专利名称：竹叶青蛇毒l-氨基酸氧化酶的制备方法及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种竹叶青蛇毒L-氨基酸氧化酶的制备方法及应用，属于生物医学技术领域。
背景技术：
长期以来，一直被认为是“不治之症”的肿瘤是医药界研究热门课题之一。现有的抗肿瘤药物疗效很有限，而且大多有严重的副作用，使用效果远远没有达到人们的预期。目前市场上还有一类免疫治疗药物，即经过激活人的免疫功能以达到促进攻击癌细胞的药物也不少，但因各种癌细胞本身具有免疫力，所以疗效并不理想。因此，目前抗肿瘤药物的开发也成为本世纪新药研究的重大课题。蛇毒L-氨基酸氧化酶(LAAO)是一种有潜力的抗肿瘤制剂，具有广阔的临床应用前景，但目前采用提取蛇毒L-氨基酸氧化酶的工业化生产还不现实。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种竹叶青蛇毒L-氨基酸氧化酶的制备方法及应用，为研制新型的抗肿瘤药物打下基础并使得大规模制备蛇毒L-氨基酸氧化酶成为可能。为解决上述技术问题，本发明采用如下的技术方案一种竹叶青蛇毒L-氨基酸氧化酶的制备方法。该方法按照下列步骤进行(I)竹叶青蛇毒毒腺总RNA的提取和RT从_70°C冰箱取出竹叶青蛇的毒腺，置于研钵中磨成粉末，然后按RNA提取试剂盒说明提取竹叶青总RNA ；以抽提的总RNA为模板反转录为cDNA，反应按照Promega公司逆转录试剂盒手册进行，其反应体系为42°C 60min,95°C 10min，4°C保存；(2)竹叶青蛇毒L-氨基酸氧化酶的PCR扩增以cDNA为模板，根据Genebank中公布的竹叶青L-氨基酸氧化酶的基因序列的开放阅读框利用Primer Primer 5. O软件设计引物进行PCR扩增；所述引物中，上游引物为含 BamHI 酶切位点 5’ -CGCGGATCCCCACAGTCTTCAAGCCAATA-3 ';含 HindIII 酶切位点 5， CCCAAGCTT GGGACTATAGCTCCTAGAAT-3'；(3) PCR扩增产物的回收将PCR扩增产物于O. 8 %琼脂糖凝胶中进行电泳分离30min后，在紫外灯下观察并切下含有目的条带的凝胶，按照胶回收试剂盒说明回收DNA片段，回收产物保存于_20°C ；(4)竹叶青蛇毒L-氨基酸氧化酶的克隆与测序将扩增竹叶青蛇毒L-氨基酸氧化酶目的片段与pMD18-T载体连接，然后转化感受态细胞，转化大肠杆菌感受态细胞DH5 α，并将其铺于含有50 μ g/mL氨苄青霉素的LB培养基平板中进行培养，在37°C培养12 16h后观察结果；挑取菌落进行接种在含50 μ g/mL氨苄青霉素(AMP)的LB培养液中，取2μ L为模板进行PCR鉴定，阳性的克隆菌株进行测序；
(5)竹叶青蛇毒L-氨基酸氧化酶序列分析通过BLAST搜索与其同源性高的基因序列，通过ORF Finder软件预测竹叶青蛇毒 L-氨基酸氧化酶基因开放阅读框，并用BLAST验证；用信号肽预测软件Signal IP进行信号肽预测，并通过BLAST搜索与竹叶青蛇毒L-氨基酸氧化酶基因阅读框编码的氨基酸序列同源性高的其他同系物,并作比较。上述的竹叶青蛇毒L-氨基酸氧化酶的制备方法，步骤⑵中，PCR反应体系为 2 X TaqPCR MasterMix 25μ L ;cDNA 产物3μ L ;无菌水19 μ L，上下游引物各 I. 5μ L ;反应程序为95°C预变性5min ;95°C变性30s，57°C退火30s，72°C延伸45s，循环扩增30次，最后 72°C延伸 IOmin0竹叶青蛇毒L-氨基酸氧化酶作为制备抗肿瘤药物的应用。为验证竹叶青蛇毒L-氨基酸氧化酶的治疗效果，发明人进行了一系列的实验，其结果如下I.试剂与材料I. I试剂IPTG，Sigma公司产品;Taq酶，捷瑞生物公司产品；BamH I和Hind III， MBI 公司产品；SDS,TaKaRa 公司产品；DNA Marker DL2000,TaqPCR MasterMix,BL21 (DE3), 大连宝生物公司产品；DNA回收试剂盒，QIAGEN公司产品产品；PCR引物，由上海生工合成； pMD18-T-ALAg,由贵阳中医学院微生物实验室制备；Pet28a(+), Invitrogen产品。I. 2材料竹叶青蛇毒，采自贵州省思南县；白兔，购自贵阳医学院实验动物中心； 癌细胞株，购于中科院细胞所。2 方法2. I兔抗竹叶青蛇毒LAAO阳性血清的制备竹叶青蛇毒用甲醛脱毒后，按《海峡药学》，2009，21 (12) :217_220 (张明芳、齐元麟)“眼镜蛇毒L-氨基酸氧化酶的纯化、性质鉴定及细胞毒性测定”方法进行纯化竹叶青蛇毒L-氨基酸氧化酶，加油佐剂(浓度为O. 2g/L)，免疫分为基础免疫和超免疫，在兔子的背部两侧肌肉注射(O. Iyg)进行基础免疫，每次间隔3周，在皮下和肌肉、穴位交替进行加强免疫，每只兔子lmg，每次免疫间隔2周。免疫后采用琼脂扩散试验测免疫血清效价，达到 28时进行采血分离血清。2. 2质粒DNA的小量提取从冰箱取出含pMD18-T-LAA0的DH5 α的EP管于冰浴溶解，1000r/min离心5min， 加入IOyL的LB液体培养基，37 °C 200rpm振荡培养lh，涂布于含有氨苄青霉素(Amp， 100 μ g/mL)的LB琼脂平扳上，37°C培养12 16h，挑取菌落进行加入100 μ L的LB液体培养基培养，离心取沉淀进行质粒DNA提取。2. 3Pet28a (+) -LAAO 构建和酶切鉴定pMD18-T-LAA0和Pet28a(+)质粒经BamH I和Hind III分别进行双酶切，回收目的片段进行连接并转化DH5 α，并将其铺于含有Amp的LB培养基平板中，挑取单个菌落加入 LB液体培养基中在37°C培养过夜，PCR检测为阳性菌落进行抽提质粒DNA。采用BamH I和 Hind III进行双酶切鉴定，将双酶切鉴定正确的菌株送往大连宝生物公司测序。2. 4重组蛋白诱导表达及SDS-PAGE将测序正确的菌株抽提Pet28a(+)_LAA0质粒转化BL21(DE3)，加入100 μ L的LB液体培养基，370C 200rpm培养lh，涂布于含有Amp的LB琼脂平扳上37°C培养12 16h，挑取单个菌落进行PCR，PCR阳性菌株加入5mL培养物经IPTG诱导表达3h，同时设未经IPTG诱导表达菌株作为对照。取诱导和未诱导的细菌培养物离心后，分别取沉淀和上清液按I : I 的比例加入2x上样缓冲液于煮沸5min，瞬间离心。在样品孔内分别加入待检样品(10 μ L/ 孔)进行电泳，同时设标准蛋白Marker，采用考马斯亮蓝R-250进行染色。2. 5重组蛋白的纯化按I : 100比例将培养过夜的BL21 (DE3)接种到新的LB液体培养基中，37°C培养至OD55tl= 1.0。在IPTG诱导表达3h进行大量表达，收集诱导表达菌。用I % PBS (pH 7.2) 洗涤菌体2次，然后用菌体裂解液重悬菌体并经超声破碎来裂解菌体，最后收集沉淀在4°C 温度下lOOOOgxlOmin离心，并通过去污剂的充分洗涤得到包涵体。将包涵体溶解于7mol/ L尿素中，经梯度透析复性法复性，即获得初步纯化的复性液，过滤除菌后备用。2. 7ffestern-blot将纯化蛋白进行SDS-PAGE，电泳结束后进行转膜和Western-blot分析。用0. OlM PBS洗膜3次，5min/次(以下同);加入包被液室温孵育2h ;弃包被液，洗膜；加入兔抗竹叶青蛇毒阳性血清(按I : 500的比例)，4°C孵育12h以上；弃一抗，洗膜3次；加入羊抗兔辣根过氧化物酶偶联的二抗(作I : 8，000稀释)，室温孵育2h;弃二抗，用PBS洗膜4 次；加入显色液(TMB)避光显色。2. 8重组蛋白对抑瘤率的影响分别取出冻存人鼻咽癌、人宫颈癌和卵巢癌细胞株复苏后进行培养。用0.2%台盼蓝染色计数活细胞率。当活细胞率彡95%时，调整细胞数为I X IO6个/ml，分别于小鼠右腋下注射接种0. 2ml/只。建立小鼠鼻咽癌、人宫颈癌和卵巢癌实体瘤模型。动物随机分5组其中3个组为人鼻咽癌、人宫颈癌和卵巢癌细胞株组，接种癌细胞24h后，每组又分为重组蛋白高、中、低剂量三个小组(100、50和20mg/kg)灌胃；另外2 个组分别为PBS阴性和CTX阳性对照组腹腔注射(0. lml/10g体重)。所有动物每天给药I 次，连续10d。停药第2d脱颈处死小鼠，剖取瘤块进行称重，采用肿瘤抑制率(％)=(对照组平均瘤重-给药组平均瘤重)/对照组平均瘤重X 100公式计算抑瘤率。停药后观察小鼠存活天数，计算小鼠生命延长率。生命延长率(％)=(给药组平均存活天数-对照组平均存活天数)/对照组平均存活天数X 100。2. 9数据统计用SPSS软件进行分析，统计结果用“X土s”来表示。3 结果3. lPet28a(+)ALAg 质粒的酶切鉴定将Pet28a(+)_LAA0质粒转化大肠杆菌后DH5 α，挑取单个菌落提取质粒，用BamH I和Hind III进行双酶切鉴定，可得到pET32a(+)载体骨架片段和750bp IOOObp的目的片段，目的片段与预期大小相符(图I)。结果表明，LAAO基因片段已连接到Pet28a⑴载体中。3. 2SDS-PAGE 和 Western-blot 分析将构建Pet28a(+)-LAAO转化E. coli DH5 α，挑取阳性克隆进行测序，将正确的克隆菌的质粒转化到Ε. coli BL21中进行诱导表达，取菌液离心取上清，沉淀经超声波破碎后离心，分别经SDS-PAGE分析发现表达蛋白主要以包涵体表达。取诱导表达3h的菌液进行 SDS-PAGE，表达产物大小约为58kDa，而含空载体的细菌经诱导后无大小为58KDa条带，将纯化后的蛋白进行Western-blot分析,结果发现含空载体菌表达产物不能和兔抗竹叶青蛇毒LAAO阳性血清发生反应，而含重组载体菌表达产物能与兔抗阳性血清发生反应，结果如图2。3. 2重组蛋白对荷瘤小鼠抑瘤率的影响纯化蛋白对荷瘤小鼠抑瘤率实验结果表明，小鼠灌服重组蛋白后，低、中、高3个剂量组(50、100、150mg/kg体重，此剂量为换算成药物剂量)对小鼠实体瘤均有明显的抑制作用。3个剂量组与阴性对照组相比，实体瘤重明显降低，体积变小，抑瘤率分别达到 55. 3%,55. 4%和60. 3%。结果分析显示低、中、高剂量组与阴性对照组比较，差异均极显著(P <0.01)，但与CTX对照组相比较，也均表现为差异极显著(P <0.01)。表明灌服重组蛋白可显著的抑制小鼠实体瘤的生长(表1、2和3)。表I重组蛋白对荷瘤小鼠抑瘤率的影响(X土s，η = 10)
权利要求
1.一种竹叶青蛇毒L-氨基酸氧化酶的制备方法，其特征在于按照下列步骤进行(1)竹叶青蛇毒毒腺总RNA的提取和RT从_70°C冰箱取出竹叶青蛇的毒腺，置于研钵中磨成粉末，然后按RNA提取试剂盒说明提取竹叶青总RNA ；以抽提的总RNA为模板反转录为cDNA,反应按照Promega公司逆转录试剂盒手册进行，其反应体系为42°C 60min,95°C 10min，4°C保存；(2)竹叶青蛇毒L-氨基酸氧化酶的PCR扩增以cDNA为模板，根据Genebank中公布的竹叶青L-氨基酸氧化酶的基因序列的开放阅读框利用Primer Primer 5. O软件设计引物进行PCR扩增；所述引物中，上游引物为含 BamHI 酶切位点 5，CGCGGATCCCCACAGTCTTCAAGCCAATA-3 '；含 HindiII 酶切位点 5， CCCAAGCTT GGGACTATAGCTCCTAGAAT-3'；(3)PCR扩增产物的回收将PCR扩增产物于O. 8 %琼脂糖凝胶中进行电泳分离30min后，在紫外灯下观察并切下含有目的条带的凝胶，按照胶回收试剂盒说明回收DNA片段，回收产物保存于_20°C ；(4)竹叶青蛇毒L-氨基酸氧化酶的克隆与测序将扩增竹叶青蛇毒L-氨基酸氧化酶目的片段与PMD18-T载体连接，然后转化感受态细胞，转化大肠杆菌感受态细胞DH5 α，并将其铺于含有50 μ g/mL氨苄青霉素的LB培养基平板中进行培养，在37°C培养12 16h后观察结果；挑取菌落进行接种在含50 μ g/mL氨苄青霉素的LB培养液中，取2 μ L为模板进行PCR鉴定，阳性的克隆菌株进行测序；(5)竹叶青蛇毒L-氨基酸氧化酶序列分析通过BLAST搜索与其同源性高的基因序列，通过ORF Finder软件预测竹叶青蛇毒L-氨基酸氧化酶基因开放阅读框，并用BLAST验证；用信号肽预测软件Signal IP进行信号肽预测，并通过BLAST搜索与竹叶青蛇毒L-氨基酸氧化酶基因阅读框编码的氨基酸序列同源性高的其他同系物，并作比较。
2.根据权利要求I所述的竹叶青蛇毒L-氨基酸氧化酶的制备方法，其特征在于步骤(2)中，PCR反应体系为2XTaqPCR MasterMix 25μ L ;cDNA产物3μ L ;无菌水19 μ L，上下游引物各I. 5yL ;反应程序为:95°C预变性5min ;95°C变性30s，57°C退火30s， 72°C延伸45s，循环扩增30次，最后72°C延伸IOmin0
3.竹叶青蛇毒L-氨基酸氧化酶作为制备抗肿瘤药物的应用。
全文摘要
本发明是一种竹叶青蛇毒L-氨基酸氧化酶的制备方法及应用，该方法从-70℃的冰箱已保存的竹叶青蛇毒腺进行总RNA的提取，反转录成cDNA，根据Genebank中公布的序列(AY277739)利用引物设计软件进行设计引物，以cDNA为模板，利用RT-PCR技术扩增出竹叶青蛇毒L-氨基酸氧化酶基因，并进行克隆和测序；试验表明本发明的重组蛋白能被兔抗竹叶青蛇毒L-氨基酸氧化酶(LAAO)阳性血清所识别且重组蛋白低、中、高剂量组荷瘤小鼠生命延长率与阴性对照组均存在差异极显著。本发明为深入开发利用竹叶青蛇毒提供了依据，为进一步研制新型的抗肿瘤药物打下了良好的基础，具有广阔的生产和临床应用前景。
文档编号A61K38/44GK102604970SQ201210074428
公开日2012年7月25日 申请日期2012年3月20日 优先权日2012年3月20日
发明者何光志, 曹锋, 王安宇, 王平, 王文佳, 田维毅, 许滔, 黄高 申请人:贵阳中医学院