Pcv2免疫原性组合物和产生这种组合物的方法

专利名称：Pcv2免疫原性组合物和产生这种组合物的方法
技术领域：
本发明一方面涉及回收2型猪圆环病毒(PCV2)的开放阅读框2(0RF2)表达的蛋白质。更具体说，所述蛋白是转染病毒表达的含有2型猪圆环病毒开放阅读框2的重组编码序列的重组蛋白。更具体说，使该转染病毒感染培养生长的细胞，并从上清液中、而非细胞内回收开放阅读框2表达的蛋白质。更具体说，该方法包括以下步骤扩增2型猪圆环病毒开放阅读框2基因，将此扩增部分克隆入第一种载体，从此第一种载体上切下开放阅读框2部分并将其克隆入转运载体，将该转运载体与病毒载体共同转染入培养生长的细胞中，使该病毒载体感染细胞，表达开放阅读框2，回收上清液中表达的开放阅读框2编码的重组蛋白。另ー方面，本发明涉及有效诱导对PCV2的免疫应答的免疫原性组合物和制备这些免疫原性组合物的方法。更具体说，本发明涉及有效保护接受该组合物的动物和减轻PCV2感染相关临床症状严重程度的免疫应答的免疫组合物。更具体说，本发明涉及对PCV2感染产生有效保护力的基于蛋白质的免疫组合物。更具体说，本发明涉及包含PCV2的0RF2的免疫组合物，其中给予PCV2-0RF2会产生抵抗PCV2感染的保护カ。最具体说，本发明涉及能在接受该免疫组合物的猪中有效产生免疫力的免疫组合物，该组合物包含PCV2的0RF2表达的蛋白质。
背景技术：
2型猪圆环病毒(PCV2)是ー种小的(直径17-22nm) 二十面体无包膜DNA病毒，它含有单链环状基因组。PCV2与I型猪圆环病毒(PCVl)的序列相同性约为80%。然而，与通常无毒性的PCVl相反，感染PCV2的猪显示出一种常见综合征，称为断奶后多系统消瘦性综合征(PMWS)。PMWS的临床特征为消痩、皮肤苍白、不健康、呼吸窘迫、腹泻、黄疸(icterus和jaundice)。在一些患病猪中，可出现所有症状的组合，而另ー些猪仅有这些症状中的一种或两种。尸检过程中，许多组织和器官也出现了微观和宏观病损，淋巴器官是最常见的病损部位。观察到PCV2核酸或抗原含量与微观淋巴病损严重性之间强烈相关。感染PCV2的猪的死亡率可达到80%。除了 PMWS以外，PCV2与几种其它感染相关，包括伪狂犬病、猪生殖和呼吸道综合征(PRRS)、Glasser病、链球菌性脑膜炎、沙门菌病、断奶后大肠杆菌病、饮食性肝机能障碍和化脓性支气管肺炎。PCV2的开放阅读框2 (0RF2)蛋白在SDS-PAGE凝胶上跑电泳时分子量约为30kDa，过去曾将该蛋白用作PCV2疫苗的抗原性组分。获得用于这种疫苗的0RF2的一般方法通常由以下步骤组成扩增编码0RF2的PCV2DNA，用0RF2DNA转染病毒载体，用含有0RF2DNA的病毒载体感染细胞，使该病毒在细胞中表达0RF2蛋白，裂解细胞提取细胞中的0RF2蛋白。在病毒载体感染细胞后，这些方法通常需要约4天。然而，这些方法的缺点是，提取步骤昂贵且耗吋。此外，从细胞回收的0RF2的量不很高；因此，需要用大量病毒载体感染大量细胞，才能获得疫苗所需足量的重组表达蛋白质等。PCV2免疫的现有方法包括基于DNA的疫苗，如美国专利6，703, 023所述。然而，这种疫苗不能有效产生抵抗PCV2感染和与其相关临床症状的保护性免疫力。因此，本领域需要一种获得0RF2蛋白的方法，该方法不需要从感染细胞内提取0RF2蛋白。还需要获得足够量的有效制备疫苗组合物的重组0RF2蛋白的方法。还需要不用现有0RF2蛋白提取方法所需的复杂的劳动密集型方法获得0RF2蛋白的方法。最后，关于组合物，本领域需要能产生抵抗PCV2感染的保护性免疫力并降低其严重性或防止其相关临床症状的免疫原性组合物。

发明内容
本发明克服了现有技术的固有问题，提供了优于现有技术水平的显著进歩。具体说，本发明一方面提供了产生和/或回收重组PCV20RF2蛋白的改进方法，即i)用含有PCV20RF2DNA编码序列的重组病毒载体感染培养的易感细胞，在细胞O中由所述重组病毒载体表达0RF2蛋白，和ii)随后回收上清液中的0RF2。出人意料地发现，如果感染和随后培育感染细胞而不用原先从细胞内提取PCV20RF2的经典PCV 20RF2回收过程，将会有大量0RF2释放入上清液中。而且，令人惊讶地发现，PCV 0RF2蛋白能强烈抵抗原先在生产细胞以外的降解。这两个发现使得能够从用含有PCV20RF2DNA和表达PCV20RF2蛋白的重组病毒载体感染的细胞培养物上清液中大量回收PCV20RF2蛋白。大量产生PCV20RF2蛋白指高于约20 μ g/mL上清,优选高于约25 μ g/mL,更优选高于约30 μ g/mL,更优选高于约40 μ g/mL,更优选高于约50 μ g/mL,更优选高于约60 μ g/mL,更优选高于约80 μ g/mL,更优选高于约100 μ g/mL,更优选高于约150 μ g/mL,最优选高于约190 μ g/mL。也可通过(例如)实施例1-3所述方法实现这些表达率。优选所述细胞培养物中的细胞计数约为O. 3-2. OXlO6个细胞/mL，更优选约为O. 35-1. 9 X IO6个细胞/mL，更优选约为O. 4-1. 8 X IO6个细胞/mL，更优选约为O. 45-1. 7 X IO6个细胞/mL，最优选约为O. 5-1. 5 X IO6个细胞/mL。可由本领域技术人员确定优选细胞。优选细胞是易被含有PCV20RF2DNA和表达PCV20RF2蛋白的合适重组病毒载体感染的细胞。细胞优选为昆虫细胞，更优选包括以商标Sf+昆虫细胞出售的昆虫细胞(Protein Sciences Corporation, Meriden, CT)。本领域技术人员也可确定合适的生长培养基，优选的生长培养基是无血清昆虫细胞培养基，如Excell 420 (JRH Biosciences, Inc. , Lenexa, KS)等。优选的、病毒载体包括杆状病韋，如 BaculoGold(BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA)，具体说，如果生产细胞是昆虫细胞。虽然优选杆状病毒表达系统，但是本领域技术人员应理解，其它表达系统也可用于本发明目的，即须使PCV20RF2表达到细胞培养物上清液中。其它表达系统可能需要采用信号序列，以使0RF2表达到培养基中。令人惊讶地发现，当用杆状病毒表达系统产生0RF2吋，不需要任何信号序列或进ー步修饰0RF2即能表达到培养基中。故认为，此种蛋白可独立地形成病毒样颗粒(Journal of General Virology,第81卷,第2281-2287页(2000)和分泌入培养物上清液中。用含有PCV20RF2DNA序列的重组病毒载体感染易感细胞时，感染复数(MOI)优选约为O. 03-1. 5，更优选约为O. 05-1. 3，更优选约为O. 09-1. 1，最优选约为O. 1-1.0。上述MOI优选指ImL细胞培养液。本文所述方法优选包括感染O. 35-1. 9 X IO6 个细胞 /mL，更优选约 O. 4-1. 8 X IO6 个细胞 /mL，更优选约 O. 45-1. 7 X IO6个细胞/mL，最优选约O. 5-1. 5X IO6个细胞/mL，含有PCV20RF2DNA和表达PCV20RF蛋白的重组病毒载体的MOI (感染复数)约为O. 03-1. 5，更优选约为O. 05-1. 3，更优选约为
O.09-1. 1，最优选约为 O. 1-1. O。然后，培养感染细胞长达10天，优选约2-10天，更优选约4-9天，最优选约5_8天。优选的培养条件包括温度约22-32°C，更优选约24-30°C，更优选约25_29°C，更优选约 26-28°C，最优选约27で。优选观察接种后Sf+细胞受到杆状病毒诱导的特征性变化。这种观察可包括在感染后期间监测细胞密度的变化趋势和活力降低。发现在感染3-5天后观察到病毒效价达到峰值，第5-8天和/或当细胞活力降低到10%以下时获得细胞向上清液中释放0RF2达到峰值。因此，本发明一方面提供了产生和/或回收重组PCV20RF2蛋白(优选以上述含量)的改进方法，即i)用重组病毒载体以上述MOI感染培养的大量易感细胞(见上)，ii)由所述重组病毒载体表达PCV20RF2蛋白，和i i i)然后在感染后5-8天和/或细胞活力降低到10%以下时收获细胞上清液中的PCV20RF2。所述重组病毒载体优选为含有PCV20RF2DNA编码序列的重组杆状病毒，所述细胞优选Sf+细胞。此外，优选在感染后期间定时监测培养细胞有无宏观和微观污染证据或非典型细胞形态改变。应弃去显示污染的任何培养物。优选细胞将表达的0RF2重组蛋白分泌入維持细胞活力的周围生长培养基中。然后，从细胞周围的上清液中而非细胞本身回收0RF2。回收过程优选开始于分离步骤，即分离细胞碎片与培养基中表达的0RF2。优选的分离步骤包括过滤、以约20，OOOXg的转速离心、连续流离心、用离子交換或凝胶过滤进行色谱分离和常规的免疫亲和法。本领域技术人员已知这些方法，例如(Harris和Angel (编)，《蛋白质纯化方法-实践方法》(Protein purification methods - a practicalapproach), IRL press Oxford 1995)。最优选的分离方法包括以高达约20，000 X g的转速离心和过滤。优选的过滤方法包括死封端微量过滤和切向流(或交叉流)过滤，包括中空纤维过滤和死封端微量过滤。在这些方法中，优选死封端微量过滤。死封端微量过滤的孔径优选约为0. 30-1. 35 μ m,更优选约为0. 35-1. 25 μ m,更优选约为0. 40-1. 10 μ m,最优选约为0. 45-1. O μ m。认为常规滤膜可用于本发明目的，优选聚醚砜膜。此过滤步骤去除了任何低分子量的核酸物质。因此，本发明另一方面提供了产生和/或回收重组PCV20RF2蛋白(优选以上述含量)的改进方法，即i)用重组病毒载体以上述MOI感染培养的大量易感细胞(见上)，ii)使所述重组病毒载体表达PCV 0RF2蛋白，iii)回收感染后5-8天和/或细胞活力降低到10%以下时收获的细胞上清液中的PCV20RF2，和iv)通过分离步骤分离细胞碎片与表达的PCV20RF2。所述重组病毒载体优选含有0RF2DNA编码序列的杆状病毒，所述细胞优选Sf+细胞。优选的分离步骤如上所述。最优选是用孔径约O. 30-1. 35 μ m,更优选约O. 35-1. 25 μ m，更优选约O. 40-1. 10 μ m,最优选约O. 45-1. O μ m的膜进行的死封端微量过滤。为了回收用于免疫原性或免疫组合物如疫苗的PCV20RF2，优选包括灭活步骤，以灭活病毒载体。“免疫原性或免疫组合物”指包含至少ー种抗原的组合物，所述抗原能在宿主中引发针对感兴趣的组合物或疫苗的细胞和/或抗体介导的免疫应答。通常，"免疫应答"包括但不限于以下ー种或多种作用产生或激活抗体、B细胞、辅助T细胞、抑制T细胞和/或细胞毒性T细胞和/或yd T细胞，其特异性针对感兴趣组合物或疫苗中包含的抗原。优选地，宿主将显示治疗性或保护性免疫应答，而提高对新发感染的抵抗力和/或降低疾病的临床严重程度。可通过感染宿主通常所显示症状的减轻或缺失、恢复时间较短和/或感染宿主中病毒效价降低来表明这种保护作用。因此，本发明也涉及产生和/或回收重组PCV20RF2蛋白(优选以上述含量)的方法，即i)用重组病毒载体以上述MOI感染培养的大量易感细胞(见上)， )由所述重组病毒载体表达PCV 0RF2蛋白，iii)回收感染后 5-8天和/或细胞活力降低到10%以下时收获的细胞上清液中的PCV20RF2，iv)通过分离步骤分离细胞碎片与表达的PCV20RF2，和V)灭活所述重组病毒载体。优选地，恰好在过滤步骤之前或之后完成此灭活，过滤步骤后是优选的灭活时机。任何常规灭活方法均可用于本发明目的。因此，可通过化学和/或物理处理进行灭活。在优选方式中，測定收获液体的体积，加热使温度提高到约32-42°C，更优选约34-40°C，最优选约35-39°C。优选的灭活方法包括加入环化的双氮丙啶(BEI)，浓度优选约为l_20mM，优选约为2-10mM，更优选约为2-8mM，更优选约为3_7mM，最优选约为5mM。例如，此灭活包括将优选约O. 4M的氢溴酸2-溴こ胺溶液(它在O. 3N NaOH中环化成O. 2M双氮丙啶(BEI))加入该液体中，得到终浓度约为5mM的BEI。优选地，随后连续搅拌该液体72-96小时，可将灭活的收获液体冻存于_40°C或更低，或者保存在约1_7°C。灭活完成后，优选加入I. OM硫代硫酸钠溶液，以中和任何残留的BEI。优选加入与灭活前所加入的BEI等价含量的硫代硫酸钠。例如，在加入的BEI终浓度为5mM的情况下，加入I. OM硫代硫酸钠溶液使其最终最低浓度为5mM，以中和任何残留的BEI。因此，本发明另一方面涉及产生重组PCV20RF2蛋白(优选以上述含量)的方法，即i)用重组病毒载体以上述MOI感染培养的大量易感细胞(见上)，ii)由所述重组病毒载体表达PCV 0RF2蛋白，iii)回收感染后5-8天和/或细胞活力降低到10%以下时收获的细胞上清液中的PCV20RF2，iv)通过分离步骤分离细胞碎片与表达的PCV20RF2，和V)灭活所述重组病毒载体。所述重组病毒载体优选为含有0RF2DNA编码序列的杆状病毒，所述细胞优选为Sf+细胞。优选的分离步骤如上所述，最优选是过滤步骤。优选的灭活步骤如上所述。优选在约35-39°C和2-8mM BEI存在下，更优选在约5mM BEI存在下进行灭活。令人惊讶地发现，较高浓度的BEI会对PCV2 0RF2蛋白产生负面影响。本发明另一方面，上述方法在步骤V)之后还包括中和步骤。此步骤vi)包括加入等价含量的能中和溶液中灭活剂的物质。如果灭活剂是BEI，优选加入等价含量硫代硫酸钠。因此，根据另一方面，步骤vi)包括灭活剂是BEI时，加入终浓度约为l_20mM，优选约为2-10mM，更优选约为2-8mM，更优选约为3_7mM，最优选约为5mM的硫代硫酸钠溶液。在用于免疫原性组合物如疫苗的优选形式，尤其是重组PCV20RF2蛋白形式中，通过在固定的依赖杆状病毒的易感性Sf+细胞中传代监测各批次收获的0RF2的灭活情況。在此测试的优选形式中，用1.0!11し灭活的？(^2液接种150cm2合适的单层培养细胞，維持25-29°C14天，至少两代。在该维持末期，检测该单层细胞所受到的PCV20RF2杆状病毒细胞病变作用(CPE)。优选地，也采用阳性病毒对照。这种对照包括用未灭活的參比PCV20RF2杆状病毒接种ー瓶Sf+培养细胞和保持未接种的ー瓶Sf+细胞。培育和传代后，BEI处理的病毒液中不存在病毒感染细胞表明灭活测试令人满意。接种參比病毒的对照细胞应显示PCV20RF2杆状病毒的典型CPE，未接种的培养瓶应不显示有任何PCV20RF2杆状病毒CPE的迹象。或者，在维持培养末期，可收集上清样品接种到加有Sf+细胞的Sf+96孔板上，然后25-29°C維持培育5-6天。然后固定该平板，用偶联FITC的抗PCV20RF2抗体染色。用IFA显微镜检测BEI处理的病毒液若没有CPE和ORF2表达表明灭活测试令人满意。接种參比病毒的对照细胞应显示出CPE和IFA活性，未接种的培养瓶应不显示有任何PCV20RF2杆状病毒CPE的迹象，并且没有IFA活性。 因此，本发明另一方面涉及ー种测定重组病毒载体灭活效果的灭活测试，所述灭活测试包括以下步骤i)使至少一部分含有该重组病毒载体的培养液接触优选的上述灭活剂， )加入中和剂以中和优选的上述灭活剂，和iii)用上述试验检测残留的感染力。灭活后，可以多种方式测定样品中重组PCV20RF2蛋白的相对含量。优选的定量方法包括SDS-PAGE密度測定法、ELISA和使已知量的疫苗与临床效果(血清学等)关联起来的动物疫苗接种研究。当SDS-PAGE用于定量吋，在凝胶上电泳含有未知量重组PCV20RF2蛋白的样品以及含有不同已知量重组PCV20RF2蛋白的样品。然后，可根据已知样品产生标准曲线，可通过与此标准曲线作比较确定未知样品中重组PCV20RF2的含量。因为ELISA通常被认为是抗原定量的エ业标准，所以优选用ELISA进行定量。因此，按照另一方面，本发明也涉及用于定量重组PCV20RF2蛋白的ELISA。本文提供的优选ELISA法开始时通常从用包被缓冲液以1:6000或合适的工作稀释度稀释捕获抗体。优选的捕获抗体是纯化的猪抗_PCV2Pab蛋白G，优选的包被缓冲液是O. 05M碳酸盐缓冲液，该缓冲液可将2. 93g NaHCO3 (Sigma目录号S-6014，或等效物)和L 59g NaCO3 (Sigma目录号S-6139，或等效物)混合来制备。将该混合物与蒸馏水或等效物混合，制备pH9. 6±0. I的一升溶液。下一歩，用包被缓冲液以1:6000或任何其它合适的工作稀释度稀释捕获抗体。例如，对于四块平板，ー块需要42mL包被缓冲液和7 μ L捕获抗体。采用反向吸移法，将100 μ L稀释的捕获抗体加入所有孔中。为了获得均匀包被，应温和拍打各平板的侧面。然后用平板密封条密封该平板，然后叠加平板并用空96孔板加盖。将平板在35-39°C培育过夜(14-24小吋)。然后用ultra wash plus微量滴定板洗涤器以洗涤缓冲液洗涤各平板3次，设定为250 μ L/洗涤、洗涤3次、无浸泡时间。最后一次洗涤后，在纸巾上拍打平板。用反向吸移技术再次将250 μ L封闭溶液加入所有孔中。应密封测试平板，35-37°C培育约I小时(±5分钟)。优选此步骤后不叠加平板。在封闭步骤期间，应拿出所有测试样品室温解冻。下一歩，应准备四个独立的稀释平板，将200 μ L稀释剂溶液加入除A和H行1-3列以外的所有剩余孔中。下一歩，应如下标记六个试管低效价、中效价、高效价、灭活/过滤(1:240)、灭活/过滤(1:480)和内标。在标示的试管中，合适地稀释以下测试样品。应在临用前涡旋振荡解冻的测试样品。在四块平板中，制作以下稀释液:Α)不预先稀释的低效价液:3. OmL低效价;B) 1:30稀释的阴性对照(Sf+细胞)3. 77mL稀释剂+130 μ L阴性对照;c) 1:30稀释的中效价液(8 μ g/mL) :3. 77mL稀释剂+130 μ L中效价;D)1:90稀释的高效价液(16 μ g/mL) 2. 967mL稀释剂+33 μ L高效价；Ε) 1:240稀释的灭活/过滤液2. 39mL稀释剂+10 μ L灭活/过滤样品；F) 1:480稀释的灭活/过滤液1. OmL稀释剂+1. OmL上述E的完整/过滤(1:240)制备样品；G) 1:30稀释的内标3. 77mL稀释剂+130 μ L内标。下一歩，在1-4号板的 稀释平板中将300 μ L制备样品加入相应的空孔中。然后，将多通道移液器设定为100 μ L，通过上下吹打至少5次混合A行的内容物，然后用反向吸移技术将IOOyL转移到B行。应该更换尖头,重复此相同步骤至G行。现在用ultra wash plus微量滴定板洗涤器(设定为250 μ L/洗涤、洗涤3次、无浸泡时间)以洗涤缓冲液洗涤测试平板3次后，即可将这些稀释平板中的样品转移到测试平板中。最后一次洗涤后，在纸巾上拍打平板。下一歩，用简单的转移步骤将稀释平板的内容物转移到测试平板中。更具体说，从H行开始，用反向吸移技术将100 μ L/孔从稀释平板转移到测试平板的相应孔中。每次转移后，应更换移液器尖头。从G行开始，用反向吸移技术将稀释平板中的IOOyL/孔转移到测试平板的相应孔中。同组的移液器尖头可用于其余转移。为了保证转移均一的溶液，应上下吹打该溶液至少3次再转移。下一歩，密封测试平板并在37°C ±2. (TC培育I. O小时±5分钟。也优选不叠加平板。然后用ultrawash plus微量滴定板洗漆器(设定为250 μ L/洗涤、洗涤3次、无浸泡时间)以洗涤缓冲液洗涤平板3次。最后一次洗涤后，在纸巾上拍打平板。用反向吸移技术将1:300稀释或合适的工作稀释度稀释的IOOyL检测抗体加入测试平板的所有孔中。例如，对于四块平板，需要42mL稀释剂溶液和140yL捕获抗体。然后密封测试平板，并在37°C ±2. (TC培育I. O小时±5分钟。再用ultrawash plus微量滴定板洗涤器(设定为250 μ L/洗涤、洗涤3次、无浸泡时间)以洗涤缓冲液洗涤平板3次。最后一次洗涤后，在纸巾上拍打平板。下一歩，通过将1%正常兔血清加入稀释剂中制备偶联稀释剂。例如，对于四块平板，将420 μ L正常兔血清加入42mL稀释剂中。用新鲜制备的偶联抗体稀释溶液在测试平板的所有孔中将偶联抗体稀释至1:10，000或者其它合适的エ作稀释度。用反向吸移技术，将IOOyL这种稀释的偶联抗体加入所有孔中。然后密封测试平板，37°C ±2.0で培育45±5分钟。优选不叠加平板。用ultra wash plus微量滴定板洗涤器(设定为250 μ L/洗涤、洗涤3次、无浸泡时间)以洗涤缓冲液洗涤平板3次。最后一次洗涤后，在纸巾上拍打平板。下一歩，临用前混合等体积的TMB过氧化物酶底物(试剂Α)与过氧化物酶溶液B (试剂B)。混合量取决于平板数量，但每一平板需要10mL+2mL。因此，4块平板需要21mL试剂A+21mL试剂B。用反向吸移技术将100 μ L底物加入测试平板的所有孔中。然后室温培育该平板15分钟±15秒。用反向吸移技术将100 μ LlN HCl溶液加入所有孔中终止反应。然后打开ELISA平板阅读器，以常规方式进行诊断和测试。本发明另一方面涉及构建含有PCV2 0RF2 DNA的重组病毒载体和用其感染易感细胞大量表达PCV20RF2蛋白的方法。令人惊讶地发现，本文提供的重组病毒载体在感染易感细胞后可表达大量上述PCV20RF2。因此，本发明也涉及产生和/或回收PCV20RF2蛋白的改进方法，所述方法优选包括以下步骤构建含有PCV20RF2DNA的重组病毒载体和表达PCV20RF2蛋白。所述病毒载体优选重组杆状病毒。本文所述构建含有PCV20RF2DNA的重组病毒载体和表达PCV20RF2蛋白的详细方法如下在优选形式中，用其中克隆有0RF2基因的转运载体转染病毒载体，产生用于感染细胞的含有PCV20RF2DNA的重组病毒载体和表达PCV20RF2蛋白。优选地，仅将转运载体中含有的0RF2DNA部分转染到病毒载体中。术语“转染入病毒载体”指(用作)将异源DNA “引入”或“克隆”入病毒载体，如杆状病毒载体的同义词。所述病毒载体优选(但不必是)杆状病毒。因此，按照本发明另一方面，通过含有异源PCV20RF2DNA的转运载体和病毒载体(优选杆状病毒，更优选线性化的复制缺陷型杆状病毒(如Baculo Gold DNA))之间重组而产生所述重组病毒载体。“转运载体”指ー种DNA分子，其包含至少ー个复制起点、异源基因(在本文中是PCV20RF2)和允许将所述异源基因克隆入病毒载体的DNA序列。允许将所述异源基因克隆入病毒载体的DNA序列优选侧接于该异源基因。更优选的是，这些侧接序列至少与该病毒载体序列部分同源。这种序列同源性可允许病毒载体和转运载体的分子之间发生重组，而产生含有该异源基因的重组病毒载体。一种优选的转运载体是PVL1392载体(BD Biosciences Pharmingen),设计用于与BaculoGold DNA共同转染入优选的Sf+细胞系中。所述转运载体优选包含PCV20RF2DNA。共同转染的构建物的长度约为10，387个碱基对。在更优选的形式中，本发明方法将从分离PCV20RF2DNA开始。通常，该DNA可来自已知或未知菌株，因为0RF2DNA似乎在不同分离物中高度保守，序列相同性至少约为95%。 本领域已知可表达到上清中的任何PCV20RF2基因可用于本发明目的。优选用PCR法扩增PCV 0RF2DNA，更优选与引入的5’侧接Kozak共有序列(CCGCCAUG) (SEQ ID NO I)和/或3’侧接EcoRl位点(GAATTC) (SEQ ID NO 2)同时扩增。引入5’Kozak共有序列优选去除了PCV20RF2中的天然产生的起始密码子AUG0优选将3’ EcoRl位点引入PCV20RF2终止密码子下游。更优选地，将其引入聚A转录终止序列下游，聚A转录终止序列本身位于PCV20RF2終止密码子下游。已发现，采用Kozak共有序列，具体是上述序列，能提高随后PCV20RF2的蛋白表达水平。将含有这些额外序列的扩增的PCV20RF2DNA克隆入载体中。用于此初步克隆步骤的优选载体是pGEM-T-Easy载体(Promega,威斯康星州麦迪逊)。优选在NotI限制性位点处从载体上切下含有ー些PGEM载体序列(SEQ ID NO 7)的PCV2 0RF2 DNA。然后将得到的DNA克隆入转运载体。因此，本发明ー个方面提供了构建含有PCV20RF2DNA的重组病毒载体的方法。此方法包括以下步骤i)将重组PCV20RF2克隆入转运载体；和ii)将含有重组PCV20RF2的转运载体部分转染到病毒载体中，产生重组病毒载体。优选地，该转运载体是如上所述的载体，或通过上述方法构建，或如图I所示。因此，按照另一方面，用于构建本文所述重组病毒载体的转运载体含有SEQ ID NO 7序列。另ー方面，此方法在步骤i)之前还包括以下步骤体外扩增PCV20RF2DNA，其中如上所述修饰PCV20RF2DNA的侧接序列。扩增PCV20RF2DNA和修饰侧接序列、将扩增的PCV20RF2DNA体外克隆入转运载体的体外方法和合适转运载体如上所述，如图I所示，或为本领域技术人员所知。因此，另一方面，本发明涉及构建含有PCV20RF2DNA的重组病毒载体和表达PCV20RF2蛋白的方法，所述方法包括以下步骤i)体外扩增PCV2 0RF2 DNA，其中包括修饰所述PCV2 0RF2 DNA的侧接序列，ii)将扩增PCV20RF2DNA克隆入转运载体中；和
iii)将转运载体中含有的重组PCV2 0RF2 DNA部分转染入病毒载体中，产生重组病毒载体。优选如上所述进行PCV2 0RF2 DNA侧接序列的修饰，例如引入5’ Kozak序列和/或EcoRl位点，优选如上所述。另ー方面，本发明提供产生和/或回收PCV2开放阅读框2表达的重组蛋白的方法。该方法通常包括以下步骤i)将重组PCV2 0RF2克隆入转运载体中；ii)将转运载体中含有重组PCV2 0RF2的部分转染到病毒中；iii)用转染病毒感染培养的细胞；iv)使转染病毒由PCV2 0RF2表达重组蛋白'Y)分离上清液与细胞；和vi)从上清液中回收表达的PCV20RF2蛋白。上面描述了如何将重组PCV2 0RF2 DNA克隆入转运载体的方法。该转运载体优选含有序列SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:4、SEQ ID NO :7。然而，该转运载体可含有任何未修饰或修饰的PCV20RF2DNA，只要转染到重组病毒载体中的该PCV2 0RF2 DNA能在培养细胞中表达。所述重组病毒载体优选包含序列SEQ ID N0:8。而且，上面详细描述了如何用确定量的含有PCV2 ORF 2DNA的重组杆状病毒感染细胞，优选如何感染昆虫细胞和表达PCV20RF2蛋白的方法。而且，上面也详细描述了分离上清液与细胞的步骤以及回收表达的PCV20RF2蛋白的步骤。本文所述的这些特定加工步骤都是上述产生和/或回收PCV2开放阅读框2表达重组蛋白方法的一部分。所述细胞优选Sf+细胞。更优选地，细胞培养物的细胞数约为O. 3-2. OXlO6个细胞/mL，更优选约为O. 35-1. 9 X IO6个细胞/mL，更优选约为 O.4-1. 8 X IO6个细胞/mL，更优选约为O. 45-1. 7 X IO6个细胞/mL，最优选约为O. 5-1. 5 X IO6个细胞/mL。优选用含有PCV20RF2DNA的重组病毒载体感染易感细胞，感染复数(MOI)优选约为O. 03-1. 5，更优选约为O. 05-1. 3，更优选约为O. 09-1. I，更优选约为O. 1-1. 0，最优选约为O. 5。优选回收感染后5-8天和/或细胞活力降低到10%以下时收获的细胞上清液中的PCV20RF2蛋白。优选地，产生PCV20RF2蛋白时，在25_29°C培养细胞。分离步骤优选为离心或过滤步骤。任选地，此方法可包括以下步骤扩增PCV2菌株的PCV2 0RF2 DNA，然后将该PCV20RF2 DNA克隆入转运载体。在优选形式中，也可在扩增之前或期间，优选将5’Kozak序列、3’ EcoRl位点和其组合加入扩增序列中。优选的5’ Kozak序列包含SEQ ID NO :1。优选的3’ EcoRl位点包含SEQ ID NO :2。优选的PCV2 0RF2 DNA包含核苷酸序列Genbank登录号AF086834 (SEQ ID NO 3)和 SEQ ID NO :4。优选的重组 PCV2 0RF2 蛋白包含 SEQ ID NO 5和 SEQ ID NO :6 的氨基酸序列，SEQ ID NO :5 是 SEQ ID NO :3 (Genbank 登录号 AF086834)编码的蛋白质，SEQ IDNO :6是SEQ ID NO :4编码的蛋白质。优选培养基包括无血清昆虫细胞培养基，更优选Excell 420培养基。当进行任选的扩增步骤时，优选先将扩增的开放阅读框2克隆入第一载体中，从第一载体上切下开放阅读框2，将切下的开放阅读框克隆入转运载体中。用于共同转染的优选细胞系是SF+细胞系。用于共同转染的优选病毒是杆状病毒。在此方法的优选形式中，转运载体的转染部分包含SEQ ID NO :8。最后，在此方法中，优选在用该病毒感染细胞至少5天后回收细胞培养上清液中的PCV2开放阅读框2(0RF2)编码的蛋白。因此，本发明另一方面涉及产生和/或回收PCV2开放阅读框2的方法，所述方法包括以下步骤i)体外扩增PCV2 0RF2 DNA，优选加入5’Kozak序列和/或加入3’EcoRl限制性位点，ii)将扩增的PCV20RF2克隆入转运载体中；iii)将转运载体中含有的重组PCV20RF2部分转染入病毒中；iv)用转染病毒感染培养的细胞；v)使转染病毒由PCV2 0RF2表达重组蛋白；vi)分离上清液与细胞；和vii)从上清液中回收表达的PCV2 0RF2蛋白。本发明另一方面涉及制备含有PCV2 0RF2蛋白和灭活病毒载体的组合物的方法。该方法包括以下步骤i)将扩增的PCV2 0RF2克隆入转运载体中；ii)将转运载体中含有的重组PCV2 0RF2部分转染入病毒中；iii)用转染病毒载体感染培养的细胞；iv)使转染病毒载体由PCV2 0RF2表达重组蛋白；v)分离上清液与细胞；vi)从上清液中回收表达的PCV20RF2蛋白；和vii)灭活该重组病毒载体。所述重组病毒载体优选含有0RF2 DNA编码序列的杆状病毒，所述细胞优选Sf+细胞。优选的分离步骤如上所述，最优选过滤步骤。优选的灭活步骤如上所述。优选在约35-39°C和2-8mM BEI存在下，更优选在约5mM BEI存在下进行灭活。令人惊讶地发现，较高浓度的BEI会对PCV2 0RF2蛋白产生负面影响，而较低浓度在24-72小时灭活期间不能有效灭活病毒载体。灭活优选进行至少24小吋，更优选进行24-72小时。另ー 方面，是上述制备含有PCV2 0RF2蛋白的组合物和灭活病毒载体的方法在步骤vii)之后还包括中和步骤。此步骤viii)包括加入等价含量的能中和溶液中灭活剂的物质。优选地，如果灭活剂是BEI，优选加入等价含量硫代硫酸钠。因此，另一方面，步骤viii)包括灭活剂是BEI时加入硫代硫酸钠溶液，使其终浓度约为l_20mM，优选约为2_10mM，更优选约为2-8mM，更优选约为3-7mM，最优选约为5mM。另ー方面，是上述制备含有PCV20RF2蛋白的组合物和灭活病毒载体的方法在步骤i)之前包括以下步骤体外扩增PCV2 0RF2 DNA，其中如上所述修饰PCV2 0RF2 DNA的侧接序列。体外扩增PCV2 0RF2 DNA和修饰侧接序列，将体外扩增的PCV20RF2DNA克隆入转运载体的方法和合适的转运载体如上所述，如图I所示，或为本领域技术人员所知。因此，另ー方面，此方法包括以下步骤i)体外扩增PCV2 0RF2 DNA，其中包括修饰所述PCV2 0RF2DNA的侧接序列，ii)将扩增的PCV2 0RF2 DNA克隆入转运载体中；和iii)将含有重组PCV20RF2 DNA的转运载体或其一部分转染入病毒载体中，产生重组病毒载体，iv)用转染病毒感染培养的细胞；v)使转染病毒由PCV20RF2表达重组蛋白；vi)分离上清液与细胞；vii)从上清液中回收表达的PCV2 0RF2蛋白；viii)优选在约l_20mM BEI的存在下，最优选在约5mM BEI的存在下，灭活所述重组病毒载体；和ix)加入等价含量的能中和溶液中灭活剂的物质，灭活剂是BEI时优选加入硫代硫酸钠溶液，使其终浓度约为l_20mM，优选约为5mM。在本发明另一方面，提供了制备ー种用于引发抗PCV2免疫应答的组合物、优选抗原性组合物如疫苗的方法。通常，此方法包括将构建物转染入病毒中的步骤，其中所述构建物包含i)PCV2的0RF2的重组DNA，ii)用转染病毒感染培养生长的细胞，iii)使该病毒由PCV2 0RF2表达重组蛋白，iv)从上清液中回收表达的0RF2蛋白，和V)通过混合回收的蛋白质与合适的佐剂和/或其它药学上可接受的运载体制备该组合物。本文所用“佐剂”可包括氢氧化铝和磷酸铝，皂苷如Quil A、QS-21 (CambridgeBiotech Inc. , Cambridge MA)>GPI-0100(Galenica Pharmaceuticals, Inc. ,Birmingham,AL)，油包水乳液，水包油乳液，水包油包水乳液。具体说,乳液可基于轻质(light liquid)石蜡油(欧洲药典类型)；类异戊ニ烯油如角鲨烷或角鲨烯；链烯，具体是异丁烯或癸烯硫代寡聚化(theoligomerization)产生的油；含有直链烧基的酸或醇的酯，更具体是植物油、油酸こ酷、ニ(辛酸/癸酸)丙ニ醇酯、三(辛酸/癸酸)甘油酯或ニ油酸丙ニ醇酷；支链脂肪酸或醇的酯，具体是异硬脂酸酷。将油与乳化剂联用以形成乳液。乳化剂优选非离子性表面活性剤，具体是山梨聚糖、ニ缩甘露醇(如油酸脱水甘露醇酷)、甘油、聚甘油、丙ニ醇和油酸、异硬脂酸、蓖麻油酸或羟基硬脂酸的酯(任选こ氧基化)，以及聚氧丙烯-聚氧こ烯嵌段共聚物，具体是普朗尼克产品，尤其是L121。參见Hunter等，《佐剂的理论和实际故用》(The Theory and Practical Application of adjuvants) (Stewart-TulI, D. ES.編)，JohnWiley&Sons，NY，第 51-94 页(1995)和 Todd 等，Vaccine 15:564-570(1997)。例如，可米用M. Powell和M. Newman, Plenum Press, 1995所编的《疫苗设计，亚基和佐剂方法》(Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach)的第 147 页所述SPT乳液和该书第183页所述的MF59乳液。佐剂的另一个例子是选自丙烯酸或甲基丙烯酸聚合物的或者顺丁烯ニ酸酐与烯基衍生物共聚物的化合物。佐剂化合物宜为交联的、尤其是与糖或多元醇的聚烯基醚交联的丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物。这些化合物称为卡波姆(carbomer) (Phameuropa第8卷，第2期，1996年6月)。本领域技术人员也可參见美国专利2，909，462描述的与含有至少3个羟基，优选不多于8个羟基的多羟基化合物交联的这种丙烯酸聚合物，其至少三个羟基的氢原子被含有至少2个碳原子的不饱和脂族基团取代。优选基团是含有2-4个碳原子的基团，如こ烯基、烯丙基和其它烯键式不饱和基团。不饱和基团本身可含有其它取代基，如 甲基。以名称卡巴浦尔(carbopol)出售的产品(BF Goodrich,Ohio,USA)尤其合适。它们与烯丙基蔗糖或与烯丙基戊赤藓醇交联。其中，可提及的有卡巴浦尔974P、934P和971P。最优选采用卡巴浦尔971P。在马来酸酐和烯基衍生物的共聚物中，共聚物EMA(Monsanto)是马来酸酐和こ烯的共聚物。这些聚合物在水中的溶解产生的酸溶液应予中和，优选中和至生理pH，以产生其中可掺入免疫原性、免疫或疫苗组合物本身的佐剂溶液。其它合适佐剂包括但不限于RIBI佐剂系统(Ribi Inc.)、嵌段共聚物(CytRx，Atlanta GA)、SAF-M(Chiron, Emeryville CA)、单憐酸基脂质 A、阿夫立定(Avridine)月旨质-胺佐剂、大肠杆菌(E.coli)的热不稳定性肠毒素(重组或其它)、霍乱毒素、IMS1314或胞壁酰ニ肽等等。优选姆剂量加入约100 μ g-10mg量的佐剂。更优选姆剂量加入约100 μ g-10mg量的佐剂。更优选每剂量加入约500 μ g-5mg量的佐剂。更优选每剂量加入约750 μ g-2. 5mg量的佐剂。最优选每剂量加入约Img量的佐剂。因此，另一方面，制备用于引发抗PCV2免疫应答的抗原性组合物如疫苗的方法包括i)制备和回收PCV20RF2蛋白，和ii)将其与合适佐剂混合。优选地，该佐剂为卡巴浦尔971P。更优选每剂量加入约500μ g-5mg量的卡巴浦尔971P，更优选每剂量加入约750 μ g-2. 5mg量的卡巴浦尔971P，最优选每剂量加入约Img量的卡巴浦尔971P。优选地，该方法的步骤i)包括制备和回收PCV20RF2所述的加工步骤。例如，在此方法的优选形式中，获得转运载体中包含PCV20RF2DNA的构建物。合适的转运载体和制备它们的方法如上所述。任选地，该方法可包括以下步骤通过PCR扩增PCV2毒株的0RF2，然后将0RF2克隆入转运载体中。优选的开放阅读框序列、Kozak序列、3’EcoRl位点序列、重组蛋白序列、转染的构建序列、培养基、细胞和病毒參见前述方法。用于此方法的另一任选步骤包括将扩增的PCV2 0RF2 DNA克隆入第一载体中，从此第一载体上切下0RF2 DNA，将此切下的PCV20RF2 DNA克隆入转运载体中。如同其它方法那样，优选在用转染的杆状病毒感染细胞后等待至少5天，再从上清液中回收重组0RF2蛋白。优选地，此方法的回收步骤也包括分离培养基与细胞和细胞碎片的步骤。可通过各种容易和方便的方法完成此步骤，优选通过孔径范围约为0. 45 μ Μ-1. ΟμΜ的滤器过滤细胞、细胞碎片和生长培养基。最后，此方法优选在将回收的重组PCV20RF2蛋白混合到组合物中之前包括一病毒灭活步骤。可通过各种方法完成此步骤，但优选采用BEI实施本发明。因此，另一方面，此方法包括以下步骤i)体外扩增PCV2 0RF2 DNA，其中包括修饰所述PCV2 0RF2 DNA的侧接序列，ii)将扩增的PCV2 0RF2 DNA克隆入转运载体中
将含有重组PCV2 0RF2 DNA的转运载体或其一部分转染入病毒载体中，产生重组病毒载体，iv)用转染病毒感染培养的细胞；v)使转染病毒由PCV2 0RF2表达重组蛋白；vi)分离上清液与细胞；vii)从上清液中回收表达的PCV2 0RF2蛋白；viii)优选在约l_20mM BEI的存在下，最优选在约5mM BEI的存在下，灭活所述重组病毒载体；ix)加入等价含量的能中和溶液中灭活剂的物质，灭活剂是BEI时优选加入硫代硫酸钠溶液，使其终浓度约为l_20mM，优选约为5mM，和X)加入适当量的佐剂，优选加入卡巴浦尔，更优选卡巴浦尔971P，更优选加入上述量(如每剂量约500 μ g-5mg,更优选每剂量约750 μ g-2. 5mg,最优选每剂量约Img)的佐剂。此外，该组合物可包含一种或多种药学上可接受的载体。本文所用术语〃药学上可接受的载体"包括任何和所有溶剂、分散介质、包衣、稳定剂、稀释剂、防腐剤、抗菌剂和抗真菌剂、等渗剂、吸收延迟剂等。最优选地，本文所述组合物含有从体外培养细胞上清液中回收的PCV20RF2蛋白，其中所述细胞已用含有PCV2 0RF2 DNA的重组病毒载体感染并表达PCV20RF2蛋白，并用约2-8mM BEI，优选约5mM BEI处理所述细胞培养物，以灭活该病毒载体，还加入相同浓度的中和剂、卡巴浦尔和生理盐水；所述中和剂优选硫代硫酸钠溶液，终浓度约为2-8mM，优选约5mM，卡巴浦尔更优选卡巴浦尔971P，其优选用量为每剂量约500 μ g_5mg,更优选姆剂量约750 μ g-2. 5mg,最优选姆剂量约Img ;所述生理盐水用量优选约 50-90% (v/v)，更优选约 60-80% (v/v)，更优选约 70%(v/v)。因此，另一方面涉及制备引发抗PCV2免疫应答的抗原性组合物如疫苗的方法，所述方法包括以下步骤i)体外扩增PCV2 0RF2 DNA，其中包括修饰所述PCV2 0RF2 DNA的侧接序列，ii)将扩增的PCV2 0RF2 DNA克隆入转运载体中；和iii)将含有重组PCV2 0RF2DNA的转运载体或其一部分转染入病毒载体中，产生重组病毒载体，iv)用转染病毒感染培养的细胞；v)使转染病毒由PCV2 0RF2表达重组蛋白；vi)分离上清液与细胞；vii)从上清液中回收表达的PCV2 0RF2蛋白；viii)优选在约l-20mM BEI的存在下，最优选在约5mMBEI的存在下，灭活所述重组病毒载体；ix)加入等价含量的能中和溶液中灭活剂的物质，灭活剂是BEI时优选加入硫代硫酸钠溶液，使其终浓度约为O. 5-20mM，优选约为5mM，x)加入适当量的佐剂，优选加入卡巴浦尔，更优选卡巴浦尔971P，更优选加入上述量(如每剂量约500 μ g-5mg,更优选每剂量约750 μ g-2. 5mg,最优选每剂量约Img)的卡巴浦尔97IP ;和xi)加入生理盐水，优选以约50-90% (v/v),更优选约60-80% (v/v),更优选约70% (v/v)的量加入。任选地，此方法也可包括加入保护剂。本文所用保护剂指抗微生物活性剤，如庆大霉素、硫柳汞等。具体说，在制备多剂量组合物中最优选加入保护剂。加入抗微生物活性剂的浓度应有效防止感兴趣组合物中产生任何微生物污染或抑制感兴趣组合物中的任何微生物生长。而且，此方法也可包括加入任何稳定剂，如糖、海藻糖、甘露醇、蔗糖等，以增加和/ 或维持产品的保存期。然而，令人惊讶地发现，产生的制剂在不添加任何其它稳定剂的情况下至少在24个月中免疫有效。本发明另一方面涉及用上述方法产生的产品。具体说，本发明涉及含有重组表达的PCV2 0RF2蛋白的组合物。而且，本发明也涉及含有从昆虫细胞培养物上清液中回收的重组表达PCV2 0RF2蛋白的组合物。而且，本发明也涉及含有从昆虫细胞培养物上清液中回收的重组表达PCV2 0RF2蛋白的组合物。这种组合物也优选含有适合灭活该病毒载体的物质。所述灭活剂优选BEI。而且，本发明也涉及含有从昆虫细胞培养物上清液中回收的重组表达PCV2 0RF2蛋白、适合灭活该病毒载体的物质(优选BEI)，以及用于中和灭活剂的中和剂的组合物。当BEI用作灭活剂时，所述中和剂优选硫代硫酸钠。在本发明的另一方面，提供了诱导免疫应答，更优选产生抵抗PCV2感染临床症状的保护性免疫力的免疫原性组合物。该组合物通常包含PCV2的开放阅读框2(0RF2)表达的多肽或其片段，作为该组合物的抗原性组分。本文中用于制备所述组合物、也可用于本文所述方法的PCV2 0RF2 DNA和蛋白质是PCV2分离物内的高度保守结构域，因此，任何PCV2 0RF2与本文所用的PCV 0RF2 DNA和/或多肽的来源同样有效。优选的PCV2 0RF2蛋白是SEQ ID N0:11的蛋白。本文提供的优选PCV 0RF2多肽是SEQ ID NO :5，但本领域技术人员知道，此序列的序列同源性可改变多至
6-10%而仍能保留使其可用于免疫原性组合物的抗原性特征。免疫组合物的这种抗原性特征可以通过(例如)实施例4提供的攻击实验来估计。而且，与多核苷酸序列SEQ ID NO3或SEQ ID N0:4编码的PCV2 0RF2蛋白相比，当某修饰的抗原产生至少70%，优选80%，更优选90%保护性免疫力吋，即仍然保留了该修饰抗原的抗原性特征。本文所用“免疫原性组合物”指在宿主中引发对PCV2 0RF2蛋白的细胞和/或抗体-介导的免疫应答的PCV20RF2蛋白。优选此免疫原性组合物能够产生抵抗PCV2感染和与其相关的临床症状的保护性免疫力。在ー些形式中，PCV2 0RF2蛋白的免疫原性部分可用作该组合物的抗原性组分。本文所用术语“免疫原性部分”分别指PCV2 0RF2蛋白和/或多核苷酸的截短和/或取代形式，或其片段。优选地，这种截短和/或取代形式或片段将包含全长0RF2多肽的至少6个连续氨基酸。更优选地，截短和/或取代形式，或片段将含有全长0RF2多肽的至少10个，优选至少15个，更优选至少19个连续氨基酸。在这方面，本文提供了两种优选序列，即SEQ IDN0:9和10。还应理解，这些序列可以是较大片段或截短形式的一部分。本文提供的另ー优选PCV20RF2多肽由核苷酸序列SEQ ID NO :3或SEQ ID NO :4编码。但本领域技术人员应理解，此序列的序列同源性可改变多至6-20%而仍能保留使其可用于免疫原性组合物的抗原性特征。在ー些形式中，0RF2的截短或取代形式或其片段用作该组合物中的抗原性组分。这种截短或取代形式或其片段优选包含全长0RF2核苷酸序列，如SEQ ID NO :3或SEQID NO :4的至少18个连续核苷酸。更优选地，该截短或取代形式或其片段将含有全长0RF2核苷酸序列，如SEQ ID NO 3或SEQ ID NO 4的至少30个，更优选至少45个，更优选至少57个连续核苷酸。本领域所称“序列相同性”指两条或多条多肽序列或两条或多条多核苷酸序列，即參比序列与给定序列之间与參比序列相比的关系。序列经优化比对产生最高程度的序列相似性后，通过比较给定序列与參比序列之间的匹配程度来确定序列相同性。比对后，根据位置-位置来确定序列相同性，例如，如果在某具体位置上核苷酸或氨基酸残基相同，则称此序列在此具体位置上“相同”。然后，将这种相同位置的数目除以參比序列中的核苷酸或残基总数，得到序列相同性％。不难用已知方法计算序列相同性，所述方法包括但不限于以下文献所述方法《计算分子生物学》(Computational Molecular Biology),、Lesk, A. N.编，Oxford University Press，纽约(1988)，《生物计算信息学和基因组计划》(Biocomputing:Informatics and Genome Projects), Smith，D. W.编，Academic Press，纽约(1993);《序列数据的计算机分析》(Computer Analysis of Sequence data)，第I部分，Griffin, A.M.和 Griffin，H. G.编，Humana Press，新泽西(1994);《分子生物学中的序列分析》(Sequence Analysis in Molecular Biology), vonHeinge, G. , AcademicPress (1987);《序列分析引物》(Sequence Analysis Primer), Gribskov, M.和 Devereux,J.编，M. Stockton Press,纽约(1991) ；Carillo, H.和 Lipman，D. , SIAM J. Applied Math.，48 :1073(1988),将其内容納入本文作參考。设计的用于测定序列相同性的优选方法是给出测试序列之间的最大匹配。公众可得的測定给定序列之间序列相同性的计算机程序中編纂了用于测定序列相同性的方法。这些程序的例子包括但不限干GCG程序包(Devereux，J.等，Nucleic Acids Research，12 (I) : 387 (1984))、BLASTP、BLASTN 和 FASTA (Altschul，S. F.等，J.Molec. Biol. ,215:403-410(1990)。公众可从 NCBI 和其它来源获得 BLASTX 程序(BLAST 手册，Altschul, S.等，NCVI NLM NIH Bethesda, MD 20894, Altschul, S. F.等， J. Molec. Biol.，215:403-410 (1990)，将其内容纳入本文作參考)。这些程序采用默认的缺ロ权重最优地比对序列，以产生给定序列与參比序列之间的最高水平序列相同性。例如，当某多核苷酸的核苷酸序列与參比核苷酸序列之间的“序列相同性”至少为(例如)85%、优选90%、更优选95%时，称给定多核苷酸的核苷酸序列与參比序列相同，除了每100个核苷酸中，与參比核苷酸序列相比给定多核苷酸序列可包含多达15个、优选多达10个、更优选多达5个点突变。換言之，多核苷酸的核苷酸序列相对于參比核苷酸序列的相同性至少为85%、优选90%、更优选95%时，參比序列中多达15%、优选10%、更优选5%的核苷酸可缺失或用另ー核苷酸取代，或者可将占參比序列核苷酸总数量的15%、优选10%、更优选5%的核苷酸插入该參比序列中。參比序列的这些突变可发生在參比核苷酸序列的5’或3’末端位置，或者这些末端位置之间的任何位置，或单个散布于參比序列的核苷酸中或散布于參比序列的ー个或多个毗连基团中。类似地，当某多肽的给定氨基酸序列与參比氨基酸序列的序列相同性至少为(例如)85%、优选90%、更优选95%时，称该多肽的给定氨基酸序列与參比序列相同，除了每100个氨基酸中，与參比氨基酸序列相比给定多肽序列可包含多达15个、优选多达10个、更优选多达5个氨基酸改变。換言之，为了获得与參比氨基酸序列的序列相同性至少为85%、优选90%、更优选95%的给定多肽序列，參比序列中多达15%、优选多达10%、更优选多达5%的氨基酸残基可缺失或用另ー核苷酸取代，或者可将占參比序列氨基酸残基总数的15%、优选10%、更优选5%的氨基酸插入參比序列中。參比序列的这些改变可发生在參比氨基酸序列的氨基或羧基末端位置，或者这些末端位置之间的任何位置，或单个散布于參比序列的残基中或散布于參比序列的一个或多个毗连基团中。优选地，不相同的残基位置的区别在于保守性氨基酸取代。然而，測定序列相同性时匹配不包括保守性取代。本文所用“序列同源性”指測定两条序列相关性的方法。为了測定序列同源性，应最优比对两条或多条序列，如果需要可引入缺ロ。然而，与“序列相同性”相反，測定序列同源性时将保守性氨基酸取代计为匹配。換言之，为了获得与參比序列的序列同源性为95%的多肽或多核苷酸，參比序列中85%、优选90%、更优选95%的氨基酸残基或核苷酸必须匹配或包含另ー种氨基酸或核苷酸的保守性取代，或者可将占參比序列总氨基酸残基或核苷酸 (不包括保守性取代)总数的15%、优选10%、更优选5%的氨基酸或核苷酸插入參比序列中。同源序列优选包含至少一段50个、更优选100个、更优选250个、更优选500个核苷酸。“保守性取代”指用具有相似特征或特性，包括大小、疏水性等的另ー氨基酸残基或核苷酸取代某氨基酸残基或核苷酸，以使其整体功能不显著改变。本文所用术语“分离”指“人工”改变其天然状态，即，如果其天然存在，从其原始环境改变或取得，或二者。例如，天然存在于活生物体中的多核苷酸或多肽不是“分离”的，但使其与天然状态共存物质分离得到的同一多核苷酸或多肽则是“分离”的。因此，本发明另一方面涉及有效减轻PCV2感染相关临床症状严重性的包含PCV20RF2蛋白的免疫原性组合物。优选地，该PCV20RF2蛋白是上述任何ー种蛋白。所述PCV20RF2蛋白优选为i) 包含序列 SEQ ID NO :5、SEQ ID NO :6、SEQ ID NO :9、SEQ ID NO :10 或 SEQID NO 11的多肽；
ii) 与i)所述多肽至少80%同源的任何多肽；iii) i)和/或ii)所述多肽的任何免疫原性部分；iv) iii)所述的免疫原性部分，包含序列SEQ ID NO :5、SEQ ID NO :6、SEQ IDNO :9、SEQ ID NO :10或SEQ ID NO 11中的至少10个毗连氨基酸；V) 包含序列SEQ ID NO :3或SEQ ID NO 4的DNA编码的多肽；vi) 与V)所述多核苷酸至少80%同源的多核苷酸编码的任何多肽；vii) V)和/或vi)所述多核苷酸编码的多肽的任何免疫原性部分；viii) vii)所述的免疫原性部分，其中编码所述免疫原性部分的多核苷酸包含序列SEQ ID NO 3或SEQ ID NO 4中的至少30个毗连核苷酸。优选具有序列SEQ ID NO 3或SEQ ID NO 4编码的PCV20RF2蛋白免疫原性特征的任何免疫原性部分。另ー方面，该免疫组合物提供了有效诱导所需免疫应答，即降低PCV2感染所致临床症状的发生率或减轻其严重性的PCV20RF2蛋白抗原水平。优选地，包含的PCV20RF2蛋白水平至少为O. 2 μ g抗原/ml最终免疫原性组合物(μ g/ml)，更优选约O. 2-400 μ g/ml,更优选约O. 3-200 μ g/ml,更优选约O. 35-100 μ g/ml,更优选约O. 4-50 μ g/ml,更优选约
0.45-30 μ g/ml,更优选约 O. 6-15 μ g/ml,更优选约 O. 75-8 μ g/ml,更优选约 I. 0-6 μ g/ml,更优选约I. 3-3. O μ g/ml,更优选约I. 4-2. 5 μ g/ml,更优选约I. 5-2. O μ g/ml,最优选约
1.6 μ g/ml ο另ー方面，包含的0RF2抗原水平至少为每剂量最终抗原性组合物含O. 2 μ g上述PCV20RF2蛋白(μ g/剂量)，更优选约O. 2-400 μ g/剂量，更优选约O. 3-200 μ g/剂量，更优选约O. 35-100 μ g/剂量，更优选约O. 4-50 μ g/剂量，更优选约O. 45-30 μ g/剂量，更优选约O. 6-15 μ g/剂量，更优选约O. 75-8 μ g/剂量，更优选约I. 0-6 μ g/剂量，更优选约I. 3-3. Oyg/剂量，更优选约I. 4-2. 5 μ g/剂量，更优选约I. 5-2. Oyg/剂量，最优选约
I.6 yg/ 剂量。可通过任何方式产生本发明免疫原性组合物中所用的PCV2 0RF2多肽，包括分离和纯化PCV2 0RF2、标准的蛋白质合成方法和重组方法。获得PCV2 0RF2多肽的优选方法如上所述，也可參见美国专利申请序列号11/034，797，将其内容納入本文作參考。简言之，用含有PCV2 0RF2 DNA编码序列的重组病毒载体感染易感细胞，由重组病毒表达PCV2 0RF2多肽，通过过滤从上清液中回收表达的PCV2 0RF2多肽，用任何常规方法、优选用双氮丙啶灭活，然后中和该物质以终止灭活过程。因此，另ー方面，所述免疫原性组合物含有i)任何上述PCV2 0RF2蛋白，浓度优选上述浓度，和ii)至少一部分表达所述PCV2 0RF2蛋白的病毒载体、优选重组杆状病毒。而且，另ー方面，所述免疫原性组合物含有i)任何上述PCV2 0RF2蛋白，浓度优选上述浓度，ii)至少一部分表达所述PCV2 0RF2蛋白的病毒载体、优选重组杆状病毒，和iii) 一部分细
胞培养上清液。根据PCV2 0RF2蛋白产生和回收方法的ー个具体实施方式
，通过孔径优选约为O. 45-1 μ m的膜过滤细胞培养上清液。因此，另ー方面涉及包含以下组分的免疫原性组合物i)任何上述PCV20RF2蛋白，浓度优选上述浓度，ii)至少一部分表达所述PCV2 0RF2蛋白的病毒载体、优选重组杆状病毒，和iii) 一部分细胞培养上清液；其中约90%的组分大小小于I μ m0 另ー方面，本发明涉及包含以下组分的免疫原性组合物i)任何上述PCV2 0RF2蛋白，浓度优选上述浓度， )至少一部分表达所述PCV2 0RF2蛋白的病毒载体，iii) 一部分细胞培养物，和iv)灭活该重组病毒载体的灭活剂，优选BEI，其中所述组分中约90%的大小小于I μ m。优选地，BEI存在的浓度能有效灭活杆状病毒。有效浓度如上所述。另ー方面，本发明涉及包含以下组分的免疫原性组合物i)任何上述PCV2 0RF2蛋白，浓度优选上述浓度， )至少一部分表达所述PCV2 0RF2蛋白的病毒载体，iii) 一部分细胞培养物，iv)灭活该重组病毒载体的灭活剂，优选BEIjP V)終止灭活剂介导灭活的中和剂，其中所述组分中约90%的大小小于I μ m。优选地，如果灭活剂是BEI，所述组合物包含与BEI等价含量的硫代硫酸钠。将多肽掺入可给予易受PCV2感染的动物的组合物中。在优选形式中，该组合物也可包含本领域技术人员已知的其它组分(也參见《雷明顿药物科学》(Remington’sPharmaceutical Sciences) (1990),第 18 版,Mack Pub I. , Easton)。此外，该组合物可包含一种或多种兽医可接受的载体。本文所用〃兽医可接受的载体〃包括任何和所有溶剂、分散介质、包衣、佐剂、稳定剂、稀释剂、防腐剤、抗菌剂和抗真菌剂、等渗剂、吸收延迟剂等。在一优选实施方式中，该免疫原性组合物包含本文提供的PCV2 0RF2蛋白作为抗原性组分，其浓度优选为上述浓度，将所述组合物与佐剂，优选卡巴浦尔和生理盐水混合。本领域技术人员应理解，本文所述组合物可制成已知的可注射、生理可接受的无菌溶液。对于制备用于胃肠道外注射或输注的即用型溶液而言，易于获得等渗水溶液，如盐水或相应的血浆蛋白质溶液。此外，本发明的免疫原性和疫苗组合物可包含稀释剂、等渗齐U、稳定剂或佐剂。稀释剂可包括水、盐水、右旋糖、こ醇、甘油等。等渗剂可包括氯化钠、右旋糖、甘露醇、山梨糖醇和乳糖等。稳定剂包括白蛋白和こニ胺四こ酸的碱金属盐等。合适的佐剂如上所述。最优选采用卡巴浦尔，具体是采用卡巴浦尔971P，用量优选上述量(如每剂量约500 μ g-5mg,更优选每剂量约750 μ g-2. 5mg,最优选每剂量约Img)。因此，本发明也涉及的免疫原性组合物含有以下组分i)任何上述PCV2 0RF2蛋白，浓度优选上述浓度， )至少一部分表达所述PCV2 0RF2蛋白的病毒载体，iii) 一部分细胞培养物，iv)灭活该重组病毒载体的灭活剂，优选BEI，和V)終止灭活剂介导的灭活作用的中和剂，优选与BEI等价含量的硫代硫酸钠；和vi)合适佐剂，优选上述用量的卡巴浦尔971 ;其中i)_iii)所述组分中约90%的大小小于I μ m。另ー方面，此免疫原性组合物还含药学上可接受的盐，优选生理可接受浓度的磷酸盐。优选将所述免疫原性组合物的pH调整到生理pH，即约6. 5-7.5。因此，本发明涉及的免疫原性组合物，每Iml也含有i)至少Uyg上述PCV20RF2蛋白，ii)至少一部分表达所述PCV20RF2蛋白的杆状病毒，iii) 一部分细胞培养物，
iv)约2-8mM ΒΕΙ, ν)与BEI等价含量的硫代硫酸钠；vi)约Img卡巴浦尔971,和vii)生理上可接受浓度的磷酸盐；其中所述组分中约90%的大小小于I μ m，以及将所述免疫原性组合物的pH调整到约6. 5-7. 5。该免疫原性组合物还可包含一种或多种其它免疫调节剂，如白介素、干扰素或其 它细胞因子。该免疫原性组合物也可含庆大霉素和硫柳汞。虽然本领域技术人员不难确定用于本发明的佐剂和添加剂的用量和浓度，但本发明考虑的组合物包含约50μ g-2000y g佐剂和优选约250μ g/ml剂量的疫苗组合物。在另ー优选实施方式中，本发明考虑的疫苗组合物含有约I P g/ml-60 μ g/ml抗生素,更优选低于约30 μ g/ml抗生素。因此，本发明也涉及含有以下组分的免疫原性组合物i)任何上述PCV2 0RF2蛋白，其浓度优选上述浓度，ii)至少一部分表达所述PCV20RF2蛋白的病毒载体，iii) 一部分细胞培养物，iv)灭活该重组病毒载体的灭活剂，优选BEI，和ν)終止灭活剂介导的灭活作用的中和剂，优选与BEI等价含量的硫代硫酸钠；vi)合适佐剂，优选上述用量的卡巴浦尔971 ；vii)药学上可接受浓度的盐水缓冲液，优选磷酸盐缓冲液，和viii)抗微生物活性剂；其中所述组分中约90%的大小小于I μ m。令人惊讶地发现，本文提供的免疫原性组合物在24个月中非常稳定。也发现本文提供的含有本文所述杆状病毒表达的重组PCV2 0RF2蛋白的免疫原性组合物能非常有效地减轻PCV2感染相关临床症状。令人惊讶地发现，含有本文所述重组杆状病毒表达的PCV20RF2蛋白的的免疫原性组合物比含有完整PCV2病毒灭活形式或分离的病毒PCV2 0RF2抗原的免疫原性组合物更有效。具体说，令人惊讶地发现，重组杆状病毒表达的PCV2 0RF2蛋白在极低浓度，即至多O. 25 μ g/剂量时就有效。加入卡巴浦尔还可进ー步提高PCV2 0RF2蛋白的这种出乎意料的高免疫原性潜能。另ー方面涉及装有至少ー个剂量本文所述PCV2 0RF2蛋白免疫原性组合物的容器，其中一个剂量包含至少2μ gPCV2 0RF2蛋白，优选2-16ygPCV2 0RF2蛋白。所述容器可含有1-250剂量的该免疫原性组合物，优选含有1、10、25、50、100、150、200或250剂量的PCV2 0RF2蛋白免疫原性组合物。优选地，每个容器装有一个剂量以上的PCV2 0RF2蛋白免疫原性组合物，还装有抗微生物活性剤。这些活性剂为(例如)抗生素，包括庆大霉素和硫柳汞等。因此，本发明一方面涉及装有1-250剂量的PCV2 0RF2蛋白免疫原性组合物的容器，其中每个剂量包含至少2 μ gPCV2 0RF2蛋白和庆大霉素和/或硫柳汞，优选约I μ g/ml-60 μ g/ml抗生素,更优选低于约30 μ g/ml。另ー方面涉及ー种药盒，其装有上述容器和说明手册，包括将至少ー个剂量的PCV2 0RF2蛋白免疫原性组合物经肌肉内注射应用于小猪，以减轻PCV2感染相关临床症状的严重性的信息。而且，另一方面，所述说明手册包括第二次或再次给予至少ー个剂量的PCV2 0RF2免疫原性组合物的信息，其中第二次给药或再次给药在初次或前次给药的至少14天后进行。优选地，所述说明手册也包括给予免疫刺激剂的信息。优选地，给予所述免疫刺激剂至少两次。优选地，第一次与第二次或再次给予免疫刺激剂之间间隔至少3天，更优选至少5天，更优选至少7天。优选地，在初次给予PCV2 0RF2蛋白免疫原性组合物至少10天，优选15天，更优选20天，更优选至少22天后给予该免疫刺激剤。优选的免疫刺激剂是(例如)钥孔血蓝素(KLH)，优选用不完全弗氏佐剂(KLH/ICFA)乳化。然而应理解，也可采用本领域技术人员已知的任何其它免疫刺激剤。本文所用“免疫刺激剤”指可触发免疫应答，优选不启动或增强特异性免疫应答，如对某特定病原体的免疫应答的任何物质或组合物。该手册还说明应以合适剂量给予免疫刺激剤。而且，该药盒也可装有容器，包括至少ー个剂量的免疫刺激剂，优选ー个剂量的KLH或KLH/ICFA。而且，也令人惊讶地发现，可通过给予IngelVac PRRS MLV疫苗优选与卡巴浦尔组合进ー步增强含重组杆状病毒表达的PCV2 0RF2蛋白的该免疫原性组合物的免疫原性潜能(參见实施例5)。PRRS感染存在吋，PCV2的临床症状和疾病表现被显著放大。然而，本文所述的免疫原性组合物和疫苗接种方案大大减轻了这种作用，出乎意料。換言之，用本文所述的任何PCV2 0RF2 免疫原性组合物和 Ingelvac PRRS MLV 疫苗(Boehringer Ingelheim)治疗动物、优选猪时，观察到出乎意料的协同作用。因此，本发明另一方面涉及上述药盒，其装有本文所述的PCV2 0RF2免疫原性组合物和说明手册，该说明手册还包括与含PRRS抗原、优选佐剂化PRRS抗原的免疫原性组合物一起给予PCV2 0RF2免疫原性组合物的信息。PRRS抗原优选为IngelVac PRRSMLV (Boehringer Ingelheim)。本发明另一方面也涉及ー种药盒，其包括i)装有至少ー个剂量本文所述PCV20RF2免疫原性组合物的容器，和ii)装有含PRRS抗原、优选佐剂化PRRS抗原的免疫原性组合物的容器。PRRS 抗原优选 IngelVac PRRS MLV (Boehringer Ingelheim)。更优选
地，该药盒还装有说明手册，包括给予药物组合物的信息。优选装有在含PRRS的组合物之前临时给予含PCV2 0RF2的组合物的信息。另ー方面涉及将本文所述任何组合物用作药物，优选用作兽用药物，更优选用作疫苗的应用。而且，本发明也涉及本文所述任何组合物用于制备能减轻PCV2感染相关性临床症状的严重性的药物的应用。优选地，所述药物用于预防PCV2感染，更优选用于小猪。另一方面涉及用于(i)预防PCV2感染或再次感染或(ii)减少或消除PCV2所致对象临床症状的方法，所述方法包括将本文所述任何免疫原性组合物给予需要的对象。所述对象优选猪。优选通过肌肉内给予该免疫原性组合物。优选给予ー个剂量或两个剂量的该免疫原性组合物，其中ー个剂量优选含有至少约2 μ gPCV2 0RF2蛋白，更优选约2_16 μ g和至少约O. l_5mg卡巴浦尔，优选约Img卡巴浦尔。另ー方面涉及上述治疗方法，包括第二次给予该免疫原性组合物。优选用含有相同量的PCV2 0RF2蛋白的免疫原性组合物进行第二次给药。第二次给药也优选通过肌肉内给予。优选地，在首次给药至少14天后，更优选在首次给药至少4周后完成第二次给药。另ー方面，所述治疗方法也包括给予免疫刺激剤。优选地，至少给予所述免疫刺激剂两次。优选地，第一次和第二次给予免疫刺激剂之间间隔至少3天，更优选至少5天，更优选至少7天。优选地，在初次给予PCV2 0RF2免疫原性组合物至少10天，优选15天，更优选20天，更优选至少22天后给予免疫刺激剤。优选的免疫刺激剂是(例如)钥孔血蓝素(KLH)，优选用不完全弗氏佐剂(KLH/ICFA)乳化。然而应理解，也可采用本领域技术人员已知的任何其它免疫刺激剤。本领域技术人员通常知道给予免疫刺激剂的合适剂量。另ー方面，上述治疗方法也包括给予PRRS抗原。PRRS抗原优选丨nyclVaW PRRSMLV(Boehringer Ingelheim)。优选在给予PCV2 0RF2蛋白免疫原性组合物之前临时给予所述PRRS抗原。


图I是PCV2 0RF2重组杆状病毒的优选构建过程流程图；和图2a和2b是如何产生本发明组合物的流程图。
具体实施例方式以下实施例列出了本发明的优选材料和方法。然而应理解，仅以说明方式提供这些实施例，不应认为其中有任何内容限制了本发明的整体范围。实施例I本实施例比较了用本发明方法与现有技术已知方法获得的0RF2相对产率。在四个IOOOmL转瓶各接种300mL昆虫无血清培养基Excell 420 (JRH Biosciences, Inc.,Lenexa, KS)，含有约I. OxlO6Sf+细胞/ml的细胞悬液。该主细胞培养物称为SF+(草地夜蛾(Spodoptera frugiperda))主细胞母液,第19代，批号N112-095W。用于产生该SF+主细胞母液的细胞获自 Protein Sciences Corporation, Inc. ,Meriden,CT0 此实施例的 SF+细胞系限定在第19和59代之间。其它代次将用于本发明目的，但为了将该方法扩大为大规模生产，可能需要传代至少19代，超过59代可能影响表达，但并未就此进行研究。更详细说，在无菌转瓶中，用Excell 420培养基悬浮培养从液氮储存取出的初始SF+细胞培养物，其间恒速振荡。在含有25-150mL Excell 420无血清培养基的100mL_250mL转瓶中培养该培养物。当细胞倍增至细胞密度为I. 0-8. OX IO6个细胞/mL吋，将它们分接种至新容器中，接种密度为0. 5-1. 5X IO6个细胞/mL。在体积高达36升的转瓶或高达300升的不锈钢生物反应器中25-29°C培养基序扩增培养物2-7天。接种后，27°C培育转瓶4小吋。然后，用含有PCV2 0RF2基因(SEQ ID NO 4)的重组杆状病毒接种各转瓶。如下所述产生含有PCV2 0RF2基因的重组杆状病毒PCR扩增PCV2北美毒株的PCV2 0RF2基因，其含有5’ Kozak序列(SEQ ID NO 1)和3’ EcoRl位点(SEQ ID NO 2),将其克隆入pGEM-T-Easy载体(Promega,威斯康星州麦迪逊)。然后，切下该基因并亚克隆入转运载体 pVL1392 (BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA)中。本文中该亚克隆部分由SEQ ID NO 7代表。将含有PCV20RF2基因的pVL1392质粒命名为N47-064Y,然后与BaculoGoid (BDBiosciences Pharmingen)杆状病毒 DNA 共转染入 SF+昆虫细胞(Protein Sciences, Meriden, CT)中，产生含有PCV20RF2基因的重组杆状病毒。本文所述的新构建物为SEQ ID N0:8。将含有PCV20RF2基因的重组杆状病毒经噬斑纯化(plaque-purified)，在SF+细胞系上增殖主种子病毒(MSV)，分成等分，并储存于_70°C。用杆状病毒特异性引物作PCR-RFLP，MSV经鉴定为阳性PCV20RF2杆状病毒。经间接荧光抗体试验的多克隆血清或单克隆抗体检测，用PCV20RF2杆状病毒感染的昆虫细胞产生的MSV或工作种子病毒表达PCV20RF2抗原。此外，通过N-末端氨基酸测序确认了对PCV2 0RF2杆状病毒的鉴定。也按照9C. F. R. 113. 27(c)、113. 28，和113. 55检测PCV2 0RF2杆状病毒MSV的纯度。接种到转瓶中的各重组杆状病毒具有不同的感染复数(MOI)。用7. 52mLO. 088M0I接种转瓶I ;用3. OlmL O. 36M0I接种转瓶2 ;用I. 5mL O. 18M0I接种转瓶3 ;用O. 75mL O. 09M0I接种转瓶4。本文提供的图I是说明用于构建PCV20RF2重组杆状病毒的基本步骤的流程图。接种杆状病毒后，27±2°C培育该转瓶7天，该期间也以IOOrpm振荡。该转瓶采用通风盖子允许空气流动。在接下来的7天中，每24小时各瓶取样。提取后，离心各样品，分离沉淀和上清液，然后通过O. 45-1. O μ m孔径滤膜进行微量过滤。得到的样品中所含0RF2量通过ELISA试验定量。用O. 05M碳酸盐缓冲液(pH9. 6) 1:6000稀释经蛋白G纯化的捕获抗体猪抗-PCV2Pab IgG (用PBS以1:250稀释)进行ELISA试验。然后，将IOOyL抗体加入微量滴定板诸孔中，密封，37°C培育过夜。然后用含 O. 5mL 吐温 20 (Sigma, St. Louis,MO)、IOOmL IOX D-PBS (Gibco Invitrogen,加利福尼亚州卡尔斯巴德)和899. 5mL蒸馏水的洗涤溶液洗涤该平板三次。然后，将250 μ L封闭溶液(用蒸馏水将IOmL D-PBS QS稀释至IOOmL,其中溶解5g Carnation脱脂奶粉(Nestle，Glendale，CA))加入各孔中。下ー步骤是洗涤该测试平板，然后加入预先稀释的抗原。通过将200 μ L稀释剂溶液(999. 5mL D-PBS中加入0. 5mL吐温20)加入稀释平板上的各孔中，产生预先稀释的抗原。然后，以1:240和1:480稀释样品，然后将IOOyL各稀释样品加入稀释平板上最上面的孔中(即ー个最上面孔接受100 μ L 1:240稀释样品，其它孔接受100 μ L 1:480稀释样品)。然后在该平板的其余部分孔中进行连续稀释从各孔中取出100 μ L，连续转入平板的下ー个孔中。各孔在先混合再进行下一次转移。测试平板的洗涤包括用洗涤缓冲液洗涤平板三次。然后密封该平板，37°C培育I小时，然后用洗涤缓冲液洗涤三次或更多次。所用检测抗体是PCV 0RF2的单克隆抗体。用稀释剂溶液1:300稀释，然后将100 μ L稀释的检测抗体加入各孔。然后密封平板，37°C培育I小时，然后用洗涤缓冲液洗漆三次。然后，将正常兔血清(Jackson Immunoresearch,West Grove,PA)加入稀释剂溶液至1%浓度制备偶联物稀释剂。用偶联物稀释剂以1:10，000稀释偶联抗体山羊抗小鼠(H+l) -HRP (Jackson Immunoresearch)。然后，将100 μ L稀释的偶联抗体加入各孔中。然后密封该平板，37°C培育45分钟，然后用洗涤缓冲液洗涤三次。将100 μ L底物(TMB过氧化物酶底物，Kirkgaard 和 Perry Laboratories (KPL), Gaithersberg,MD)与等体积过氧化物酶底物B(KPL)混合，加入各孔中。室温培育该平板15分钟。然后，将IOOyL IN HCL溶液加入所有孔中终止反应。然后，通过ELISA阅读器读数。该试验的结果见下表I:表I
权利要求
1.一种回收PCV2的开放阅读框2表达的重组蛋白的方法，所述方法包括以下步骤 A)将所述PCV2的重组开放阅读框2克隆入转运载体中； B)将所述转运载体中含有所述重组开放阅读框2的部分转染入病毒中； C)用所述病毒感染培养基中的细胞； D)使所述病毒由所述开放阅读框2表达所述蛋白； E)分离细胞与上清液中的所述载体；和 F)回收所述上清液中所述开放阅读框2表达的蛋白。
2.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所述方法还包括由PCV2毒株扩增所述开放 阅读框2，然后将所述开放阅读框克隆入所述转运载体的步骤。
3.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所述重组开放阅读框2还包含选自5' Kozak序列、3' EcoRl位点的序列或其组合。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述5'Kozak序列包含SEQ ID NO :1。
5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述3'EcoRl位点包含SEQ ID NO :2。
6.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所述PCV2开放阅读框包含SEQIDNO :4。
7.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所述重组蛋白包含SEQID N0:6。
8.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所述培养基包括无血清昆虫细胞培养基。
9.如权利要求I所述的方法，还包括以下步骤 i)在步骤A之前，将所述扩增的开放阅读框2克隆入第一载体； ii)从所述第一载体上切下所述开放阅读框2;和 iii)将所述切下的开放阅读框2用于步骤A。
10.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所述细胞包括SF+细胞。
11.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所述病毒包括杆状病毒。
12.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所述转染部分包括SEQID N0:4。
13.如权利要求I所述的方法，其特征在于，用所述病毒感染细胞至少5天后回收所述上清液中的所述开放阅读框2蛋白。
14.一种制备引发对PCV2免疫应答的组合物的方法，所述方法包括以下步骤 i)将一构建物转染入病毒中,所述构建物包含PCV2开放阅读框2的重组DNA； ii)用所述转染的病毒感染细胞，在生长培养基中培养所述细胞； iii)使所述病毒由所述开放阅读框2表达所述重组蛋白； iv)回收上清液中所述表达的开放阅读框2蛋白；和 v)将所述回收蛋白与合适佐剂或其它药学上可接受的运载体或赋形剂混合。
15.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述方法还包括由转运载体中获得所述构建物的步骤。
16.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述方法还包括由PCV2毒株扩增所述开放阅读框2，然后将所述开放阅读框2克隆入所述转运载体的步骤。
17.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述重组开放阅读框2还包含选自5' Kozak序列、3' EcoRl位点的序列或其组合。
18.如权利要求17所述的方法，其特征在于，所述5'Kozak序列包含SEQ ID NO :1。
19.如权利要求17所述的方法，其特征在于，所述3'EcoRl位点包含SEQ ID NO :2。
20.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述PCV2开放阅读框2包含SEQID NO:4。
21.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述重组蛋白包含SEQID NO:6。
22.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述培养基包括无血清昆虫细胞培养基。
23.如权利要求16所述的方法，还包括以下步骤 i)将所述扩增的开放阅读框2克隆入第一载体中； ii)从所述第一载体上切下所述开放阅读框2;和 iii)用所述切下的开放阅读框2克隆入所述转运载体中。
24.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述细胞包括SF+细胞。
25.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述病毒包括杆状病毒。
26.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述转染构建物包含SEQID N0:4。
27.如权利要求14所述的方法，其特征在于，用所述病毒感染所述细胞至少5天后回收所述开放阅读框2蛋白。
28.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述回收步骤还包括使所述培养基与所述细胞和细胞碎片相分离的步骤。
29.如权利要求28所述的方法，其特征在于，所述分离步骤包括通过孔径范围约0.45 u M-1. OuM的滤器过滤所述细胞、细胞碎片和生长培养基的步骤。
30.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述方法还包括灭活所述病毒，然后将所述回收的蛋白质与合适佐剂混合的步骤。
31.一种回收PCV2开放阅读框2表达的蛋白的方法，所述方法包括以下步骤 i)用含有所述开放阅读框2的重组病毒载体感染培养基中生长的细胞； ii)使所述载体表达所述蛋白；和 iii)回收上清液中表达的所述蛋白。
32.如权利要求31所述的方法，其特征在于，所述回收在用所述病毒载体感染所述细胞至少5天后进行。
33.一种用权利要求1、14、31所述方法或其组合获得的组合物。
34.权利要求33所述组合物作为药物的应用。
35.权利要求33所述组合物在制备预防PCV2感染的药物中的应用。
36.一种生产检测样品中PCV2感染的诊断试剂盒的方法，所述方法包括 i)用权利要求1、14、31所述方法或其组合产生重组蛋白； ii)和将所述重组蛋白包装到合适容器中。
37.如权利要求36所述的方法，还包括在包装所述重组蛋白的容器中加入说明手册的步骤。
38.一种包含PCV20RF2蛋白或其免疫原性部分的免疫原性组合物，它能有效降低PCV2感染相关临床症状的严重性，其中，所述免疫原性部分含有PCV20RF2蛋白的至少10个毗连氨基酸。
39.如权利要求38所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述PCV20RF2蛋白是 i)含有选自序列 SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO :10 或 SEQ IDNO 11序列的多妝；ii)与i)所述多肽至少80%同源的任何多肽， iii)i)和/或ii)所述多肽的任何免疫原性部分， iv)iii)所述的免疫原性部分，其含有SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:9、SEQID NO :10或SEQ ID NO :11序列中的至少10个毗连氨基酸 v)由含SEQID NO 3或SEQ ID NO 4序列的DNA所编码的任何多肽。
vi)由与V)所述多核苷酸至少80%同源的多核苷酸所编码的任何多肽， vii)由V)和/或vi)所述多核苷酸编码的多肽的任何免疫原性部分， viii)vii)所述的免疫原性部分，其中编码所述免疫原性部分的多核苷酸包含SEQIDNO 3或SEQ ID NO 4序列中所含的至少30个毗连核苷酸。
40.如权利要求38所述的免疫原性组合物，还包含灭活的病毒载体和细胞培养物上清。
41.如权利要求40所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述灭活的病毒载体是编码PCV20RF2蛋白的重组杆状病毒。
42.如权利要求40所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述组合物包含BEI。
43.如权利要求42所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述组合物包含硫代硫酸钠。
44.如权利要求39所述的免疫原性组合物，包含选自下组的其它成分运载体、佐剂、培养基、病毒灭活剂、稀释剂、等渗剂、免疫调节剂、抗生素和其组合。
45.如权利要求44所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述组合物含有佐剂，优选卡巴浦尔。
46.如权利要求45所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述组合物含有药学上可接受的盐，优选盐水。
47.如权利要求38所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述组合物含有至少0.2mcg/ml PCV20RF2 蛋白。
48.如权利要求38所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述组合物含有至少.2u gPCV20RF2 蛋白。
49.一种容器，其装有至少一个剂量权利要求38所述免疫原性组合物，其中一个剂量包含至少2 u gPCV20RF2蛋白。
50.—种容器，其装有10-250个剂量权利要求38所述免疫原性组合物，其中一个剂量包含至少2 u gPCV20RF2蛋白。
51.如权利要求49所述的容器，还装有抗微生物活性剂。
52.一种药盒，其装有权利要求49所述容器和说明手册，所述说明手册包括将至少一个剂量的所述免疫原性组合物经肌肉内注射应用于小猪，以减轻PCV2感染相关临床症状严重性的信息。
53.如权利要求52所述的药盒，其特征在于，所述说明手册包括第二次或再次给予至少一个剂量的所述免疫原性组合物的信息，所述第二次给药或再次给药在最后一次给药前至少14天进行。
全文摘要
本发明提供了回收2型猪圆环病毒开放阅读框2表达的蛋白质的改进方法。该方法通常包括以下步骤将含有开放阅读框2编码序列的重组病毒转染到培养基中生长的细胞中，使该病毒表达开放阅读框2，回收上清液中表达的蛋白质。应该在感染细胞约5天后开始回收，以表达足量的重组蛋白表达并从细胞分泌到生长培养基中。这种方法避免了分离和回收细胞内重组蛋白所需的昂贵和耗时的提取步骤。
文档编号A61P31/20GK102660578SQ201210137320
公开日2012年9月12日 申请日期2005年12月29日 优先权日2004年12月30日
发明者G·尼策尔, M·艾希梅厄, M·谢弗 申请人:勃林格殷格翰动物保健有限公司