专利名称：化合物6-糠基氨基嘌呤在制备抗血管性痴呆药物的应用的制作方法
技术领域：
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本发明涉及化合物6-糠基氨基嘌呤的新用途，具体涉及化合物6-糠基氨基嘌呤在制备抗血管性痴呆药物的应用。
背景技术：
血管性痴呆(vascular dementia，VD)是指在缺血性、出血性及慢性缺血缺氧性脑血管疾病引起的脑组织损害基础上，产生的以高级神经认知功能障碍为主的综合症。在欧洲及美国，VD是仅次于阿尔茨海默症(Alzheimer’s disease,AD)的第二位最常见 痴呆，在亚洲及许多发展中国家，VD则较AD型痴呆常见。脑卒中是引起VD的主要因素，另年龄、文化素质、遗传以及其他导致全脑缺血、缺氧等因素也可以引起VD。脑部供血不足易导致神经细胞死亡，因为神经细胞大多依赖脑部血液提供葡萄糖和氧气存活，而神经细胞在发生缺血损伤时表现出一种迟发性死亡现象，即在暂时的缺血后到神经细胞发生死亡时有一个时间上的滞后，而这个滞后时间的长短取决于神经细胞的种类和缺血时间的长短。化合物6-糠基氨基嘌呤是1956年Mliller在加热灭菌过的鲱鱼精子DNA提取物中发现的一种具有促进细胞分裂活性的小分子化合物。它是一种非天然的细胞分裂素，俗称6-糠基氨基嘌呤，分子式CltlH9N5O15纯品为白色固体，熔点是265-266°C，系两性化合物。易溶于稀盐酸或稀碱溶液；难溶于水、乙醇、乙醚和丙酮。6-糠基氨基嘌呤，是植物细胞分裂素类物质，能够促进植物细胞的生长和分裂。6-糠基氨基嘌呤是第一个被发现具有细胞分裂素作用的物质。除具有促进细胞分裂、分化、和生长的作用外，还具有延缓器官衰老，促进细胞分裂和调节细胞分化，等方面的作用。但是没有公开其具有抗血管性痴呆的功能。
发明内容
本发明的目的在于，提供化合物6-糠基氨基嘌呤用于制备抗动物和人体血管性痴呆药物的新用途，申请人通过大量的试验首次发现6-糠基氨基嘌呤具有抗动物血管性痴呆的作用，证明了该化合物6-糠基氨基嘌呤对动物和人也具有抗氧化损伤作用。可望被应用于提高脑组织抗氧化损伤能力药物的开发，也可被应用于抗衰老保健品的开发，如制成增强记忆力、抗疲劳、延缓脑组织衰老或者是术前保护药物，或者是系列能够增强抗血管性痴呆能力的药物。所述的血管性痴呆是生理性脑氧化损伤、病理性脑氧化损伤或药物性脑氧化损伤。所述的血管性痴呆是是指在缺血性、出血性及慢性缺血缺氧性脑血管疾病引起的脑组织损害基础上，产生的以高级神经认知功能障碍为主的综合症。所述的血管性痴呆是临床上两种最主要的痴呆类型(血管性痴呆和阿尔茨海默症)之一。缺血性脑卒中增加痴呆发生的风险。所述的药物性脑组织损伤是由D-半乳糖、过氧化氢、^ -淀粉样蛋白、谷氨酸或苯妥英钠能够直接或间接引起自由基大量产生的化学药品引起的血管性痴呆。
所述的药物是能显著增加缺血期间低灌注脑血流，缩小脑梗塞体积(且有剂量效应关系)并且能显著改善缺血再灌后的神经行为学损伤症状；可以改善大鼠脑缺血后诱发的认知功能障碍。这种药物可以用于目前所有剂型的开发应用，如制成粉剂、丸剂、片剂、针剂、冲齐U、膏剂、纳米乳剂、胶囊或口服液。给药方式为口服给药、注射给药和透皮给药，用量限定在 450mg/kg. b. w 以内。以下结合发明人给出的实验进一步验证本发明所述的6-糠基氨基嘌呤提高脑组织抗氧化损伤能力的新用途。
具体实施例方式试验例I
I材料与方法 I. I主要试剂
6-糠基氨基嘌呤，美国Sanland公司生产。用0. 06 mo I -L^1的盐酸配制成储备液，4° C保存备用，使用前用2 mol L4NaOH滴定至近中性。胃抑肽酶、亮抑肽酶、天冬氨酸抑肽酶A均为Merk公司产品，DTT、BSA、PMSF、丙烯酞胺、亚甲双丙烯酞胺、Tween-20、TEMED、过硫酸按均为sigma公司产品。氯代三苯基四氮唑购自中国医药(集团)上海化学试剂公司，用蒸馏水配制成4%溶液备用，避光。胞浆/胞核蛋白提取试剂盒、Super ECL Plus超敏发光液购自普利莱生物有限公司。HIF-la、BEGF和P -actin等抗体均为美国santacruz公司产品，购自优宁维生物科技有限公司。美国Santa Cruz公司进口分装BDNF抗体和兔SP检测试剂盒购自北京中杉金桥生物有限公司。丙二醛测定试剂盒均购自南京建成科技有限公司。大鼠A级MCAO栓线购自北京沙东生物技术有限公司。聚偏氟乙烯膜(PVDF)膜(孔径0. 45林m)购自Millipore公司。I. 2主要仪器
H-600透射电子显微镜，日本日立公司；UV 2450紫外可见分光光度计，上海天美科学仪器有限公司；BS224S万分之一电子天平，北京赛多利斯仪器系统有限公司；M0rris水迷宫和大鼠斜板，中国医学科学院药物研究；HS10268型10 IOOii L移液器，DRAG0NMED ；MQX200酶标仪(BioTek)、BE-180垂直电泳槽、BE-186转移电泳槽、QL-901涡旋振荡器、水浴振荡器，哈尔滨东联电子。I. 3实验动物
雄性wistar大鼠,体重260_280g,购自西安交通大学医学院实验动物中心,合格证号陕动证字08-004号。1.4实验设计和方法
I. 4. I暂时性局部脑缺血再灌注模型(tMCAO)制备
按照Longa等的方法制备tMCAO模型。大鼠用10%水合氯醛麻醉(350
Mg/kg, i. p.)，体温维持在37±0. 5°C，仰卧位固定于手术台上。沿颈正中线切开皮肤，仔细分离右侧颈总动脉(CCA)，颈外动脉(ECA)，颈内动脉(ICA)。在距分支5mm处用动脉夹夹闭CCk，将ECA结扎(死结)。另在ECA分支起点附近挂线。将ICA在分支起点处夹闭之后,在ECA的死结和挂线之间剪开一小切口，将一根长4. Ocm,直径0. 26mm的圆头娃化尼龙线由此开口插入至CCA。再将ECA挂线轻轻扎紧，防止出血即可。将ECA在结扎处近心端剪断，去掉ICA动脉夹。然后ECA拉直与ICA成一直线，将尼龙线头部插入ICA1. 85-2. 20cm,至大鼠大脑中动脉起始处，阻断来自WiiliS环的血流供应。缺血2h后小心抽出尼龙线，结扎ECA开口，去掉CCA动脉夹，缝合手术切口，动物放回笼子中再灌24h。全部过程中室温保持在25°C。假手术组只进行手术过程而不插线。1.4.2 HIF-Ia蛋白表达量的测定
大鼠随机分为三组即tMCAO组和高低剂量tMCAO+激动素组。MCA阻断IOmin灌胃给予激动素(0. 5ml/kg)。再灌24h分别处死动物,取脑,用western_blot法检测各组动物皮层HIF-Ia表达。分离损伤侧(含梗塞区)和损伤对侧皮层并称重，用试剂盒分别提取胞浆和胞核蛋白，考马斯亮蓝法测定蛋白含量。等量蛋白上样，电泳。然后，将分离的蛋白电转 至PVDF膜上。用含5%脱脂奶粉的0. 1%TBST溶液封闭非特异性结合，室温轻摇2h。取膜加一抗4°C孵育过夜。将膜用0. 1%TBST漂洗三次，每次7. 5min，然后取膜加二抗室温孵育后漂洗三次，每次7. 5min,加ECL超敏发光液,用Fuji Digital Scienee成像仪显影,应用图象分析Gel- proAnalyzer测量显影条带的IOD值。I. 4. 3生化测定MDA含量
大鼠随机分为四组即假手术组，tMCAO组和tMCAO+激动素(I和2mg/kg)组。MeA阻断IOmin灌胃给予激动素。再灌24h断头取脑，用试剂盒检测各组动物损伤侧脑内MDA含量。迅速将组织置于冰冷的生理盐水中匀浆。4°C，匀浆(10%)，取上清进行测定。采用硫代巴比妥酸(TBA)缩合反应法测定MDA含量，过氧化脂质降解产物中的MDA可与TBA缩合，形成红色产物。结果以每毫克蛋白含InmolMDA表示。1.4.4.斜板实验
斜板实验在tMCAO后第31天进行，大鼠随机分为四组即假手术组，tMCAO组和高低两个剂量的tMCAO+激动素组。将激动素灌胃，每日一次。在tMCAO术前给药2天,末次给药后30min进行手术，然后连续给药30天。假手术和溶剂对照组动物,0. 5% tMCAO 10ml/kg灌胃。将动物面向下置于与平面成50度角的木质斜面上，斜面上粘有表面粗糙的橡胶垫，观察其运动行为。采用四级评分法。1.4.5 Morris 水迷宫实验
Morris水迷宫实验在斜板实验之后进行。实验设施为直径为I. 2m的圆形水池，周围分布几个显著的迷宫外标志物，并在整个实验过程中保持一致。将大鼠头部向上，面向池壁轻轻放入水中，水温保持在22±1°C，所有大鼠每天保持同一实验顺序。每只大鼠分别从两个相隔90度的位置入水，每天2次，训练5天。停留平台位于水平面下1cm，保持在水池中的一个固定位置。每只大鼠的训练时间最长持续90min，在平台上停留。记录每次训练时大鼠发现平台的潜伏期。1.4.6脑梗塞体积的测定(TTC染色)
Morris水迷宫实验之后，即刻断头取脑，去除嗅束、小脑和低位脑干，将其冠状切成6片。经TTC染色后，正常组织深染呈红色，梗死组织呈白色。将每组脑片排列整齐，拍照保存。应用图象分析软件ImageJ处理并统计，求算每片的梗塞面积，并最终叠加换算成梗塞体积。为了消除脑水肿的影响，梗塞体积以间接方法表示为所占大脑半球的百分率。脑梗塞体积(%)=(手术对侧半球的体积-手术侧半球未梗塞部分的体积)/手术对侧半球的体积X100%
1.4.7组织化学染色
在Morris水迷宫实验之后，每组随机选取大鼠，用水合氯醛深度麻醉，然后用约IOOml生理盐水，200ml含4%多聚甲醛的PBS溶液经心脏灌流固定。大鼠断头取脑后进行固定，在含4%多聚甲醛的PBS溶液中4°C过夜。将固定好的大脑脱水、透明、浸蜡、包埋并用切片机连续切片，然后取切片进行组织学加工。I. 4. 8统计学分析 结果
I.对tMCAO缺血致痴呆大鼠神经行为学功能的影响
在大鼠斜板实验中，连续30天灌胃给药条件下，假手术组大鼠评分为2. 3 士 0. 2;与假手术组比较，持续2h的tMCAO缺血使大鼠斜板实验评分显著降低52. 2%0°<O. 01)。与tMCAO组比较，连续灌胃给予低剂量激动素可以显著提高斜板实验评分(/X0. 05)，改善率达75%。高剂量激动素也可以提高大鼠斜板实验评分，改善率达50%，但无显著性差异。提示激动素在该模型上具有保护神经行为学功能的作用。2.激动素对tMCAO缺血致痴呆大鼠学习记忆的影响
双因素方差分析揭示了在训练期间激动素治疗(P〈0. 005)和随时间变化(P〈0. 001)的显著性作用，post hoc Bonferroni tests检验表明与假手术组比较,持续2h的tMCAO缺血显著延长了大鼠发现平台的潜伏期(P〈0.01)。与tMCAO组比较，连续灌胃给予激动素均可以明显缩短潜伏期(P〈0. 05)，激动素治疗的改善率分别为79. 7%和78. 4%(由曲线下面积计算而来)。提示激动素在该模型上具有显著改善学习记忆障碍的作用。3.激动素对tMcAo缺血致痴呆大鼠脑梗塞体积的影响
持续2h的tMCAO缺血使脑梗塞体积显著增加为对侧半球的35. 3± 12. 0%。与tMCAO组，连续灌胃给予激动素分别使梗塞体积显著减小52. 7%(P〈0. 01)和45. 9%(P〈0. 05)。提示激动素在该模型上具有显著减小脑梗塞体积的作用。4.激动素对tMCAO缺血致痴呆大鼠皮层、海马病理学变化的影响
HE染色结果显示，与tMCAO组损伤对侧比较，2h的tMCAO使损伤侧皮层大面积缺失。与tMCAO组损伤侧比较，连续灌胃给予激动素均能减少皮层缺失面积，高剂量激动素组皮层缺失面积明显小于激动素低剂量组。光镜下，tMCAO组损伤对侧脑切片皮层神经儿结构完整，形态清晰，海马CAI区锥体细胞层染色清楚，排列榷齐，密集。与tMCAO组损伤对侧相比，tMCAO组损伤侧的脑切片出现显著的皮层神经儿缺失，细胞核皱缩；海马CAI区神经元缺失，排列松散，正常形态神经元数减少，锥体细胞层不完整，细胞体积缩小，细胞结构消失。与tMCAO组损伤侧相比，连续灌胃给激动素，显著增加tMCAO缺血大鼠皮层神经儿数日，改善神经元形态，并且使海马CAI区锥体细胞排列更密集，整齐。提示激动素具有改善皮层、海马病理学损伤的作用。5.激动素对tMCAO缺血致痴呆大鼠脑内BEGF表达的影响
免疫组化染色结果显示，BEGF阳性表达为胞浆棕色着色，微血管内皮细胞均可见阳性表达。全景视野下，与tMCAO组损伤对侧比较，tMCAO组损伤侧脑切片皮层半暗带(图中黑框区域)BEGF阳性细胞染色深度显著增加(P〈0. 05)。与tMCAO组损伤侧比较，连续灌胃给予激动素后，皮层半暗带BEGF阳性细胞染色深度较tMCAO组损伤侧深。6.激动素对HIF-Ia表达的影响
6. I tMCAO组各不同再灌时间点损伤侧皮层胞核内HIF-Ia表达水平均接近，且均略低于损伤对侧，但不具有统计学意义。6. 2在单次灌胃给药条件下，与tMCAO组大鼠损伤对侧相比，缺血
Zh再灌24h使tMCAO组损伤侧皮层胞浆内HIF-Ia表达显著增加(P〈0. 01)。与tMCAO组大鼠损伤侧相比，高低剂量组的激动素均能使大鼠损伤侧皮层胞浆内HIF-Ia表达显著下降(P〈0.01)。提示激动素具有显著降低HIF-Ia表达的作用。 7.激动素对tMCAO大鼠脑内MDA含量的影响
在单次灌胃给药条件下，假手术组大鼠脑内MDA含量与假手术组比较，持续2h的tMCAO缺血使tMCAO组大鼠损伤侧脑内MDA含量显著增加了。与tMeAO组比较，高低激动素分别使大鼠损伤侧脑内MDA含量显著降低了。
权利要求
1.化合物6-糠基氨基嘌呤用于制备抗血管性痴呆药物的应用，所述的血管性痴呆是生理性脑氧化损伤、病理性脑氧化损伤或药物性脑氧化损伤。
2.如权利要求I所述应用，其特征在于，所述的血管性痴呆是指在缺血性、出血性及慢性缺血缺氧性脑血管疾病引起的脑组织损害基础上，产生的以高级神经认知功能障碍为主的综合症。
3.如权利要求I所述应用，其特征在于，所述的血管性痴呆是血管性痴呆和阿尔茨海默症。
4.如权利要求I所述应用，其特征在于，所述的药物性脑组织损伤是由D-半乳糖、过氧化氢、￠-淀粉样蛋白、谷氨酸或苯妥英钠直接或间接引起自由基大量产生的化学药品引起的血管性痴呆。
5.如权利要求I的应用，其特征在于，所述的药物可以制成粉齐[J、丸剂、片齐[J、针剂、冲齐U、膏剂、纳米乳剂、胶囊或口服液。
全文摘要
本发明公开了化合物6-糠基氨基嘌呤用于制备抗血管性痴呆药物的应用。研究表明，6-糠基氨基嘌呤可以发挥动植物激素样作用，能直接捕获、清除脑组织内多余的自由基；6-糠基氨基嘌呤能显著增加缺血期间低灌注脑血流，缩小脑梗塞体积(且有剂量效应关系)并且能显著改善缺血再灌后的神经行为学损伤症状。6-糠基氨基嘌呤可以改善大鼠脑缺血后诱发的认知功能障碍；6-糠基氨基嘌呤还能促进脑组织抗氧化酶的合成并提高其活性，提高脑组织抵抗外源性和内源性氧化损伤的能力，从而保护脑细胞结构和功能的完整性，维持脑组织的正常生理功能。是有效治疗血管性痴呆的具有开发前景的化合物。
文档编号A61K31/52GK102727499SQ201210218140
公开日2012年10月17日 申请日期2012年6月29日 优先权日2012年6月29日
发明者孙江宏, 欧阳五庆, 欧阳伸雨 申请人:西北农林科技大学