专利名称：四环素类药物联合应用氟康唑在制备抗真菌产品中的应用及其产品的制作方法
技术领域：
本发明涉及医药技术领域，具体涉及四环素类药物多西环素和米诺环素联合氟康唑在制备抗真菌产品中的应用，进一步涉及钙通道阻滞剂贝尼地平、硝苯地平及钙离子螯合剂EDTA联合氟氯唑及氟康唑与多西环素/米诺环素对不同敏感程度白色念珠菌的联合抗真菌作用。本发明还涉及含有上述组份或含量的产品。
背景技术：
近年来，随着恶性肿瘤、艾滋病、自身免疫病等发病率的增多，导管插管和器官移植等技术的开展，广谱抗生素、皮质激素和免疫抑制剂的广泛使用，真菌感染的发病率急剧上升(Odds FC. Pathogenesis of Candida infections. J Am Acad Dermatol. 1994,31 :S2-S5)。特别是呼吸机与大量生物材料的应用，使得生物膜(biofilm，BF)相关真菌的感染发生率不断增加。BF形成是临床耐药性的重要机制之一，BF相关真菌感染的临床治疗非常困难。研究表明，AIDS患者晚期感染真菌后，超过三分之一耐药，对唑类药物耐药率高达 65% (Saltanat H, Li H, Geng XH et al. Clinical distribution and drugresistance of Candida infection. Journal of Xingjiang Medical University 2008，31(8) :1058-1060.)。新药研究与联合用药研究均是解决真菌耐药的途径。而联合用药其前期投入少、效果显著，受到国内外的关注。联合用药研究包括两种抗真菌药联合及非抗真菌药与抗真菌药联合，由于抗真菌药物品种有限，新的抗真菌作用价格昂贵且副作用明显，使得非抗真菌药物与抗真菌药物的联合应用研究备受关注。氟康唑(FLC)作为安全、有效、价廉的唑类抗真菌药物，临床应用非常广泛，导致真菌耐药率不断上升。因此，与FLC的联合抗真菌作用成为研究的热点。本实验室前期研究发现，米诺环素(MINO)与FLC具有协同抗真菌作用，特别是对耐药白色念珠菌效果明显。研究二者协同机制时发现，细胞内外钙离子环境的改变能明显影响协同抗真菌作用。非选择性钙离子通道阻滞剂贝尼地平(BEN)、选择性L型钙离子通道阻滞剂硝苯地平(NIF)及钙离子螯合剂EDTA均对其协同抗真菌作用产生较强的增效作用。此外，进一步研究表明，同为四环素类抗生素的多西环素(DOX)与FLC合用也具有良好的协同抗真菌作用，并且钙调节剂BEN、NIF及EDTA对DOX与FLC的协同抗真菌作用同样具有增效作用，并且NIF、EDTA对FLC也有一定的增效作用。前已述及，加强新药开发是抗耐药真菌感染的重要策略。新药开发包括全新化合物的活性研究，老药新作用研究。新机制、新祀点的发现会给抗真菌带来新的希望。目前抗真菌的机制包括抑制真菌细胞壁的合成；抑制真菌细胞膜主要成分麦角留醇的合成以及直接作用于麦角留醇的结构，作用于真菌核酸代谢等。是否还存在其它抗真菌途径与机制有待进一步研究。钙离子是白色念珠菌重要的信使物质之一，参与细胞增殖分化、生长衰老等一系列生命活动的信息传递与调控。细胞内钙超载一直被认为是细胞损伤的重要病理环节。.研究发现，真菌细胞对药物作用导致的病理性损伤后，稳态平衡能力是其耐药性产生的主要决定因素(Hameed S, Dhamgaye S, Singh A, Goswami SK, Prasad R(2011) CalcineurinSignaling and Membrane Lipid Homeostasis Regulates Iron Mediated MultiDrugResistance Mechanisms in Candida albicans. PLoS ONE 6(4) :el8684.)。近期研究报道及我们的研究也不断发现，钙调节通路与抗真菌有关，有望成为新的抗真菌机制。
发明内容
本发明的目的是为克服目前真菌感染问题，提供一种四环素类药物多西环素或米诺环素联合应用氟康唑在制备抗真菌产品中的应用；本发明还提供了钙通道阻滞剂贝尼地平、硝苯地平及钙离子螯合剂EDTA联合氟氯唑及氟康唑与多西环素/米诺环素在制备抗真菌产品中的应用。本发明还涉及含有上述组份或含量的产品。
为实现上述目的，本发明采用下述技术方案四环素类药物多西环素或米诺环素联合应用氟康唑在制备抗真菌产品中的应用。所述真菌为白色念珠菌。联合应用时多西环素与氟康唑的最低抑菌浓度为16μ g/ml与4μ g/ml ;米诺环素与氟康唑的最低抑菌浓度为16 μ g/ml与2μ g/ml。结果表明，大于16 μ g/ml多西环素与大于4 μ g/ml的氟康唑联合应用均有效；大于16 μ g/ml米诺环素与大于2 μ g/ml的氟康唑联合应用均有效；加入贝尼地平、硝苯地平或金属离子螯合剂EDTA，平板划线与液体定量法均证实能增强上述联合抗真菌作用。当加入贝尼地平、硝苯地平或金属离子螯合剂EDTA后，下列浓度配比有效贝尼地平多西环素氟康唑=8:4: 2 ( μ g/ml)；贝尼地平米诺环素氟康唑=8 16 I ( μ g/ml)；硝苯地平多西环素氟康唑=8:4: I ( μ g/ml)；硝苯地平米诺环素氟康唑=8:8: I ( μ g/ml)；EDTA :多西环素氟康唑=O. 5mM : 4 μ g/ml : I μ g/ml ；EDTA :米诺环素氟康唑=O. 5mM : 4 μ g/ml : O. 5 μ g/ml进一步对钙调节剂的有效浓度进行评价时，发现当多西环素与氟康唑浓度为16 μ g/ml与4μ g/ml,米诺环素与氟康唑的最低抑菌浓度为16 μ g/ml与2μ g/ml时,加入的最低钙调节剂的有效浓度贝尼地平为4 μ g/ml，硝苯地平为8 μ g/ml，EDTA为O. 25mM。本发明还提供了一种含有上述组份或含量的产品。本发明采用白色念珠菌细胞进行研究，利用平板划线法及液体定量法，分别评价不同联合用药组合的联合抗真菌作用。具体内容如下A:FLC与D0X/MIN0联合抗白色念珠菌作用采用液体定量法测定联合用药时最低有效浓度，并以FICI法选择最佳药物组合浓度及评价药物联合用药的作用。B :钙调节剂对FLC与D0X/MIN0联合抗白色念珠菌作用的影响实验分空白对照组，FLC、D0X/MIN0、BEN/NIF/EDTA 单用组，FLC 与 D0X/MIN 或 BEN/NIF/EDTA 两药联用组，FLC与D0X/MIN及BEN/NIF/EDTA三药联用组四组，利用平板划线法观察加入钙调节剂后对各组抗白色念珠作用的影响。并利用液体定量法测定钙调节剂对FLC与D0X/MIN0合用的联合最低有效浓度。
C :四环素类药物为临床常用的抗菌药物，如果能在抗真菌方面发挥作用，特别是对细菌与真菌混合感染的治疗，意义重大。本研究表明，四环素类联合FLC产生协同抗真菌作用，可扩大其应用范围。钙离子通道阻滞剂是一类常用的降压药，可分为非选择性和选择性钙离子通道阻滞剂两大类。扩大钙离子通道阻滞剂类药物的应用范围既有明显的可行性和实际的临床意义。EDTA是FDA新认证的可以用于食品的添加剂，其对抗真菌作用的增效作用，可使其扩大应用范围，具有良好的应用前景。总之，本发明包含 FLC与D0X/MIN0联合应用产生协同抗白色念珠菌的作用，以及钙调节剂BEN、NIF及EDTA对FLC及FLC与四环素类药物的联合抗真菌作用具有增效作用。上述发现为临床提供了联合用药作为治疗真菌感染的治疗方案。另外，钙调节剂的加入可以增强药物的抗真菌作用，揭示其协同作用机制可能与细胞内钙离子有关，为研究抗真菌药物作用的新靶点提供思路。本发明与现有技术相比，具有以下优点与效果I.本发明表明，FLC与四环素类药物DOX和MINO联用时，可以产生协同抗真菌作用。对氟康唑耐药的白色念珠菌菌株(MIC > 256 μ g/ml)，联合用药可使其最低抑菌浓度明显降低，16 μ g/ml 的 DOX 与 4 μ g/ml 的 FLC 合用及 16 μ g/ml 的 MINO 与 2 μ g/ml 的 FLC 合用均可以杀灭80%以上的真菌，浓度再增大，效果更强。2.本发明表明，钙调节剂非选择性钙通道阻滞剂贝尼地平、选择性L型钙通道阻滞剂硝苯地平及钙离子螯合剂EDTA均能增强FLC与D0X/MIN0合用的联合抗真菌作用。BEN浓度为8 μ g/ml时，NIF浓度为8 μ g/ml，EDTA浓度为O. 5mM时对上述联合用药组合均有明显的联合抗真菌作用。其中，BEN的加入，可使FLC与DOX联用时的浓度分别从4μ g/ml、16 μ g/ml降为2 μ g/ml、4 μ g/ml ;I丐离子螯合齐Li EDTA的加入,可使其降为I μ g/ml、4 μ g/ml, NIF的加入可使其降到I μ g/ml,4 μ g/ml。另外，BEN可使FLC与MINO的浓度从2 μ g/ml、16 μ g/ml 降为 I μ g/ml>8 μ g/ml ；EDTA 可使联合用药的 MIC 降为 O. 5 μ g/ml>4 μ g/ml ；NIF 可使其降到 I μ g/ml、8 μ g/ml。3.本发明表明，破坏细胞内钙平衡可能是联合抗真菌作用的机制，为新药的开发及老药新用提供可能的研究方向。4.四环素及钙离子通道阻滞剂在临床上广泛应用，其对FLC抗真菌的增效作用，可扩大其应用范围，并且降低FLC的最低有效浓度，降低抗真菌药物的用药量，从而降低药物的不良反应的发生。
图I :钙调节剂贝尼地平(BEN)，硝苯地平(NIF)，钙螯合剂EDTA对氟康唑(FLC)及多西环素(DOX)抗白色念珠菌(CA10、CA137、CA8、CA14)作用的影响(48h生长结果)。菌株的分布如示意图。 图2 :钙调节剂贝尼地平(BEN)，硝苯地平(NIF)，钙螯合剂EDTA对氟康唑(FLC)及米诺环素(MINO)抗白色念珠菌(CA10、CA137、CA8、CA14)作用的影响(48h生长结果)。菌株的分布如示意图。图3 :生长率差值法(ΛΕ法)评价非选择性钙离子通道阻滞剂贝尼地平(BEN)对氟康唑(FLC)与四环素类药物(TC)联合用药的增效作用。纵坐标表示BEN对两药合用的生长率差值，横坐标表示不同的四环素类药物与氟康唑联合。(FT :氟康唑与四环素类药物合用；FLC+MINO :氟康唑与米诺环素合用；FLC+DOX :氟康唑与多西环素合用)。图4 :生长率差值法(Λ E法)评价选择性钙离子通道阻滞剂硝苯地平(NIF)对对氟康唑(FLC)与四环素类药物(TC)联合用药的增效作用。纵坐标表示NIF对两药合用的生长率差值，横坐标表示不同的四环素类药物与氟康唑联合。(FT :氟康唑与四环素类药物合用；FLC+MIN0 :氟康唑与米诺环素合用；FLC+D0X :氟康唑与多西环素合用)。图5 :生长率差值法(ΛΕ法)评价钙离子螯合剂EDTA对对氟康唑(FLC)与四环素类药物(TC)联合用药的增效作用。纵坐标表示EDTA对两药合用的生长率差值，横坐标表 示不同的四环素类药物与氟康唑联合。(FT:氟康唑与四环素类药物合用；FLC+MIN0:氟康唑与米诺环素合用；FLC+D0X:氟康唑与多西环素合用)。
图6 :四株不同敏感程度的白色念珠菌接种顺序图。
具体实施例方式下面通过具体实例对本发明进行进一步的阐述，应该说明的是，下述说明仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。实施例IFLC与D0X/MIN0联合抗真菌作用测定I.材料I. I药品与试剂氟康唑(fluconazole, FLC),山东诚创医药科技发展有限公司；米诺环素(minocycline，ΜΙΝ0)，盐酸米诺环素，山东磐信生物科技有限公司；多西环素(Doxycycline, D0X),山东省药物鉴定所；科玛嘉念珠菌显色培养基，郑州博赛生物工程有限公司；TTC-沙保罗琼脂，杭州天和微生物试剂有限公司；氢氧化钠，国营山东单县有机化工厂,批号940420 ；磷酸二氢钾，上海新宝精细化工厂，批号200602132。二甲基亚砜(DMSO)，中国尧舜进出口有限公司，批号031012 ;RPMI 1640原料药粉，美国GIBCO公司；3- (N-吗啉代)丙磺酸(MOPS)，济南朋远生物技术有限公司；甲萘醌(Menadione),美国Sigma 公司；XTT ( 二甲氧唑黄)，南京旋光科技有限公司；乳酸林格氏液(复方氯化钠溶液)，山东鲁抗辰欣药业有限公司；丙酮，上海振兴化工一厂，批号200209510 ；XTT-甲萘醌溶液的配制取XTT粉末0. 0500g，溶解于IOOml已灭菌的林格氏液配成0. 5mg/ml的溶液,用0. 22 μ m滤膜滤过灭菌；加入10 μ I的10mmol/L的甲萘醌丙酮溶液(取甲萘醌0.0860g溶解于5ml丙酮)，使其终浓度为lymol/L，摇匀，2°C 8°C避光保存。药物溶液氟康唑用无菌蒸懼水溶解，配成2560 μ g/ml的储备液,过滤分装；磷霉素用无菌水，其他药物用二甲基亚砜溶解，分别配成6400 μ g/ml的储备液，分装。所有药液于-20°C冰箱保存，备用。
PBS :根据中国药典2005版二部量取O. 2mol/L磷酸二氢钾50ml，O. 2mol/L氢氧化钠，35ml溶于200ml双蒸水中即得到PH 7. 2的PBS缓冲溶液。121°C高温高压湿热灭菌20min,冷却备用。
RPMI 1640液体培养液取RPMI 1640 (含L-谷氨酰胺，不含碳酸氢钠)粉末2. 08g，加入10%葡萄糖溶液40ml (含糖终浓度2% )及MOPS粉6. 906g，加蒸馏水至约为200ml，混合均匀后在22°C用lmol/L的NaOH溶液调pH约为7. 0±0. 1，临用前用O. 22 μ m混合纤维膜过滤灭菌。I. 2 仪器
AB204-N电子天平梅特勒-托利(上海)公司
SVE-4A1超净工作台新加坡ESCO公司
INCUCELL 55恒温培养箱德国MMM公司
VENTICELL 55干热灭菌箱德国MMM公司
HS-9041尚温尚压灭囷器韩国HANSHIN公司
不锈钢过滤器(2000ml)江苏天和仪器厂
96孔培养板美国COSTAR公司
可调式移液器Thermo Electron (上海)公司
SC-329常温冰箱中国海尔公司
-20 0C低温冰柜中国海尔公司
G-560E涡旋混合器美国Si公司
Multiscan MK3 酶标仪美国 Thermo Iabsystems 公司I. 3实验菌株质控菌株白念珠菌ATCC10231，山东大学药理教研室惠赠；实验菌株省立医院、千佛山医院临床分离的白色念珠菌；菌株鉴定实验用菌株在科玛嘉念珠菌显色培养基35°C下培养48小时，菌落呈绿色或翠绿色的所有菌株再经山东省疾病预防控制中心微生物研究室以标准微生物学方法鉴定为白色念珠菌。菌液制备-20°C下保存的白色念珠菌室温下解冻，接种到TTC-沙保罗琼脂培养基上，35°C培养24 48h，取发育良好的单一菌落再次接种，35 °C培养24h，以保证菌株处于生长期。选取若干单个较大菌落，PBS配制成菌悬液，经涡旋器振荡均匀后以中国细菌浊度标准管比浊，调整样品管与标准管浊度一致，此时白色念珠菌的菌浓度约为4. 5X IO6CFU/ml，系列稀释即得到工作菌液，并以活菌计数进行浓度验证。2.内容与方法
2. I氟康唑与D0X/MIN0联合抗白色念珠菌作用测定根据CLSI M27-A2方案的棋盘法，以RPMI-1640液体培养基稀释药液使其成为4倍工作浓度，筛选DOX和MINO与FLC浓度应用范围，即DOX和MINO的终浓度分别为32
O.5 μ g/ml和64 I μ g/ml, FLC为512 O. 5 μ g/ml。按浓度从高到低的顺序吸取唑类药液50 μ 1，分别加入96孔平板的第12 2列，按浓度从高到低的顺序吸取米诺环素等药液50 μ I，分别加入96孔平板的第A G行，除Α12外各孔再分别加100 μ I菌液，其余不足200 μ I的孔用RPMI-1640培养液补 足。其中Hl为生长对照，只含菌液不含药物，Α12为空白对照，只含药液不含菌液。将96孔平板置35°C恒温培养箱中培养48h后，用XTT负载后以酶标仪测定并记录结果。所有实验重复三次。2. 2评价方法与结果判定Loewe additivity (LA)理论的基本思想认为药物不可能和它本身发生相互作用，因此将药物单用或联用产生相同药效的浓度(等效位点)进行比较。其分析方法分数抑菌浓度指数法(fractional inhibitory concentration index, FICI)，表述如下Σ FIC = FICa+FICb = CA/MICA+CB/MICBMICa和MICb分别是药物A和B单用时的最小抑菌浓度，Ca与Cb为两药联用时达到相同药效时各自的浓度。FICI > 4为拮抗作用，FICI在O. 5与4之间为相加或无关作用，FICI ( O. 5定义为协同作用。3.结果3. I氟康唑与抗菌药物的联合抗真菌作用结果3. I. I氟康唑与抗菌药物联合的最低有效菌浓度各孔中真菌生长百分数的计算方法为真菌生长百分数=(各孔OD值-空白对照孔OD值)/生长对照孔OD值按上述公式计算平板中各孔真菌生长百分数，取能够抑制真菌生长80%的最低联用药物浓度为判读终点，如果真菌生长率不恰好等于20 %，取与之最接近的药物联合孔为判读终点。FLC与D0X/MIN0的联合抗真菌作用，对敏感株来说不明显，多为无关，而对耐药株，则呈现强协同作用。其中耐药株CAlO平板中的生长百分数实验结果如表I所示。表.I.用棋盘表示FLC与D0X/MIN0的联合用药抗白色念珠菌CAltl生长百分率(以FICI法换算的药物最佳作用组合用灰色标出)。
权利要求
1.四环素类药物多西环素或米诺环素联合应用氟康唑在制备抗真菌产品中的应用。
2.如权利要求I所述的应用，其特征是，所述真菌为白色念珠菌。
3.如权利要求I所述的应用，其特征是，联合应用时多西环素与氟康唑的最低抑菌浓度为16 V- g/ml与4 ii g/ml ;米诺环素与氟康唑的最低抑菌浓度为16 u g/ml与2 y g/ml。
4.如权利要求I所述的应用，其特征是，还加入贝尼地平、硝苯地平或金属离子螯合剂EDTA。
5.如权利要求4所述的应用，其特征是，当加入贝尼地平、硝苯地平或金属离子螯合剂EDTA后，其浓度配比为 贝尼地平多西环素氟康唑=8:4:2 ( u g/ml)； 贝尼地平米诺环素氟康唑=8:16:1 ( V- g/ml)； 硝苯地平多西环素氟康唑=8:4:1 ( u g/ml)； 硝苯地平米诺环素氟康唑=8:8:1 (u g/ml)； EDTA:多西环素:氟康唑=O. 5mM: 4 u g/ml: I u g/ml ； EDTA:米诺环素:氟康唑=0. 5mM:4 u g/ml :0. 5 u g/ml。
6.如权利要求4所述的应用，其特征是，当多西环素与氟康唑浓度为16y g/ml与4 V- g/ml或者米诺环素与氟康唑的最低抑菌浓度为16 ii g/ml与2 ii g/ml时,加入的最低I丐调节剂的有效浓度贝尼地平为4 u g/ml、硝苯地平为8 u g/ml或EDTA为0. 25mM。
7.ー种抗真菌产品，其特征为含有权利要求1-6中任一项所述组份或含量。
全文摘要
本发明公开了一种四环素类药物联合应用氟康唑在制备抗真菌产品中的应用及其产品，氟康唑与四环素类抗菌药物多西环素、米诺环素联合应用可以产生协同抗真菌作用，以及三种细胞钙调节剂非选择性钙通道阻滞剂贝尼地平、选择性L型钙通道阻滞剂硝苯地平及钙离子螯合剂乙二胺四乙酸(EDTA)对氟康唑及上述两种用药组合的增效作用及其在抗白色念珠菌中的应用。经结果证实，FLC与DOX/MINO合用可以产生协同抗真菌作用，特别是对耐药白色念珠菌有显著的杀伤作用；BEN、NIF及EDTA均能够明显增强FLC与DOX/MINO对白色念珠菌的联合抗真菌作用，可以明显降低FLC、MINO和DOX联合用药时的最低有效浓度；并且三种钙调节剂与氟康唑联用，也能增强其抗真菌作用。
文档编号A61K31/198GK102626415SQ20121007641
公开日2012年8月8日 申请日期2012年3月21日 优先权日2012年3月21日
发明者刘萍, 孙淑娟, 高媛 申请人:山东省千佛山医院