专利名称：淫羊藿苷在制备治疗帕金森病的药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及药学领域，尤其是一种淫羊藿苷在制备治疗帕金森病的药物中的应用。
背景技术：
随着现代社会人ロ的老龄化，发病与年龄密切相关的神经退行性疾病越来越引起人们的重视。帕金森病是以运动迟缓、静止性震颤和肌强直为主要临床表现，其主要病理特征为中脑黑质致密部多巴胺能神经元变性损伤、纹状体投射纤维丧失、胶质细胞增生以及胞浆内出现嗜酸性包涵体一路易小体的形成。临床上，现有的治疗仍以多巴胺替代疗法为 主，其仅能够控制帕金森病的临床症状，却不能够阻止病情的进展。尽管大量的研究表明氧化应激、线粒体功能障碍、凋亡机制的启动、环境因素，如病毒感染、脑外伤和接触农药等都与帕金森病的病理过程密切相关。但迄今为止，帕金森病的病理生理学机制尚不完全清楚。近年来越来越多的动物实验和临床研究发现胶质细胞(特别是小胶质细胞)介导的神经炎症反应在帕金森病的发生发展过程中起到非常重要的作用。小胶质细胞，脑内常驻的免疫细胞，是机体抵御损伤和感染的第一道防线。在生理情况下，它主要起到免疫监视、免疫防御和组织修复作用。当脑细胞损伤或受到炎性刺激吋，小胶质细胞能够被激活从而释放大量的炎性因子和细胞毒性物质，这些毒性介质的不断产生和积累从而决定了周围多巴胺能神经元的存活。然而，受损的多巴胺能神经元同时可以释放多种神经毒性物质，这些神经毒性物质的不断增多又能够进ー步诱导小胶质细胞的再次激活，激活的小胶质细胞又可以释放神经毒性物质。因此，受损的多巴胺能神经元和激活的小胶质细胞之间构成了ー种“自我驱动”的恶性循环，尤其是对帕金森病的发生和发展发挥关键作用。此外，对帕金森病患者的尸检发现，在成熟的中枢神经系统中，小胶质细胞的分布不均匀，中脑黑质部位的小胶质细胞尤其丰富。这ー特点构成了小胶质细胞激活介导多巴胺能神经元变性死亡的解剖学基础。上述依据提示，神经炎症反应在帕金森病的发生发展过程中起到极其关键的作用。因此，通过抑制小胶质细胞介导的神经炎症反应将为创新药物的研发提供新的理论支持和研究思路。目前临床上常用的留体类和非留体类抗炎药尽管可以减少多巴胺能神经元的变性损伤，但长期使用的毒副作用限制了其临床应用。因此，利用我们国家丰富的中草药有效成分寻找针对小胶质细胞介导的神经炎症反应的药物对帕金森病的治疗具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种淫羊藿苷在制备治疗帕金森病的药物中的应用，它的治疗效果好，以克服现有技术的不足。本发明是这样实现的淫羊藿苷在制备治疗帕金森病的药物中的应用。淫羊藿苷(Icariin, ICA ；分子式C33H4tlO15 ;分子量676. 65),是小檗科淫羊藿Wpimedium L.)属植物中提取的有效成分，是ー种黄酮醇类化合物，为中药中提取的单体化合物。现有的研究已经发现，淫羊藿苷具有抗肿瘤、增强免疫、改善心脑血管、调节内分泌、抗炎、抗氧化以及抗衰老等作用。通过研究，发明人发现，淫羊藿苷对抑制小胶质细胞介导的神经炎症有显著作用，进而抑制多种炎症介质的释放，从而对帕金森病发挥重要的保护作用。应用淫羊藿苷的机理
淫羊藿苷具有抗炎作用；淫羊藿苷能够通过血脑屏障；淫羊藿苷通过抑制氧化应激反应对脑缺血-再灌注损伤具有明显的保护作用；淫羊藿苷能够保护神经元免受缺氧缺糖诱导的神经损伤；淫羊藿苷明显抑制β淀粉样沉淀(Αβ )对神经元造成的损伤；淫羊藿苷可以抑制神经炎症介质的产生，从而改善神经炎症反应诱导的大鼠学习记忆減退。本发明首先从整体实验角度，通过免疫组织化学染色和细胞计数等方法验证淫羊藿苷能够保护多巴胺能神经元并且抑制小胶质细胞的激活，从而证明淫羊藿苷对帕金森病 具有治疗作用；其次，从整体到离体细胞水平，在基因、蛋白、细胞多个层面研究抑制小胶质细胞介导的神经炎症反应在淫羊藿苷保护多巴胺能神经元中发挥的作用，进而证明淫羊藿苷是具有临床应用价值的治疗帕金森病的药物。实验I :整体动物实验证明淫羊藿苷对帕金森病具有治疗作用 一、实验目的
实验通过大鼠中脑黑质直接注射脂多糖诱导帕金森病模型，观察淫羊藿苷对帕金森病模型的保护作用以及对小胶质细胞激活的抑制作用。ニ、实验方法
雄性SD大鼠(体重200 250g)，采用大鼠中脑黑质内直接注射脂多糖(LPS)制备帕金森病动物模型，每天灌胃给予一次淫羊藿苷(ICA)，连续给予12周；空白组和模型组灌胃给予等体积的蒸馏水。灌胃结束后第2天进行免疫组织化学染色。实验随机分为3组①空白组，②模型组(LPS)，③ LPS+ICA (80 mg/kg/d)组。模型的建立将大鼠麻醉后固定在大鼠脑立体定位仪上。在无菌操作下将LPS注入大鼠黑质上缘。相应脑内立体定位的坐标为前囱后4. 8 mm,中线旁1.7 mm,颉骨腹侧8. 2 mm0
免疫组织化学染色将大鼠麻醉并经心脏依次灌流生理盐水和4%预冷的多聚甲醛。取全脑组织并将其保存在4%多聚甲醛溶液中，2天之后用含30%蔗糖的PBS进行固定，待脑组织下沉后，用冰冻切片机切取35 μ m厚的冠状黑质脑片进行免疫组织化学染色，多巴胺能神经元采用抗酪氨酸羟化酶(TH)抗体进行染色。三、实验结果
淫羊藿苷对大鼠中脑黑质内直接注射LPS诱导的多巴胺能神经元变性损伤的保护作
用
采用多巴胺能(DA)神经元特征性抗体一抗酪氨酸羟化酶(TH)抗体进行免疫组织化学染色和细胞计数结果所示(图I):与空白组比较，LPS组的黑质内DA神经元的树突明显缺失，DA神经元数量明显減少；与LPS组比较，淫羊藿苷(ICA)能够拮抗LPS引起的DA神经元变性损伤。实验2 :离体细胞实验证明淫羊藿苷抑制小胶质细胞激活以及減少炎症介质释放从而对帕金森病产生保护作用 一、实验目的
实验通过大鼠原代小胶质细胞培养模型，观察淫羊藿苷对小胶质细胞激活以及释放炎症介质的抑制作用。ニ、实验方法
大鼠原代小胶质细胞培养无菌操作条件下取出出生后I天的SD大鼠幼鼠的全脑，置于DMEM/F12培养液中。除去嗅球和小脑，其余部分在剥除脑膜后进行机械吹打以分离细胞。400 g离心10分钟，弃上清，将细胞重悬在含有胎牛血清的DMEM/F12培养液中，以5^7 X IO7个细胞接种到面积为175 cm2的培养瓶中。每4天更换一次培养液，培养至14天后，星形胶质细胞长满整个培养瓶底部，小胶质细胞附着在星形胶质细胞层的表面。将培养瓶置于细胞振荡器上，180 rpm振摇I小时可使小胶质细胞脱离于星形胶质细胞而悬浮在培养液中。收集细胞悬液，弃上清，将小胶质细胞按5X IO5 /孔的密度分别接种于24孔中用于细胞相关指标的检测。
蛋白免疫印迹试验(Western Blot assay):细胞经过药物处理后，先加入1%NP-40的细胞裂解液裂解细胞，冰上放置30分钟，收集细胞裂解液，然后150000 g离心30分钟，取上清，得到的蛋白以BCA法进行蛋白定量后放置于-80°C冰箱贮存备用。灌制10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶，常规电泳，转膜，采用5%非脂牛奶封闭。ー抗4°C孵育过夜，ニ抗室温孵育I小时，最后经ECL显色,曝光。实时荧光RT-PCR :先用Trizol从细胞中提取总RNA，利用RNA纯化柱进ー步纯化。用紫外分光光度仪检测RNA纯度。采用MMLV反转录酶制备cDNA。通过实时荧光进行PCR扩增。酶联免疫吸附试验(ELISA):将试剂盒中的Capture抗体用PBS进行稀释，然后加入到ELISA专用96孔板中，室温过夜。第2天，先用含PBS和O. 05% Tween 20的缓冲液漂洗3次，再用含1%BSA的封阻液封阻I小吋。缓冲液漂洗3次，将待测样品稀释3倍加入96孔板中，室温下孵育2小时，之后用缓冲液漂洗3次，加入检测抗体孵育2小吋，缓冲液漂洗3次，加入生物素蛋白标记的过氧化物酶室温下孵育20分钟，再用缓冲液漂洗3次，加入显色液，置于室温下20分钟。最后，加硫酸終止反应，通过分光光度计读取波长450 nm处的吸收值。三、实验结果
I、淫羊藿苷对LPS诱导的小胶质细胞激活的抑制作用
采用小胶质细胞特异性抗离子钙接头蛋白抗体(Iba-I)进行蛋白免疫印迹检测(Western Blot assay),将所得的结果通过AlphaImager 2200软件进行密度分析。结果如图2所示,与空白对照组比较,经过LPS (10 Pg/ml)处理I天,Iba-I的表达明显增加；与LPS组比较，淫羊藿苷(ICA，80 μ mol/L)能够明显抑制小胶质细胞的激活。2、淫羊藿苷对小胶质细胞内炎症因子mRNA表达的影响
如图3所示，与空白组比较，LPS (10 μ§Μ)明显增加小胶质细胞内TNFa和IL-I β mRNA的表达。与LPS组比较，淫羊藿苷(ICA，80 ymol/L)能够抑制LPS弓丨起的炎症因子mRNA的过度表达。3、淫羊藿苷对炎症因子蛋白水平的影响原代细胞经过LPS处理之后，收集细胞培养上清液分别检测上清液中TNF α和IL-I β的蛋白含量。与mRNA检测结果相似，如图4所示，与空白组比较，LPS (10 Pg/ml)明显刺激TNFa和IL-I β的释放。与LPS组比较，淫羊藿苷(ICA，80 μ mol/L)能够减少上清液中炎症因子的释放。由于采用上述的技术方案，与现有技术相比，本发明发现淫羊藿苷可作为制备治疗帕金森病的药物，并通过实验证明了其药效，对帕金森病具有较为显著的治疗效果。本发明材料来源广泛，易于获取，用于制备药物简单易行、治疗效果好。
附图I为免疫组织化学染色和细胞计数观察淫羊藿苷(ICA)对多巴胺能神经元变性损伤的保护作用；
附图2为western blot assay检测淫羊藿苷(ICA)对小胶质细胞激活的抑制作用；附图3为real time RT-PCR检测淫羊藿苷(ICA)对小胶质细胞内炎症因子mRNA表达的影响；·
附图4为ELISA检测淫羊藿苷(ICA)对细胞培养上清液中炎症因子蛋白含量的影响。
具体实施例方式本发明的实施例I :取淫羊藿苷5g、药用淀粉75 g、微晶纤维素20 g，将药用淀粉先干燥，过120目筛，再与淫羊藿苷、微晶纤维素混合，过两次120目筛，填入硬胶囊中，制成1000粒本发明胶囊。姆粒硬胶囊含主药成分O. 5 mg O本发明的实施例2 :淫羊藿苷5g、羟丙甲纤维素6g、羧甲淀粉钠10g，微晶纤维素Sg，乳糖115g、淀粉50g，硬脂酸镁Ig ;将主药与辅料充分混匀后投入高速搅拌机中，喷雾加水适量，整粒，水分控制在3 4%，然后压片，制成1000片，包薄膜衣。本发明的实施例3 :淫羊藿苷5g，加入400 ml聚こニ醇200溶解，再加入适量蒸馏水进行稀释，然后再加入适量蔗糖并调整体积至1000 ml,搅匀，过滤，灌装成10 ml或20ml每只，灭菌包装。
权利要求
1.淫羊藿苷在制备治疗帕金森病的药物中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种淫羊藿苷在制备治疗帕金森病的药物中的应用。本发明通过研究，发现淫羊藿苷可作为制备治疗帕金森病的药物，并通过实验证明了其药效，对帕金森病具有较为显著的治疗效果。本发明材料来源广泛，易于获取，用于制备药物简单易行、治疗效果好。
文档编号A61P25/16GK102716142SQ20121021479
公开日2012年10月10日 申请日期2012年6月27日 优先权日2012年6月27日
发明者张锋 申请人:遵义医学院