。6、取200μ1 LB培养基细菌液，涂布Kanamycin LB培养板上，在37°C下培养16小时。挑取阳性单克隆，提取质粒。7、酶切质粒鉴定，进行测序证实，T-VISA-PEA15片段插入到pUK21质粒的NotI/SalI位点，命名为pUK21-T-VISA-PEA15治疗载体，简称T-VISA-PEA15治疗载体，经测序其序列如SEQ ID NO. I所示。pUK21-T-VISA-PEA15 治疗载体是 pGL3_CMV_PEA15 经 BamHI/EcoRV/ 酶切平端后，PEA15片段插入到pGL3-hTERT-TSTA-Luc-WPRE质粒的Bgl II/Nhel/平端位点，产生PGL3-T-VISA-PEA15 质粒。pGL3_T-VISA_PEA15 质粒 Notl/Sall 酶切后，T-VISA-PEA15片段插入到PUK21质粒的Notl/Sall位点，产生pUK21-T-VISA-PEA15治疗载体，简称为 T-VISA-PEA15治疗载体，其结构如图I所示。pUK21-T-VISA-PEA15治疗载体主要包括hTERT启动子(其序列如SEQ ID NO. 2所示)、WPRE(其序列如SEQ ID NO. 3所示)、G5E4T(其序列如SEQ ID NO. 4所示)和Gal4-VP2基因(其序列如SEQ ID NO. 5所示)和PEA15基因(其序列如SEQ ID NO. 6所示)。hTERT启动子控制Gal4-VP2 (两个拷贝的VP16，具有强烈的转录激活特性)融合蛋白基因；Gal4-VP2融合蛋白与Gal4效应元件G5E4T结合，启动PEA15基因的大量转录，PEA15基因抑制ERK进入细胞核，导致细胞凋亡。实施例2 :脂质体的制备将脂质从冰箱中取出(D0TAP储存于_20°C、胆固醇储存于_4°C )，恢复至室温。水浴加热2个旋转蒸发仪分别至30°C，50°C。称取68. 75mg胆固醇，放入IOOOml圆底烧瓶。向圆底烧瓶中加入IOOmg DOTAP和25mg Chloroform。转动烧瓶，使其充分混合。在30°C的水浴箱中旋转圆底烧瓶2min，使其混合均匀，在烧瓶壁上形成一层薄膜。打开真空抽吸器，30°C下30min。加入8. 9ml预热的5%葡萄糖溶液溶解已干燥的薄膜,50°C下以105转/min快速旋转45min。然后降低温度至35°C旋转lOmin。用保鲜膜(或石蜡)封口烧瓶，室温下过夜，避光。测量体积，加双蒸水至8. 9ml。在50°C的超声水浴箱中(200W)对烧瓶进行超声处理 I 分钟。在 50°C下依次通过 I. O μ m，0. 45 μ m，0. 22 μ m，0. I μ m 的滤膜(I. O μ m，O. 45 μ m为 Whatman 的 polysufone 滤膜，货号分别为 #6780-1310 和 #6780-1304 ；0. 22ym,0. Iym为Whatman的Anotop滤膜，货号分别为#6808-1122和#6809-1112)，最后通过0. I μ m的脂质体放入洁净的玻璃瓶中。用氮气填充试管10秒，将脂质体保存于试管中置于4°C避光保存备用(同时防止空气进入)。实施例3 T-VISA-PEA15脂质体的制备T-VISA-PEA15治疗载体溶于5%葡萄糖溶液，使其终浓度为lug/ul，同时将存储浓度(20mM)的实施例2的脂质体用5%葡萄糖溶液稀释为工作浓度(8mM)。I μ g DNA/ul的T-VISA-PEA15治疗载体缓慢加入8mM的脂质体中(治疗载体脂质体=20ug 50ul)，在室温中静置20分钟，反应，形成T-VISA-PEA15脂质体。然后再检定、生物特性检测和内毒素等质控，无菌分装。成品检定，包装，4_8°C保存；使用前先放室温20分钟，可直接用于体外研究，也可用于体内研究，也可用5%葡萄糖溶液稀释后使用。二、效果实验
I、T-VISA-PEA15脂质体的生物特性
对实施例3获得的T-VISA-PEA15脂质体进行生物特性测定，其生物特性如下脂质体大小经动态光散射所测的脂质体粒径在180nm左右，包裹质粒后粒径约为 200nm-300nm。脂质体稳定性在4-8度1-2年无降解。浓度4mM。2、T-VISA-PEA15脂质体的抗乳腺癌活性2. I体外实验将T-VISA-PEA15脂质体共转染乳腺癌细胞、三阴乳腺癌细胞、乳腺癌干细胞系和正常细胞系，48小时后，收集细胞、裂解，计算细胞存活率，以未做任何处理的癌细胞作为空白对照(即图中的ctrl)，结果如图2所示，由图2中可以看出，T-VISA-PEA15脂质体可高效杀灭乳腺癌细胞、三阴乳腺癌细胞(231细胞)，对正常细胞没有明显杀伤作用。2. 2体内实验2. 2. I T-VISA-PEA15脂质体在动物模型中可抑制乳腺癌生长在Balb/c裸鼠中原位接种三阴乳腺癌细胞(231_luc细胞系，稳定表达Iuciferase蛋白)，三周后，通过尾静脉注射T-VISA-PEA15脂质体15ug/只，每周两次，连续三周，用Xenogen IVIS活体成像仪动态观察祀基因Luciferase表达,动态观察肿瘤发生发展和生存时间。结果如图3所示，由图3(活体成像监测肿瘤生物信号强弱)表明，T-VISA-PEA15有效抑制肿瘤的生长，并延长小鼠生存时间。2. 2. 2 T-VISA-PEA15脂质体在动物模型中无肝肾毒性50 μ g/只T-VISA-PEA15脂质体通过尾静脉注射Balb/c鼠，观察小鼠行为和生存状况，并在注射后第二天和第四天采血，生化自动分析仪检测AST (谷草转氨酶)、ALT (谷丙转氨酶)和CRE (肌酐)等。结果如图4所示，由图4表明，T-VISA-PEAl5脂质体与CMV-PEAl5脂质体(其制备方法同T-VISA-PEA15脂质体)相比较，T-VISA-PEA15脂质体对小鼠行为无明显影响，无死亡发生，对肝功能和肾功能无影响，无肝肾毒性。
权利要求
1.一种可高效高特异灭杀乳腺癌细胞的T-VISA-PEA15治疗载体，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO. I所示。
2.一种可高效高特异灭杀乳腺癌细胞的药物T-VISA-PEA15脂质体，其特征在于，包括脂质体和被脂质体包被的T-VISA-PEA15治疗载体，所述的T-VISA-PEA15治疗载体的核苷酸序列如SEQ ID NO. I所示。
3.根据权利要求2所述的可高效高特异灭杀乳腺癌细胞的药物T-VISA-PEA15脂质体，其特征在于，所述的脂质体是通过以下方法制备的按照I摩尔胆固醇对应I. 7摩尔磷脂酰胆碱的比例，秤取磷脂酰胆碱与胆固醇，用磷脂酰胆碱质量1/4的氯仿作为溶剂溶解磷脂酰胆碱与胆固醇，将上述溶液置于旋转烧瓶中，旋转烧瓶使其混合均匀，再用真空抽吸器吸干溶剤，得到ー层附着在烧瓶壁上的脂膜；然后再用按8. 9/100ml/g磷脂酰胆碱的量加入质量分数为5%的葡萄糖溶液溶解已干燥的脂膜，旋转真空干燥，然后再加入双蒸水至上述质量分数为5 %的葡萄糖溶液的体积，在50°C的超声水浴箱中进行超声处理lmin，再在50°C下收集通过O. I μ m的聚碳酸酯膜滤膜的脂质体。
4.根据权利要求3所述的可高效高特异灭杀乳腺癌细胞的药物T-VISA-PEA15脂质体，其特征在于，所述的药物T-VISA-PEA15脂质体是通过以下方法制备的将脂质体加入到5%的葡萄糖溶液中使脂质体的浓度为8mM，将T-VISA-PEA15治疗载体加入到5%的葡萄糖溶液中使T-VISA-PEA15治疗载体的浓度为I μ g/μ 1，然后将脂质体溶液和T-VISA-PEA15治疗载体溶液混合静置20min，由此得到药物T-VISA-PEA15脂质体。
全文摘要
本发明公开了一种可高效高特异灭杀乳腺癌细胞的药物T-VISA-PEA15。可高效高特异灭杀乳腺癌细胞的T-VISA-PEA15治疗载体，其序列如SEQ ID NO.1所示。所述的可高效高特异灭杀乳腺癌细胞的药物T-VISA-PEA15脂质体，包括脂质体和被脂质体包被的T-VISA-PEA15治疗载体，所述的T-VISA-PEA15治疗载体的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明的T-VISA-PEA15治疗载体经脂质体包裹输送后，在乳腺癌部位富集，可高效靶向乳腺癌ERK靶点，抑制其进入细胞核，从而促进肿瘤细胞的凋亡，而对正常细胞无杀灭作用，可全身给药，基因表达量高、时间长、效率高，药效确切，毒副作用低，无肝肾毒性，在治疗乳腺癌的具有广阔的前景。
文档编号A61K48/00GK102634531SQ20121006381
公开日2012年8月15日 申请日期2012年3月12日 优先权日2012年3月12日
发明者伍民庆, 刘鹏, 唐军, 孔亚楠, 李来胜, 王曦, 肖祥胜, 谢小明, 谢新华, 郭姣丽, 韦尉东 申请人:中山大学肿瘤防治中心