专利名称：叶酸偶联壳聚糖川芎嗪纳米粒制剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种MDR逆转剂，尤其是一种可提高川芎嗪对肿瘤细胞的聚集浓度、降低对正常细胞分布的叶酸偶联壳聚糖)I丨芎嗪纳米粒制剂。
背景技术：
多药耐药(multidrug resistance,MDR)现象可严重妨碍肿瘤的化疗效果。MDR由多种机制引发，最具代表性的是由于耐药细胞表面P-gp、多药耐药相关蛋白等跨膜蛋白的高表达所形成的外排泵，使细胞内化疗药物外排所造成的。MDR的产生不仅保护了肿瘤细胞，所排出的化疗药还增加了对正常组织的损伤。研究表明，具有钙离子通道拮抗作用的部
分天然药物成分如川芎嗪、丹参酮IIA、苦参碱、去甲斑蝥素等具有MDR逆转作用，尤其川芎嗪逆转MDR的作用非常突出。尽管川芎嗪能显著增加化疗药物的敏感性，但目前却难以广泛应用于临床，主要原因是缺少良好的给药载体，致使川芎嗪在体内广泛分布，增加了对正常人体细胞的损伤，不良反应发生率较高。
发明内容
本发明是为了解决现有技术所存在的上述技术问题，提供一种可提高川芎嗪对肿瘤细胞的聚集浓度、降低对正常细胞分布的叶酸偶联壳聚糖川芎嗪纳米粒制剂。本发明的技术解决方案是一种叶酸偶联壳聚糖川芎嗪纳米粒制剂，其特征在于依次按如下方法制备
a.将壳聚糖分子量降解至5万道尔顿；
b.磁力搅拌条件下，将所得分子量为5万道尔顿的壳聚糖与叶酸偶联，得叶酸壳聚糖偶联物；
c.在室温下，将所得叶酸壳聚糖偶联物溶于浓度为1%的醋酸溶液中，制得2mg/ml的叶酸壳聚糖醋酸溶液15ml,将18mg川弯嗪溶于叶酸壳聚糖醋酸溶液中，200 rpm/min磁力搅拌下，滴加5ml浓度为0. 6 mg/ml的多聚磷酸钠水溶液,滴加完毕后，继续磁力搅拌30min,即得叶酸偶联壳聚糖川弯嗪纳米粒的混悬液；
d.将所制备的混悬液4°C下32900 rpm/min离心30min,离心后弃上清,收集沉淀，分散在去离子水中，加冻干保护剂，_48°C预冻12h，冷冻干燥机中冻干，即得叶酸偶联壳聚糖川芎嗪纳米粒的粉末。所述a步骤是将壳聚糖加入到1%醋酸溶液中，搅拌使之溶解，制得200mg/100ml壳聚糖醋酸液，过滤除去不溶性杂质，60°C磁力搅拌下加入过量的双氧水至2小时，用NaOH调PH值至产生白色沉淀，过滤收集白色沉淀，用去离子水洗至中性，无水乙醇浸泡2h，抽滤沉淀并在常温下干燥，即制得分子量为5万道尔顿的壳聚糖。所述b步骤是称取150mg叶酸，用DMSO溶解，再加入150mg脱水缩合剂，25°C避光搅拌I小时，即得红棕色的叶酸活性酯的DMSO溶液；称取IOOmg分子量为5万的壳聚糖溶解于醋酸-醋酸钠缓冲液(PH5)中，并在磁力搅拌条件下缓慢加入叶酸活性酯的DMSO溶液中，30°C下避光反应过夜，然后用NaOH调pH至橘红色沉淀析出，上述叶酸与壳聚糖用量的摩尔比为170 1 ;将上一步的混合液及橘红色沉淀一同装入透析袋中，先于pH 7. 4的磷酸盐缓冲液中透析3天，然后再于去离子水溶液中透析3天；将透析袋内的混合液全部转移至西林瓶中，_48°C预冻12h，冷冻干燥机中冻干，即得叶酸壳聚糖偶联物。壳聚糖(CMC)具有生物可降解性、生物相容性、低毒性、良好的粘附性和成膜能力等特点；叶酸受体(FA)是一种糖蛋白受体，在正常组织中的表达高度保守，而在许多肿瘤细胞如Hela、MCF-7等呈过渡表达。本发明是将叶酸偶联壳聚糖并以此作为载体包载川芎嗪，制成MDR逆转剂，具有主动靶向性强等特点，可对靶组织(肿瘤细胞)高浓度聚集，减小对正常组织的毒副作用，延长药物作用时间，减少给药次数。
图I :降解时间与壳聚糖分子量(n=3)的关系不意图。图2 :高、低分子量壳聚糖红外扫描图谱。 图3 :叶酸壳聚糖、壳聚糖、叶酸红外扫描图谱。图4 :叶酸壳聚糖1H-核磁共振扫描图谱。图5 :叶酸偶联壳聚糖川弯嗪纳米粒粒径大小及分布示意图。图6 :叶酸偶联壳聚糖川芎嗪纳米粒透射电镜图。图7 :川芎嗪溶液与叶酸偶联壳聚糖川芎嗪纳米粒体外释放累积曲线。图8 :激光共聚焦显微镜观察细胞对样品中川芎嗪的摄取图。图9 :本发明实施例纳米粒的体外靶向作用示意图。
具体实施例方式本发明实施例依次按a、b、C、d步骤制备
a.将壳聚糖分子量降解到5万道尔顿，具体做法是将壳聚糖加入到1%醋酸溶液中，搅拌使之溶解，制得200mg/100ml壳聚糖醋酸液，过滤除去不溶性杂质，60°C磁力搅拌下加入过量的双氧水至2小时，用NaOH调pH值至10左右，得到白色沉淀，过滤收集白色沉淀，用去离子水洗至中性，无水乙醇浸泡2h，抽滤沉淀并在常温下干燥，即制得分子量为5万道尔顿的壳聚糖。采用粘度法测定各降解时间壳聚糖的粘均分子量(#,)，以0. I mo I L^1CH3CO2Na和0. 2 mo I L-1CH3COOH为溶剂，将不同降解时间的壳聚糖配制成一定浓度的溶液，在30°C恒温水浴条件下，用乌氏粘度计测定各样品的分子量。壳聚糖的分子量与降解时间的相关性见图1，当降解2h时，壳聚糖的分子量降解到5万。分别取干燥的壳聚糖及降解的壳聚糖样品适量，与KBr粉末混研压片，然后在红外光谱仪中进行分析，分辨率为2cm—1，红外图谱见图2，a，b分别是壳聚糖与降解壳聚糖的红外光谱图，从图2中可以看出a，b两个红外光谱图基本一样，说明壳聚糖经双氧水降解后，结构基本不发生变化，仅分子量降低。b.磁力搅拌条件下，将所得分子量为5万道尔顿的壳聚糖与叶酸偶联，得叶酸壳聚糖偶联物，具体做法是称取150mg叶酸，用IOml的DMSO溶解，再加入150mg脱水缩合剂(I-乙基-3- (3—二甲氨丙基)碳二亚胺盐酸盐)，25°C避光搅拌I小时，即得红棕色的叶酸活性酯的DMSO溶液；称取IOOmg分子量为5万的壳聚糖溶解于醋酸-醋酸钠缓冲液(pH5)中，并在磁力搅拌条件下缓慢加入叶酸活性酯的DMSO溶液中，30°C下避光反应过夜，然后用NaOH调pH至10左右，有橘红色沉淀析出；将上一步的混合液及橘红色沉淀一同装入透析袋中，先于PH 7. 4的磷酸盐缓冲液中透析3天，然后再于去离子水溶液中透析3天；将透析袋内的混合液全部转移至西林瓶中，_48°C预冻12h，冷冻干燥机中冻干，即得叶酸壳聚糖偶联物。化学反应方程式如下
权利要求
1.一种叶酸偶联壳聚糖川芎嗪纳米粒制剂，其特征在于依次按如下方法制备 a.将壳聚糖分子量降解至5万道尔顿； b.磁力搅拌条件下，将所得分子量为5万道尔顿的壳聚糖与叶酸偶联，得叶酸壳聚糖偶联物； c.在室温下，将所得叶酸壳聚糖偶联物溶于浓度为1%的醋酸溶液中，制得2mg/ml的叶酸壳聚糖醋酸溶液15ml,将18mg的川弯嗪溶于叶酸壳聚糖醋酸溶液中，200 rpm/min磁力搅拌下，滴加5ml浓度为0. 6 mg/ml的多聚磷酸钠水溶液,滴加完毕后，继续磁力搅拌30min,即得叶酸偶联壳聚糖川弯嗪纳米粒的混悬液； d.将所制备的混悬液4°C下32900rpm/min离心30min,离心后弃上清,收集沉淀，分散在去离子水中，加冻干保护剂，_48°C预冻12h，冷冻干燥机中冻干，即得叶酸偶联壳聚糖川芎嗪纳米粒的粉末。
2.根据权利要求I所述的叶酸偶联壳聚糖川芎嗪纳米粒制剂，其特征在于所述a步骤是将壳聚糖加入到1%醋酸溶液中，搅拌使之溶解，制得200mg/100ml壳聚糖醋酸液，过滤除去不溶性杂质，60 0C磁力搅拌下加入过量的双氧水至2小时，用NaOH调pH值至产生白色沉淀，过滤收集白色沉淀，用去离子水洗至中性，无水乙醇浸泡2h，抽滤沉淀并在常温下干燥，即制得分子量为5万道尔顿的壳聚糖。
3.根据权利要求I或2所述叶酸偶联壳聚糖川芎嗪纳米粒制剂，其特征在于所述b步骤是称取150mg叶酸，用IOmlDMSO溶解，再加入150mg脱水缩合剂，25°C避光搅拌I小时，即得红棕色的叶酸活性酯的DMSO溶液；称取IOOmg分子量为5万的壳聚糖溶解于醋酸-醋酸钠缓冲液(PH5)中，并在磁力搅拌条件下缓慢加入叶酸活性酯的DMSO溶液中，30°C下避光反应过夜，然后用NaOH调pH至橘红色沉淀析出，上述叶酸与壳聚糖用量的摩尔比为170 1 ;将上一步的混合液及橘红色沉淀一同装入透析袋中，先于pH 7.4的磷酸盐缓冲液中透析3天，然后再于去离子水溶液中透析3天；将透析袋内的混合液全部转移至西林瓶中，_48°C预冻12h，冷冻干燥机中冻干，即得叶酸壳聚糖偶联物。
全文摘要
本发明公开一种可提高川芎嗪对肿瘤细胞的聚集浓度、降低对正常细胞分布的叶酸偶联壳聚糖川芎嗪纳米粒制剂，依次按如下方法制备将壳聚糖分子量降解至5万道尔顿，与叶酸偶联，得叶酸壳聚糖偶联物；在室温下，将所得叶酸壳聚糖偶联物溶于的醋酸溶液中，制得叶酸壳聚糖醋酸溶液，将川芎嗪溶于叶酸壳聚糖醋酸溶液中，磁力搅拌下，滴加浓度为0.6mg/ml的多聚磷酸钠水溶液，滴加完毕后，继续磁力搅拌30min，即得叶酸偶联壳聚糖川芎嗪纳米粒的混悬液；将所制备的混悬液离心后收集沉淀，冻干。
文档编号A61P35/00GK102716088SQ20121020667
公开日2012年10月10日 申请日期2012年6月21日 优先权日2012年6月21日
发明者程荔春, 范青, 马辉 申请人:大连医科大学附属第二医院