专利名称：癌毒方在制备调控肝癌细胞TLRs／NF-κB信号转导药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及医药领域的细胞生物学、分子生物学技术，具体地说是涉及癌毒方药物的新用途，即在制备调控肝癌细胞信号转导药物中的应用。背景技术：
肝癌是严重危害人类生命健康的重 大疾病之一，是我国最常见的恶性肿瘤之一，近年来死亡率增加了 41. 17%，其发病率和死亡率还正在逐年升高。肝癌具有发现晚、发展快、治疗难、预后差等特点，被称为“癌中之王”，由于其早期症状隐匿，多数患者就诊时已属中晚期，能手术切除者甚少，即使手术切除，术后5年复发率仍高达60%以上，小肝癌复发率也高达40%-50%。西医治疗肝癌以直接对抗某一病理环节发挥作用，而许多患者或为弥漫性肝癌、或伴有腹水、肾功能不全，难以接受手术、肝动脉栓塞化疗、冷冻等治疗。以中医理论为基础治疗肝癌则是对机体整体调节，发挥多层次、多环节、多靶点的综合作用，无论是在抑制、杀伤癌细胞，调节机体免疫功能，还是改善症状、提高生存质量、延长生命上都显示出独特的优势。长期以来，中医药在治疗肝癌方面取得了一定的临床疗效，尤其以中医理论为基础形成的中药复方治疗肝癌更能充分发挥辨证论治和对机体整体调节的优势，中医药抗肝癌作用越来越得到国际社会的关注和承认，但中医药治疗肝癌存在的核心问题是其作用机理不清，尤其是对创新性理论指导下形成的名老中医抗肝癌效验方的现代机制研究还不够。我国著名中医药专家周仲瑛教授根据近六十年的临床实践，提出了“癌毒”学说，他认为癌毒是肿瘤发生发展的关键，是在肿瘤发病过程中体内产生的一种特殊的病理因素，癌毒是肿瘤患者在正虚的基础上，因体内邪盛而生毒，癌毒与痰浊、瘀血、湿浊、热毒等病理因素同时胶结存在、互为因果，亦可兼夹转化、共同为病。癌毒一旦形成，阻滞体内，则病变乖戾，一方面大量耗伤人体气血津液，一方面导致脏腑气血功能失调,诱生痰浊、瘀血、湿浊、热毒等多种病理因素，并耗气伤阴，发生各种复杂证候，表现出邪毒嚣张、难以消除、易于传变、病情笃重、病势凶险、正气虚败、预后极差等证候特点。癌毒方正是在“癌毒”理论指导下确立的中医药治疗恶性肿瘤的基本方。本方主要由白花蛇舌草、僵蚕、太子参、麦冬、山慈菇、蜈蚣、八月扎等组成，全方共奏清热化痰、祛瘀散结、消癌解毒之功效，在临床上治疗恶性肿瘤患者显示出很好的疗效。在继承名老中医经验的基础上，如何将其有效验方进一步总结与验证，是名老中医传承工作一项重要的课题。本研究以人肝癌SMMC-7721细胞株作为研究对象，探讨癌毒方的抗肝癌作用机制。近年来，随着Toll样受体(TLRs)的发现及其丰富生物学功能的进一步揭示，以及Toll样受体/核因子-KB (TLRs / NF-kB)信号通路的部分阐明，为探讨中医药抗癌机制开启了新的思路与方法。本研究以TLRs / NF-K B通路为切入点进行癌毒方抗癌机制研究。TLRs是新近发现的存在于生物机体中的一大类非常重要的模式识别受体(PRR)，可表达于多种免疫细胞及上皮细胞，机体多种免疫防御反应(包括肿瘤免疫)均需要不同TLRs的参与。根据TLRs的信号传递是否包含髓样分化因子88 (MyD88)，TLRs信号通路又分为MyD88依赖性和MyD88非依赖性两种途径，再通过一系列反应,激活核因子-K B(NF-k B)，激活的NF-κ B进入细胞核内，调控多种重要的细胞因子、粘附分子和趋化因子的表达，在机体的免疫应答、炎症反应、细胞增殖、分化及凋亡调控等方面发挥重要的作用。目前研究比较多的是TLRs / NF-κ B通路对炎症性疾病、自身免疫性疾病、肝脏疾病、哮喘、冠状动脉粥样硬化等的影响。近年来，人们发现多种肿瘤细胞表面也表达TLRs，它们可被存在于局部的配体激活，刺激肿瘤细胞分泌过量肿瘤相关蛋白及细胞因子，这些因子可刺激肿瘤细胞生长、血管和淋巴管生成、肿瘤的浸润转移、导致T细胞和NK细胞功能失调等，即肿瘤细胞表面表达的TLRs可能与肿瘤细胞生长、免疫逃逸及化疗耐药相关。如在人类部分黑色素瘤细胞中，透明质烷碎片能够通过TLR4诱导产生细胞因子和MMP，这些物质恰能促进肿瘤生长，而产生的MMP又能溶解细胞间质产生透明质烷，这种正反馈调节形成恶性循环，加速肿瘤恶化；Kelly等研究发现卵巢癌能通过TLR4-MyD88通路激活NF-κ B，诱导致炎细胞因子产生，促进肿瘤生长，同时在试验中还发现卵巢癌可能通过TLR4-MyD88-NF- κ B通路抵抗抗肿瘤药物紫杉醇诱导的凋亡。 研究表明，TLRs / NF-KB通路有双重作用，既可能通过增强宿主免疫功能而发挥抗肿瘤作用，又可能起保护肿瘤细胞，逃脱免疫监视的作用。一些研究发现中药可通过影响免疫细胞中TLRs / NF-κ B通路而发挥抗肿瘤作用，而中药直接对肿瘤细胞此通路影响的研究，目前国内外未见报导。
发明内容
本发明的目的在于提供癌毒方在制备调控肝癌细胞信号转导药物中的应用。本发明是以人肝癌SMMC-7721细胞株为材料，观察癌毒方的抗肝癌作用机制，本研究以TLRs / NF-κ B通路作为新靶点，从细胞因子表达的源头TLRs入手，观察癌毒方对肝癌模型鼠细胞TLRs/NF- κ B通路关键环节TLR4、NF- κ B、髓样分化因子88 (MyD88)的影响探讨抗癌作用机制。具体实验如下
I材料与方法 含药血清制备
将家兔分为中药组和对照组，每组3只。中药组分别以低、中、高剂量消癌解毒中药灌胃，对照组以生理盐水灌胃，各组每日I次连续3d，于最后一次灌胃后2h无菌取血，离心分离血清，用O. 2um微孔滤膜抽滤灭菌，经56°C、30 min灭活以去除血清中补体，为含药血清，置-20°C保存备用。细胞培养及分组
人SMMC-7721肝癌细胞株在含10%新生小牛血清的DMEM/High培养液中，37°C，5% 二氧化碳的孵箱中培养，隔天换培养液，细胞复苏时每天换一次培养液，细胞生长满单层细胞瓶后，以O. 25%胰蛋白酶消化传代I 2min后，待倒置显微镜下细胞圆缩时，加入含10%新生小牛血清的DMEM/High培养液终止消化，以弯头滴管轻轻吹下贴壁生长细胞，吹打均匀后分至新细胞培养瓶，加培养液，放入37°C，5% 二氧化碳的孵箱中培养；分为空白对照组、空白血清+激动剂组、空白+阻断剂组、低浓度含药血清组、低+激动剂组、低+阻断剂组、中浓度含药血清组、中+激动剂组、中+阻断剂组、高浓度含药血清组、高+激动剂组、高+阻断剂组12组。法观测
MTT筛选药物浓度的预实验将LPS终浓度设定为2. 5ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、40ng/ml 五个浓度梯度，0)284 终浓度设定为 O. 25ug/ml、0. 5ug/ml、lug/ml、2ug/ml、4ug/ml五个浓度梯度，分别于第12、24、48、72h进行四甲基偶氮噻唑蓝(MTT)实验，计算增殖率。在无菌条件下，将细胞培养瓶中贴壁生长满的人SMMC-7721肝癌细胞株以O. 25%胰蛋白酶消化，加入含10%新生小牛血清的DMEM/High培养液终止消化，以弯头滴管轻轻吹下贴壁生长细胞，吹打成均匀的单细胞悬液，将细胞浓度调整为lX104/ml，接种于96孔培养板，阴性空白对照组每孔加入180ul细胞悬液+20ul过滤纯水，实验组中LPS及⑶284组加入不同 浓度的药物(终浓度扩大10倍之浓度)，每组每种浓度设6个复孔，加药后分别培养12、24、48、72h，之后，加入20ul/孔浓度为5mg/ml的MTT，培养4h，弃去上清液，每孔加入150ul的DMSO,轻轻震荡约IOmin使其完全溶解，酶标仪检测490nm波长处的OD值，计算抑制率，细胞生长抑制率(IR) = (1_用药组OD/对照组OD) X 100%，本实验重复四次。初步确定LPS终浓度40ng/ml，⑶284终浓度4ug/ml作用24h时细胞增殖抑制率测定并经统计学处理有显著差异(P〈0. 05)。正式MTT实验分为激动剂组和阻断剂组，每组分别设阴性空白对照组，在无菌条件下，将细胞培养瓶中贴壁生长满的人SMMC-7721肝癌细胞株以O. 25%胰蛋白酶消化，加入含10%新生小牛血清的DMEM/High培养液终止消化，以弯头滴管轻轻吹下贴壁生长细胞，吹打成均匀的单细胞悬液，分装至IOml尖底离心管，离心1000转X6min，弃上清液后加入单培，将细胞浓度调整为IX 104/ml，接种于96孔培养板，阴性空白对照组及低、中、高浓度含药血清组每孔加入160ul细胞悬液+20ul PBS+20ul空白、低、中、高浓度含药血清，实验组中LPS及⑶284组加入不同浓度的药物(终浓度扩大10倍之浓度)160ul细胞悬液+20ulLPS或⑶284+20ul空白、低、中、高浓度含药血清，每组每种浓度设6个复孔，加药后分别培养24h，之后酶标仪检测490nm波长处的OD值，计算抑制率，细胞生长抑制率(IR)=(I-用药组OD/对照组OD) X 100%,本实验重复三次。法检测癌毒方对TLR4、MyD88及NF- κ B蛋白表达的影响
蛋白免疫印迹杂交(Western Blot、WB)是将蛋白样本通过聚丙烯酰胺电泳按分子量大小分离，再转移到杂交膜(blot)上，然后通过一抗/ 二抗复合物对靶蛋白进行特异性检测的方法。其中的步骤包括蛋白样本提取制备，蛋白定量，电泳，转膜与显色。依据MTT筛选药物浓度的预实验、正式试验及流式细胞术(单、双染)，取LPS终浓度40ng/ml，CD284终浓度4ug/ml及最佳药物作用时间为24h，制定WB方案为阴性空白对照组、空白血清+激动剂组、空白+阻断剂组、低+激动剂组、中+激动剂组、中+阻断剂组、高+激动剂组、高+阻断剂组8组。经过蛋白样本提取制备，Western Blotting,①SDS-PAG的制备,②样本准备和上样电泳，将样本用裂解缓冲液稀释相同浓度，取等量上样缓冲液于试管中，蛋白量为70ug，并于95-100°C 5min后冰上冷却上样。电泳条件浓缩胶恒压60V约20min，分离胶80V约80min。③湿电转移，转膜准备取出凝胶，置于转移缓冲液中平衡15min。准备滤纸及NC膜，分别置入转移缓冲液及去离子水中。湿电转移平放底部电极(阳极)，在上面分别放置滤纸、NC膜、凝胶和滤纸，排除各层气泡后将上方电极(阴极)放于夹层物上。按恒流200mA通电，电转移lh。④封闭，NC膜在5%脱脂奶粉封闭液中封闭(室温，2h)，弃去封闭液，不洗。⑤抗体与靶蛋白结合，按约O. lml/cm2的量加入封闭液和适量一抗NFKB-P65 (1:1000), TLR2/TLR4/TRAF6 (1:500) 摇床摇荡孵育(4°C，过夜)。PBST 漂洗滤膜4次，每次lOmin。将膜与HRP结合的二抗(辣根过氧化酶标记羊抗兔，二抗用封闭液稀释)(1:5000)室温下摇荡孵育2h，然后用PBST充分洗膜，漂洗4次，每次lOmin。⑥显影和图像分析，按O. lml/cm2显影液计算用量，将显影液加于NC膜上，室温放置lmin。用保鲜膜将膜包好(尽量避免气泡)。暗室中迅速将膜蛋白贴在X光胶片上曝光，洗片机中显影、洗像。调整曝光时间，直至出现最佳条带。统计学方法
实验数据以 ±s表示，采用SPSSI7. O统计软件，根据方差齐性采用单因素方差分析和q检验比较各组间差异，以P〈0. 05或P〈0. 01为差异有统计学意义。结果
在信号通路阻断剂、激动剂存在的情况下，观察癌毒方对人肝癌细胞株SMMC-7721的抑制作用如表1、2所示
表I MTT结果(I)
权利要求
1.癌毒方在制备调控肝癌细胞TLRs / NF-K B信号转导药物中的应用。
全文摘要
本发明涉及癌毒方制药中调控肝癌细胞信号转导通路的用途。癌毒方依据国医大师周仲瑛教授癌毒理论，由蛇舌草3-20g；僵蚕3-10g；蜈蚣1-3条；八月扎3-12g；太子参3-15g；麦冬3-12g；山慈菇3-10g制成，全方以驱邪消癌解毒为主，辅以扶正，经临床应用，显示出较好的抗肿瘤疗效。本发明以人肝癌细胞株SMMC-7721为材料，观察该方体外抗癌作用，结果表明:癌毒方具有良好的抑制人肝癌细胞SMMC-7721增殖的作用，该方与TLRs/NF-KB信号转导通路的阻断剂CD284有协同作用，能阻断TLR4表达，抑制下游NF-кB蛋白表达，促进肿瘤细胞凋亡。
文档编号A61P35/00GK102652802SQ20121011401
公开日2012年9月5日 申请日期2012年4月18日 优先权日2012年4月18日
发明者吴勉华, 周红光, 李栋, 王明艳, 程海波, 陈海彬 申请人:南京中医药大学