专利名称：基于人tlr9受体功能区片段lrr11的新型多肽及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种新型多肽及其应用，具体地说，涉及一种基于人TLR9受体功能区片段LRRll的新型多肽及其应用。
背景技术：
炎症是由大量炎性细胞产生的介质参与的复杂现象，其中值得注意的是细胞因子的作用。细胞因子是由机体的免疫细胞及非免疫细胞合成和分泌的小分子多肽类因子，它既是机体应激反应的需要，又是应激组织损伤发生和发展的病理基础。由单核/吞曬细胞分泌的细胞因子包括肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor, TNF)、白细胞介素(interleukin，IL)等，广泛参与多种炎症反应过程，如细菌性感染因素引起的脓毒症(Sepsis)和自身免疫缺陷引起的类风湿关节炎(rheumatoid arthritis, RA)。脓毒症(s印sis)是由感染因素引起的全身炎症反应综合症(Systemicinflammatory response sydrome, SIRS),病死率高达50%-60%,至今尚无有效治疗药物。大量研究表明，细菌菌体上或菌体内的病原分子通过被机体免疫细胞，尤其是单核/吞噬细胞系统相关模式识别受体识别，激活单核/吞噬细胞系统大量释放TNF- α、IL-I、IL_6和IL-12等多种炎性细胞因子，导致脓毒症的发生。类风湿关节炎(rheumatoid arthritis, RA)是一种常见的以关节病变为主自身免疫性疾病，临床表现为关节疼痛肿胀、功能下降，致残率高达40%以上。RA的发病机制与多种因素有关，细菌或病毒的感染可能是诱发类风湿关节炎的首要因素，机体免疫机制尤其是细胞免疫在类风湿性关节炎发病机制起着突出作用，在炎症部位的关节积液和滑膜组织中，可检测到大量T淋巴细胞和单核/吞噬细胞产生的多种细胞因子，如TNF-α、IL-UIL-2、IL-4、IL-5IL-6、IL-8、IFN等。大量研究表明，TNF-α是RA免疫反应及病理过程中的关键因子。RA病人TNF-α水平明显高于正常对照，与疾病的活动期呈正相关，同时TNF-α水平也可在病变关节滑膜液中升高。体外实验证明TNF-α在免疫级联反应中通过促进IL-I和其他细胞因子分泌，以及刺激免疫细胞活化，最终导致关节软骨和骨质的破坏。综上所述，脓毒症和类风湿关节炎发病机制中TNF-α等炎性细胞因子发挥了重要作用，因此寻找能够特异抑制TNF-α等释放的药物，对于防治脓毒症和类风湿关节炎具有重要意义。细菌菌体上或菌体内的病原分子主要包括内毒素(lipopolysacchride, LPS)、肽聚糖(peptidoglycan, PG)、细菌 DNA(CpG DNA)等,识别 LPS、PG、CpG DNA 等病原分子的模式识别受体是Toll样受体(Toll-like rec印tors，TLRs)。目前认为，CpG DNA在革兰阳性菌或革兰阴性菌所引起的感染和炎症反应中均起着重要作用，而TLR9是CpG DNA的模式识别受体。TLR9为I型跨膜受体，由胞外区、跨膜区和胞内区组成，胞外区结构域有25个富含亮氨酸的重复序列(leucine-rich repeats, LRRs),与识别CpG DNA有关，目前发现,其中最有可能的与CpG DNA结合有关的关键位点的是LRR2、LRR5、LRR8和LRRlI。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于人TLR9受体功能区片段LRRll的新型多肽(LRMs)，其具有抑制CpG DNA刺激小鼠腹腔巨噬细胞释放TNF-α的作用，可以降低CpG DNA攻击小鼠的血清TNF- α浓度，提高被攻击小鼠生存率。本发明提供的基于人TLR9受体功能区片段LRRll的新型多肽(LRMs)，其具有抑制TNF-α等细胞因子释放的作用，可以缓解RA模型大鼠关节病变症状，提高大鼠生存质量。为实现本发明的目的，本发明提供的基于人TLR9受体功能区片段LRRll及基于LRRl I的新型突变多肽(LRMs)，具有LRRl I及SEQ ID NO 1-10所示氨基酸序列中的至少一种QLRKLNLSFNYQKRVSFAHLSLAPSFGSLV ；LRRl I
QLSKLNLSFNYQKRVSFAHLSLAPSFGSLV !LRM1QLRNLNLSFNYQKRVSFAHLSLAPSFGSLV ；LRM2QLRKLNLSFNYQNRVSFAHLSLAPSFGSLV ；LRM3QLRKLNLSFNYQKSVSFAHLSLAPSFGSLV ；LRM4QLRKLNLSFNYQKRVSFAQLSLAPSFGSLV ；LRM5QLDKLNLSFNYQKRVSFAHLSLAPSFGSLV ；LRM6QLRELNLSFNYQKRVSFAHLSLAPSFGSLV ；LRM7QLRKLNLSFNYQERVSFAHLSLAPSFGSLV ；LRM8QLRKLNLSFNYQKDVSFAHLSLAPSFGSLV ；LRM9QLRKLNLSFNYQKRVSFADLSLAPSFGSLV ； LRM10基于人TLR9受体功能区片段LRRl I的新型多肽，多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。本发明所述的基于人TLR9受体功能区片段LRRll及基于LRRll的新型突变多肽(LRMs)具有抑制CpG DNA刺激小鼠腹腔巨噬细胞释放TNF-α的作用，可以降低CpG DNA攻击小鼠的血清TNF- α浓度，提高被攻击小鼠生存率，其可用于制备防治细菌脓毒症药物。所述药物优选为注射剂。本发明所述的一种基于人TLR9受体功能区片段LRRll及基于LRRll的新型突变多肽(LRMs)还具有缓解类风湿关节炎大鼠关节病变症状的作用，其可用于制备防治类风湿关节炎药物。所述药物优选为注射剂，所述注射剂可以经肌肉、静脉、皮下注射或关节腔内局部注射给药。为让本发明的上述和其它目的、特征和优点能更明显易懂，下文特举较佳实施例，并配合附图，作详细说明如下。
图I表示LRR多肽(200 μ Μ)与CpG DNA 2006的结合能力测定；图2 表示 LRR 多肽(O. 15 μ Μ、0· 45 μ MU. 5 μ M)对 CpG DNA (I. 5 μ Μ)刺激小鼠腹腔巨噬细胞释放TNF- α的影响，*ρ < O. 05，**ρ < O. OlvsCpG DNA组。
具体实施方式
下面实施例为进一步描述本发明，但所述实施例仅用于说明本发明而不是限制本发明。为了获得基于人TLR9受体功能区片段LRRll及基于LRRll的新型突变多肽(LRMs)，发明人从人TLR9受体功能区的结构入手进行。人TLR9受体为I型跨膜受体，由1032个氨基酸残基组成，分为胞外区(aa I 818)、跨膜区(aa 819 839)和胞内区(aa 840 1032)。其中，胞外区由信号肽(aa I 25)和25个富含亮氨酸的重复序列(leucine-rich repeats, LRRs, aa 26 818)组成，与识别、结合配体有关；胞内区则含有TIR同源区(Toll/IL-lrec印tor domain, TIR)，TIR能够招募衔接蛋白MyD88及其它含有TIR结构域的衔接蛋白，激活MyD88依赖的信号转导通路，最终活化核转录因子NF K B和AP-I，导致细胞因子的大量释放，这也是脓毒症产生的分子机制。 对人TLR9受体一级结构的分析表明，TLR9胞外段含有25个LRRs ;空间构象分析表明TLR9胞外段25个LRRs形成一个马蹄形弯曲的螺线管结构，内径约5nm，外径约8nm，形成较大的空间。其中LRR2、LRR5、LRR8、LRRll后跟随的氨基酸序列在TLR9胞外段马蹄形凹面形成环状结构，推测可能与TLR9结合CpG DNA有关。理论上说，如果有药物可以干扰CpG DNA与TLR9结合位点的结合，将能够抑制CpG DNA介导的信号转导，抑制炎症因子释放，治疗细菌脓毒症。发明人合成了 LRR2、LRR5、LRR8、LRRll的多肽，利用生物传感器技术分别与CpGDNA 2006(5' -TCG TCG TTA AGT CGT TAAGTC GTT-3')进行了亲和力测定，结果显示LRRll与CpG DNA结合能力最高，亲和峰值达4000arc second(角秒或者弧度/秒)，Kd值为 13. 2 μ M ;LRR2、LRR5 与 CpG DNA 亲合力相对较低，约在 500arc second ；LRR8 与 CpG DNA几无结合能力。我们初步认为LRRll最有可能是CpG DNA的结合位点，并进行了一系列功能实验。首先，发明人发现LRRll多肽量效依赖性抑制CpG DNA刺激小鼠腹腔巨噬细胞释放TNF-α。LRRll多肽与CpG DNA (I. 5 μ μ M)按摩尔浓度比分别为0. I 1,0. 3 I和I I混合后，在摩尔比为0. I I时，LRRll多肽(0. 15μ μΜ)对CpG DNA刺激小鼠腹腔巨噬细胞释放TNF-α无抑制作用；在摩尔比为0.3 I和I : I时，LRRll多肽对CpG DNA刺激小鼠腹腔巨噬细胞释放TNF-α有显著抑制作用，并且具有明显的量效依赖性。在体外实验的基础上，发明人发现LRRll多肽可降低CpG DNA攻击小鼠动物死亡率，并降低血清TNF-α水平。小鼠先腹腔注射D-氨基半乳糖溶液(600mg/kg)进行敏化，Ih后取出小鼠，先尾静脉注射CpG DNA(4mg/kg)，然后立即尾静脉注射LRRll (3mg/kg)，于尾静脉注射4h后小鼠眼眶静脉丛取血，测定TNF-α释放水平。生存率实验为给药完毕后给予正常饮食和饮水，观察3天内小鼠一般情况及死亡率。结果显示，LRRll可明显降低CpGDNA攻击小鼠动物死亡率，并可明显降低血清TNF- α水平。发明人进一步发现LRRll多肽可降低热灭活大肠杆菌(含有天然CpG DNA)攻击小鼠动物死亡率，并降低血清TNF-α水平。先尾静脉注射热灭活大肠杆菌，然后立即尾静脉注射LRR11，于尾静脉注射4h后小鼠眼眶静脉丛取血，测定TNF-a释放水平。生存率实验为给药完毕后给予正常饮食和饮水，观察3天内小鼠一般情况及死亡率。结果显示，LRRll可明显降低热灭活大肠杆菌攻击小鼠动物死亡率，并可一定程度降低血清TNF-a水平。
发明人还发现LRRll多肽可明显减轻II型胶原皮内注射诱导形成的RA模型大鼠踝关节肿胀程度，对RA模型大鼠具有一定的保护作用。在上述工作基础上，发明人拟采用生物信息学技术和定点突变技术对LRRll多肽进行结构改造，以获得作用更强的LRRll新型多肽。结合国内外文献和生物信息学分析，发明人推测LRRll多肽序列中含有的5个碱性氨基酸最可能与TLR9结合CpG DNA结构域功能相关。将其中一个位点突变后并人工合成了突变多肽LRM1 (多肽序列为QLSKLNLSFNYQKRVSFAHLSLAPSFGSLV)，功能实验表明LRM1具有较LRRlI更强的抑制CpG DNA刺激小鼠腹腔巨噬细胞释放TNF-α的作用，体内实验结果也表明LRmi较LRRll对CpG DNA攻击小鼠的保护作用更强。该结果初步证实了研究人员的推测，即上述几个碱性氨基酸位点与其功能密切相关。筛选基于上述几个碱性氨基酸位点的一系列LRRll突变体(LRMs)，可以获得具有抑制CpG DNA刺激小鼠腹腔巨噬细胞释放TNF-α作用的新型多肽序列。发明人经过筛选，获得了 LRRll及10条基于人TLR9受体功能区片段的新型多肽(LRMs)，其氨基酸序列如下QLRKLNLSFNYQKRVSFAHLSLAPSFGSLV ；QLSKLNLSFNYQKRVSFAHLSLAPSFGSLV ；QLRNLNLSFNYQKRVSFAHLSLAPSFGSLV ；QLRKLNLSFNYQNRVSFAHLSLAPSFGSLV ；QLRKLNLSFNYQKSVSFAHLSLAPSFGSLV ；QLRKLNLSFNYQKRVSFAQLSLAPSFGSLV ；QLDKLNLSFNYQKRVSFAHLSLAPSFGSLV ；QLRELNLSFNYQKRVSFAHLSLAPSFGSLV ；QLRKLNLSFNYQERVSFAHLSLAPSFGSLV ；QLRKLNLSFNYQKDVSFAHLSLAPSFGSLV ；QLRKLNLSFNYQKRVSFADLSLAPSFGSLV。本发明所述的基于人TLR9受体功能区片段的新型多肽可采用本领域常规方法合成，比如固相Fmoc法(具体请参照实施例2)。实施例I通过生物信息学技术和基因定点突变技术，获取基于人TLR9受体功能区片段的新型多肽基因序列及其编码的氨基酸序列I、从 Genbank 数据库中获取人 TLR9 受体(Toll-like receptor 9,简称 TLR9)基因序列(Genbank Accession Number NM_017442)。2、采用生物信息学技术结合文献分析，从人TLR9受体胞外段中获得4条LRR序列(leucine-rich repeats)，分别为 LRR2 (SLRHLNLKWNCPPVGLSPMHFPCHMTIEPSTFLAVP)、LRR5(ALRFLFMDGNCYYKNPCRQALEVAPGALLGLG)、LRR8 (ALRVLDVGGNCRRCDHAPNPCMECPRHFPQ LHPDTFSHLS)、LRRll (QLRKLNLSFNYQKRVSFAHLSLAPSFGSLV)，这 4 条 LRR 序列后跟随的氨基酸序列在TLR9胞外段马蹄形凹面形成环状结构，推测可能与TLR9结合CpG DNA有关。3、人工合成了 LRR2、LRR5、LRR8、LRRll多肽。生物传感器的生物素样品池上CpGDNA 2006(5' -TCG TCG TTA AGT CGT TAAGTC GTT-3')的包被按照 Thermo 公司样品池包被流程进行。应用生物传感器技术检测LRR2、LRR5、LRR8、LRRll多肽与CpG DNA的结合能力。结果显示LRRll与CpG DNA结合能力最高，亲和峰值达4000arc second，Kd值为13. 2 μ M ;LRR2、LRR5 与 CpG DNA 亲合力相对较低，约在 500arc second ；LRR8 与 CpG DNA 几无结合能力(图I)。4、采用小鼠肿瘤坏死因子α (TNF-α )ELISA检测试剂盒ELISA法测定LRR2、LRR5、LRR8、LRRll多肽对CpG DNA刺激小鼠腹腔巨噬细胞释放TNF-α的影响。LRR多肽与CpGDNA (I. 5 μ Μ)按摩尔浓度比分别为O. I 1,0. 3 I和I : I混合后，在摩尔比为O. I I时，LRR多肽(O. 15 μ Μ)对CpG DNA刺激小鼠腹腔巨噬细胞释放TNF-α无抑制作用(ρ >O. 05);在摩尔比为O. 3 I和I : I时，LRR2多肽对CpG DNA刺激小鼠腹腔巨噬细胞释放TNF-α有显著抑制作用(ρ < O. 05)，LRRll多肽抑制作用更为显著(P < O. 01)，而LRR5、LRR8多肽则无抑制作用。结果说明LRR5和LRR8多肽 在各个浓度对CpGDNA刺激小鼠腹腔巨噬细胞释放TNF-α均无抑制作用，LRR2和LRRll多肽均能显著抑制CpG DNA刺激小鼠腹腔巨噬细胞释放TNF- α，呈量效关系(图2)。5、采用CpG DNA攻击小鼠模型观察LRRll多肽对小鼠的保护作用。小鼠先腹腔注射D-氨基半乳糖溶液(600mg/kg)进行敏化，Ih后取出小鼠，先尾静脉注射CpG DNA(4mg/kg))，然后立即尾静脉注射LRRll (3mg/kg)，对照组给予无菌生理盐水(NS)，于尾静脉注射4h后小鼠眼眶静脉丛取血，4000rpm离心5min，取上清_20°C保存，待测TNF- α释放水平。生存率实验为给药完毕后给予正常饮食和饮水，观察3天内小鼠一般情况及死亡率。结果显示，LRRll可明显降低CpG DNA攻击小鼠动物死亡率(表I),并可明显降低血清TNF-α水平(表2)。表I. LRRlI对CpG DNA攻击小鼠的保护作用
死亡率
分组总数死亡数么 _;_(/ο)NS 对照组10OO CpG DNA 10 8 80.0
LRRll+CpG DNA 10_4_40.0表2. LRRll可降低CpG DNA攻击小鼠血清TNF-· α水平
分组--
_浓度(pg/ml) 抑制率(％)_P
NS 对照组60.9±5.8—
CpG DNA136.9士11.6—
LRRl I+CpG DNA_78.6 士 6.8*_4Z6_0.0056、采用热灭活大肠杆菌攻击小鼠模型观察LRRll多肽对小鼠的保护作用。先尾静脉注射热灭活大肠杆菌，然后立即尾静脉注射LRR11，对照组给予无菌生理盐水(NS)，于尾静脉注射4h后小鼠眼眶静脉丛取血，4000rpm离心5分钟，取上清_20°C保存，待测TNF- α释放水平。生存率实验为给药完毕后给予正常饮食和饮水，观察3天内小鼠一般情况及死亡率。结果显示，LRRll可明显降低热灭活大肠杆菌攻击小鼠动物死亡率(表3)，并可一定程度降低血清TNF- α水平(表4)。表3. LRRll对热灭活大肠杆菌攻击小鼠的保护作用
权利要求
1.一种基于人TLR9受体功能区片段LRRll的新型多肽，其特征在于，多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示。
2.权利要求I所述的基于人TLR9受体功能区片段LRRll及基于LRRll的新型多肽在制备防治细菌脓毒症药物中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述药物为注射剂。
4.权利要求I所述的基于人TLR9受体功能区片段LRRll及基于LRRll的新型多肽在制备防治类风湿关节炎药物中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述药物为注射剂。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述注射剂经肌肉、静脉、皮下注射或关节腔内局部注射给药。
全文摘要
本发明涉及一种基于人TLR9受体功能区片段LRR11的新型多肽，该多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO2所示。本发明所述的基于人TLR9受体功能区片段的新型多肽(LRMs)具有抑制CpG DNA刺激小鼠腹腔巨噬细胞释放TNF-α的作用，可以降低CpG DNA攻击小鼠的血清TNF-α浓度，提高被攻击小鼠生存率，其可用于制备防治细菌脓毒症药物。本发明所述的基于人TLR9受体功能区片段LRR11及基于LRR11的新型多肽(LRMs)还具有缓解类风湿关节炎大鼠关节病变症状的作用，其可用于制备防治类风湿关节炎药物。
文档编号A61P31/04GK102643340SQ20121011835
公开日2012年8月22日 申请日期2010年6月29日 优先权日2010年6月29日
发明者丁国富, 周红, 李斌, 潘夕春, 郑江 申请人:中国人民解放军第三军医大学