猪瘟、猪伪狂犬病二联疫苗及其制备方法与应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种猪瘟、猪伪狂犬病二联疫苗，包含至少一种猪瘟病毒抗原、至少一种猪伪狂犬病毒抗原，其中二种抗原之间配合良好、免疫效果优异、甚至二种抗原可以相互促进。本发明预防猪瘟和猪伪狂犬病的二联疫苗，制备方法简单，免疫方便快捷，与现有技术中的分次免疫，至少需要打2针才能防治以上二种疾病的疫苗及其免疫方法相比，降低了免疫成本，节约了免疫程序，更加经济可靠。本发明的二联疫苗免疫效果优于单苗，且安全性更佳，避免了多次接种免疫出现的不良反应。此外，本发明还提供了采用间接免疫荧光方法测定二联疫苗中的猪瘟效力的一种简便的检验方法，保证了各批次二联活疫苗的质量，经济效益明显增加。
【专利说明】猪瘟、猪伪狂犬病二联疫苗及其制备方法与应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种猪瘟、猪伪狂犬病二联疫苗，特别是指一种使用特定比例配合的猪瘟、猪伪狂犬病二联疫苗。
【背景技术】
[0002]猪痕(ClassicalSwine fever,简称 CSF),又称为猪霍乱(Hog cholera)或欧洲型猪痕(European swine fever),是一种猪只急性或超急性发热的病毒传染性疾病，临床上的特征是散播迅速、发烧，解剖检验时可看到典型的出血病变。猪瘟可感染各种年龄的猪只，一年四季流行，发病率和死亡率均高，对猪只危害极大。本病是威胁养猪业最重要的传染病之一。世界动物卫生组织(OIE)将猪瘟列为A类16种法定传染病之一，中国则定为一类烈性传染病。猪伪狂犬病(Pseudorabies，PR)是多种动物共患的传染病，引起家畜和野生动物急性致死性的传染病，以发热、奇痒和脑脊髓炎为主要症状，猪是其自然易感宿主， 主要引起妊娠母猪流产、死胎和木乃伊胎，仔猪感染主要是神经症状，成年猪则以隐性感染为主，该病已成为种猪繁殖障碍综合症的主要病因。
[0003]免疫接种是猪瘟和猪伪狂犬病防制的重要措施，但目前市场上仅有猪瘟活疫苗和猪伪狂犬病活疫苗单苗，为有效预防猪瘟和猪伪狂犬病的发生，需单独免疫上述两种活疫苗。单独免疫猪瘟活疫苗和猪伪狂犬病活疫苗存在繁琐、费时、费力、增加成本等问题，且容易造成漏种，直接影响免疫效果。
[0004]台湾大学赖秀穗做了大量猪瘟兔化弱毒疫苗超前免疫试验,取得了免疫的成功并推广使用。但同时指出，PR可干扰CSF抗体的产生，这种干扰现象是由于PR病毒破坏免疫系统引起的(《家畜传染病学》【M】北京:农业出版社，1989.428)。1996年，费流芳等 (《发生伪狂犬病猪场的猪瘟与伪狂犬病免疫试验》，[J].中国兽医杂志，1996,22(7):9-10) 在发生伪狂犬病的猪场做了猪瘟和伪狂犬的免疫相关试验，也得出了猪场发生PR后，免疫猪瘟疫苗后猪群产生的猪瘟(CSF)抗体整体水平很低的结论。2004年，宁宜宝等做了 PPV、 PRV、PRRSV 3种非猪瘟病毒单独或混合感染对猪瘟弱毒疫 苗免疫效力的影响的试验，结果表明猪场中PPV、PRV、PRRSV非猪瘟病毒的感染可直接干扰猪瘟疫苗的免疫效力，导致猪瘟野毒感染后在免疫猪体内滞留、种猪长期带毒排毒，造成CSFV持续感染(《3种非猪瘟病毒单独或混合感染对猪瘟弱毒疫苗免疫效力的影响》，[J].2004，24⑵:112-114)。中国专利 CN 101690808A虽然也尝试使用猪瘟、伪狂犬病二联疫苗，但所述二联疫苗至少需要每头份含CSF病毒大于500，000个家兔感染量，PRV大于IO8TCID5tl,需要制备大量的高滴度病毒液，其商业利用可能性很小，而且对该二联疫苗的对猪攻毒的免疫效果和PR的毒种来源并没有描述。硕士论文《猪瘟和猪伪狂犬病二联苗免疫干扰现象的研究》(贺卫洁，2010年) 也发现了 PR对CSF抗原的抑制作用，不仅干扰CSF的前期抗体，而且二联苗的免疫峰值也比单苗的低。作者虽然也配制了一种猪瘟和猪伪狂犬病二联苗，但为了克服二种抗原之间的干扰，还需要加入转移因子，其本身有一定的副作用，不利于在生产实践中应用。因此，虽然一直以来人们希望获得安全可靠、免疫效果良好的猪瘟和猪伪狂犬病二联苗，但由于二种抗原之间的干扰，至今还未能见到符合要求、适合工业化生产的猪瘟和猪伪狂犬病二联疫苗。
【发明内容】
[0005]有鉴于此，本发明的主要目的在于提供一种猪瘟、猪伪狂犬病二联疫苗，其中二种抗原之间具有适合的形式和比例，以获得抗原配合良好、免疫效果优异、甚至二种抗原可以相互促进的二联疫苗，简言之，本发明的主要目的在于提供一种相对于单苗而言，提高免疫效果的猪瘟、猪伪狂犬病二联疫苗。
[0006]技术方案
[0007]优选地，本发明所述的猪瘟、猪伪狂犬病二联疫苗，为包含至少一种猪瘟病毒抗原、至少一种猪伪狂犬病毒抗原的二联疫苗。
[0008]优选地，本发明所述的猪瘟、猪伪狂犬病二联疫苗中，所述的猪瘟病毒抗原为猪瘟活病毒、改良/嵌合的猪瘟活病毒、至少含有猪瘟病毒的免疫原性氨基酸序列的重组病毒， 至少含有猪瘟病毒的免疫原性氨基酸序列的多肽或成分的一种或任意几种的组合。更优选地，本发明所述的猪瘟、猪伪狂犬病二联疫苗中，所述的猪瘟病毒抗原为猪瘟兔化弱毒株； 更优选地，所述的猪瘟病毒抗原为猪瘟病毒E2亚单位抗原。
[0009]优选地，本发明所述的猪瘟、猪伪狂犬病二联疫苗中，所述的猪伪狂犬病毒抗原为猪伪狂犬活病毒、改良/嵌合的猪伪狂犬活病毒，至少含有猪伪狂犬病毒的免疫原性氨基酸序列的重组病毒、猪伪狂犬病毒基因缺失病毒或弱毒病毒的一种或任意几种的组合。 优选地，所述的猪伪狂犬病毒抗原为伪狂犬病病毒基因缺失SA215株(CCTCC，保藏编号 V200002)、Ea 株(CGMCC，保藏编号 N0.0907)、WKQ-001 株(CCTCC，保藏号 V200511)或伪狂犬病病毒弱毒株Bartha株、Bartha~K61株、Bucharest株、BUK株、H株(GCMCC，保藏号为 N0.5013)和C株(CCTCC，保藏编号V201114)的一种或任意几种的组合。
[0010]优选地，本发明所述的猪瘟、猪伪狂犬病二联疫苗中，所述的猪瘟病毒抗原为猪瘟兔化弱毒株，所述的猪瘟兔化弱毒株的含量为≥3.0X IO3 tlTCID5ci/头份，优选地为
0.6~1.5X IO4 0TCID50/头份，更优选的为1.0XIO4 ciTCID5ci/头份；所述的猪伪狂犬病毒抗原为猪伪狂犬病毒基因缺失株(SA215株)，含量为≥5.0X IO5 tlTCID5ci/头份，优选地为
1.0xIO6 0TCID50/ 头份。
[0011]更优选地，本发明所述的猪瘟、猪伪狂犬病二联疫苗中，还包括冻干保护剂。
[0012]优选地，本发明所述的冻干保护剂，可以是乳糖、脱脂牛奶、明胶、海藻糖、牛血清白蛋白、聚乙烯吡咯烷酮、山梨醇、谷氨酸钠中一种或几种。
[0013]优选的，本发明所述的冻干保护剂是乳糖和脱脂牛奶。
[0014]优选的，本发明所述的冻干保护剂所含的乳糖的浓度为5% (W/V)，所含脱脂牛奶的浓度为10% (W/V)。
[0015]本发明的另一目的在于提供上述猪瘟、猪伪狂犬病二联疫苗的制备方法，包括以下步骤:分别培养猪瘟病毒液和猪伪狂犬病毒液，获得猪瘟病毒液和猪伪狂犬病毒液，将猪瘟病毒液和猪伪狂犬病毒液按一定比例配制，优选的比例为1: UV/V)，如使得猪瘟病毒液的含量为1.0X 104_ tlTCID5tl/头份，猪伪狂犬病毒液的含量为1.0X 106_ tlTCID5tl/头份，制备成二联疫苗。[0016]更优选地，本发明所述的猪瘟、猪伪狂犬病二联疫苗的制备方法中，可以使用猪瘟 E2蛋白代替培养猪瘟病毒液的步骤，并将猪瘟E2蛋白与培养的猪伪狂犬病毒液按一定比例配制，优选的比例为3: 1(V/V)，如使得猪瘟E2蛋白的含量为50iig/头份，猪伪狂犬病毒液的含量为1.0X 106_tlTCID5tl/头份，制备成二联疫苗。
[0017]更优选地，本发明所述的猪瘟、猪伪狂犬病二联疫苗的制备方法中，还包括加入冻干保护剂的步骤。
[0018]本发明的又一目的在于提供猪瘟、猪伪狂犬病二联疫苗的效力检验方法，所述方法采用间接免疫荧光方法，包括以下步骤:将病毒接种于细胞，待细胞长至单层后用丙酮溶液固定，然后加入一抗和二抗，最后根据荧光数计算疫苗效价。
[0019]优选地，本发明所述的二联疫苗的效力检验方法，所述的细胞优选传代细胞，更优选ST传代细胞。
[0020]优选地，本发明所述的二联疫苗的效力检验方法，所述的固定用丙酮溶液优选 80%浓度。
[0021]优选地，本发明所述的二联疫苗的效力检验方法，所述的一抗优选猪抗猪瘟病毒血清。
[0022]优选地，本发明所述的二联疫苗的效力检验方法，所述的二抗优选兔抗猪 IgG(IgG-FITC)。
[0023]由上可以看出，本发明的二联疫苗提供了在治疗和预防猪瘟和猪伪狂犬病的疫苗中应用。
[0024]技术效果
[0025]本发明的猪瘟、猪伪狂犬病二联疫苗至少有以下优点: [0026]1、本发明猪瘟、猪伪狂犬病二联疫苗能有效解决猪瘟疫苗前期效价不高的问题。
[0027]2、本发明的猪瘟、猪伪狂犬病二联疫苗安全性好、免疫效力高，对猪瘟、猪伪狂犬病的强毒攻击具有较好的免疫保护作用，优于现有技术中免疫接种的猪瘟和猪伪狂犬病活疫苗。
[0028]3、猪瘟和猪伪狂犬病均为免疫抑制病，免疫剂量不合理会引起相互干扰，且容易造成漏种，直接影响预防效果。用本发明的猪瘟、猪伪狂犬病二联疫苗免疫接种，可减轻免疫接种的工作量，减少免疫次数，避免因频繁免疫造成的免疫麻痹，相应减少了对猪群的应激，达到了“一针防两病”。
[0029]因此，本发明预防猪瘟和猪伪狂犬病的二联疫苗，制备方法简单，免疫方便快捷， 与现有技术中的分次免疫，至少需要打2针才能防治以上二种疾病的疫苗及其免疫方法相比，降低了免疫成本，节约了免疫程序，更加经济可靠。而且，发明人通过优化猪瘟病毒和猪伪狂犬病毒的配苗比例，制备的二联疫苗与单苗免疫仔猪的安全性和效力比较显示，本发明的二联疫苗免疫效果优于单苗，且安全性更佳，避免了多次接种免疫出现的不良反应。此外， 申请人:通过采用间接免疫荧光方法测定二联疫苗中的猪瘟效力，简化了检验方法，保证了各批次二联活疫苗的质量，经济效益明显增加。
【专利附图】
【附图说明】
[0030]图1为猪瘟、猪伪狂犬病二联疫苗的制备工艺图；[0031]图2为重组CSFV E2基因PCR扩增结果图；
[0032]图3为间接免疫荧光法鉴定重组蛋白在昆虫细胞中的表达图；
[0033]图4为Westernblot进行鉴定重组蛋白的表达图。
[0034]图5为猪瘟E2蛋白免疫仔猪后的抗体情况。
【具体实施方式】
[0035]下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
[0036]实施例1猪瘟、猪伪狂犬病二联活疫苗的制备
[0037]1.猪瘟、猪伪狂犬病毒抗原的制备
[0038]1.1生产用毒种的制备
[0039]猪瘟兔化弱毒株的制备:将猪瘟兔化弱毒株(购自中国兽医药品监察所，保藏号为AV1412)用病毒稀释液(无血清的DMEM培养基)作适当稀释，按感染复数(M.0.1)为 0.1接种于ST细胞单层(购自CCTCC，编号⑶C0060)培养，37°C吸附30min，加入含3% (v/ v)犊牛血清的DMEM细胞维持液，37°C培养3~5日，冻融2~3次，收获病毒，病毒效价≥ 106_ 5TCID5cZml。
[0040]猪伪狂犬病毒基因缺失株(SA215株)的制备:将猪伪狂犬病毒基因缺失株 (SA215株，为TK_/gE7gr三基因缺失，公开于中国专利CN101186902，该毒株以保藏编号 V200002保藏于CCTCC)用病毒稀释液(无血清的DMEM培养基)作适当稀释，按感染复数 (M.0.1)为0.1接种于ST细胞(购自CCTCC，编号GDC0060)培养，37°C吸附30min，加入含 3% (v/v)犊牛血清的DMEM细胞维持液，37°C培养2~4日，冻融2~3次，收获病毒，病毒效价≥ 108_5TCID5Q/ml。
[0041]1.2病毒液的培养制备
[0042]猪瘟兔化弱毒株的制备:用转瓶细胞培养法。将长满单层的ST细胞，倒去细胞培养液，将毒种液按M.0.1 = 0.1的接种量接种于ST细胞上，轻轻旋转细胞瓶2周，37°C吸附 30min，加入细胞维持液，置37°C旋转(10~12转/小时)培养。每日观察I~2次，细胞生长良好，37°C培养3~5日收获细胞和细胞液，冻融3次，置-20°C以下保存。
[0043]猪伪狂犬病毒基因缺失株(SA215株)的制备:用转瓶细胞培养法。将长满单层的 ST细胞，倒去细胞培养液，将毒种液按M.0.1 = 0.1的接种量接种于ST细胞上，轻轻旋转细胞瓶2周，37°C吸附30min，加入细胞维持液，置37°C旋转(10~12转/小时)培养。每日观察I~2次，细胞生长良好，37°C培养2~4日收获细胞和细胞液，冻融3次，置-20°C以下保存。
[0044]1.3病毒液的处理
[0045]猪瘟兔化弱毒 株病毒液的处理:将病毒液用中空纤维滤柱(孔径IOiim与 0.45 u m)过滤，除去细胞碎片。
[0046]猪伪狂犬病毒基因缺失株病毒液的处理:将病毒液用中空纤维滤柱(孔径10 ii m 与0.45 ii m)过滤，除去细胞碎片。[0047]1.4含量测定
[0048]1.4.1猪瘟兔化弱毒株病毒含量测定
[0049]将病毒用含2%羊血清细胞维持液作10倍梯度系列稀释，从KT1到10_6。每个稀释度接种8个孔，同时设立阴性不接毒对照，放入5% CO2温箱中37°C培养48~72h，80% (v/ v)丙酮固定，用间接免疫荧光抗体(IFA)方法测定每个稀释度含有猪瘟病毒阳性细胞(绿色荧光)的孔数，根据Reed-Muench法计算病毒TCID5tl,结果为病毒的含量≥IO6 5TCID5tl/ ml o
[0050]1.4.2猪伪狂犬病毒基因缺失株(SA215株)病毒含量测定
[0051]将收获的病毒液做10倍系列稀释，取10-5、10-6、10-7、10-8、10_95个稀释度，分别接种ST细胞单层的96孔细胞培养板上，每个稀释度接种8个孔，同时设立阴性不接毒对照， 放入5% CO2温箱中37°C培养48~72h，观察细胞病变(CPE)，根据Reed-Muench法计算病毒TCID5tl，结果为病毒的含量≥108 5TCID5Q/ml。
[0052]1.4.3抗原含量测定结果
[0053]按上述的方法生产了猪瘟兔化弱毒株和猪伪狂犬病毒基因缺失株(SA215株)病毒抗原，根据Reed-Muench法计算，结果猪瘟兔化弱毒株病毒液含量为106 7TCID5(l/ml，根据 Reed-Muench法计算，猪伪狂犬病毒基因缺失株(SA215株)病毒液含量为108 7TCID5(l/ml。
[0054]2.猪瘟病毒E2蛋白的制备
[0055]2.1.猪瘟病毒E2基因的获得
[0056]2.1.1猪瘟C株弱毒疫苗株病毒基因组RNA的提取:
[0057]将猪瘟兔化弱毒株(AV1412)用生理盐水稀释后，按照天根生化科技(北京)有限公司的TIANamp病毒RNA提取试剂盒说明书进行CSFV基因组RNA的提取。
[0058]2.1.2猪瘟C株弱毒疫苗株基因的克隆
[0059]1.根据GenBank登记的猪痕C株弱毒株的序列(Classical swine fever virus strain C-ZJ-2008, GenBank登录号为HM175885)设计一对引物用于扩增E2基因，上游引物命名为CSFVE2U，其序列信息为
[0060]5' -CGCGGATCCATGGCATTCCTCATCTGCTTGATAA-3'，下游引物命名为 CSFVE2D，其序列信息为
[0061]5' -CCCAAGCTTTCAAAATTCTGCGAAGTAATCTG-3'，上游引物的 5' 端引入 BamHI 限制性内切酶识别位点序列“G丨GATCC”，下游引物的5'端引入HindIII限制性内切酶识别位点序列“A丨AGCTT”。下面的步骤(一)中提取的RNA用于反转录，利用宝生物工程 (大连)有限公司的Reverse Transcriptase XL(AMV)(货号:D2620)进行第一链的合成， 在0.2ml的PCR管中加入含Iiig步骤(一)中提取的RNA，加入liil(10pm/ia)下游引物 CSFVE2D 作为反转录引物，加入 4 U 15XReverse Transcriptase XL Buffer 和 I U I Reverse Transcriptase XL (5U/ u I)，然后补加双蒸水至20 u 1，42°C水浴作用60分钟，即获得重组CSFV E2基因的cDNA链。
[0062]2.以CSFVE2U和CSFVE2D为上下游引物，以上述cDNA为模板，利用宝生物工程(大连)有限公司的TaKaRaEx Taq? (货号:DRROOIA)进行PCR扩增E2基因，反应程序如下: 95 0C预变性3min，94 V变性30s，60 V退火30s，72 °C延伸1.5min，进行35个循环，72 °C保温延伸lOmin。PCR产物进行测序测定重组E2基因的序列信息。3.利用核酸限制性内切酶BamHI和HindIII双酶切步骤3中所述的PCR产物，并克隆入供体质粒pFastBacI的BamHI 和HindIII的位点中，获得重组载体pFastBac-E2，并对重组载体中的E2基因进行序列分析。图2本发明提供的重组CSFV E2基因PCR扩增结果 。
[0063]2.2.猪瘟E2蛋白的表达
[0064]步骤(一):将以上所述获得的重组载体pFastBac-E2转化入含有杆状病毒全长基因组穿梭载体的大肠杆菌感受态细胞
[0065]DHlOBac (Invitrogen, Catalog:10361012)中，在大肠杆菌细胞内重组，通过蓝白斑进行筛选重组穿梭载体，重组穿梭载体命名为Bacmid-E2。
[0066]步骤(二):将步骤(一)所述的重组穿梭载体Bacmid_E2转染昆虫sf9,在细胞内产生重组杆状病毒，命名为vBac-E2:准备5X 105cells/ml的sf9细胞悬液，在6孔细胞培养板中接入sf9细胞2ml/孔，27°C静置Ih以上使细胞贴壁。取一个无菌的1.5ml的离心管，加入I U g重组穿梭质粒Bacmid-E2，用100 y L的SF900II SFM培养基进行稀释混匀，室温静置30min，取另一个无菌的1.5ml离心管加入8 ii L转染试剂Cellfectin? II Reagent (Invitrogen，货号:10362100),用 100 u L 的 SF900II SFM 培养基进行稀释混匀， 室温静置30min，混合上述两个离心管中的转染试剂稀释液和重组穿梭质粒稀释液，用移液器轻轻混匀，室温静置lOmin。弃去准备好的6孔板中的sf9细胞的培养上清，加入上述混合转染液，并补加SF900II SFM至1ml，27°C培养箱培养6h，然后弃去转染液，加入新鲜的 SF900II SFM培养基，继续培养5天后收集细胞培养上清，然后再通过感染昆虫sf9细胞来扩增重组病毒，重组病毒命名为VBac_E2,对照病毒命名为VBac。
[0067]通过间接免疫荧光法鉴定重组蛋白在昆虫细胞中的表达，在重组病毒感染sf9细胞后48小时，弃去细胞培养上清，用无水乙醇固定10分钟，PBS(0.01M, pH = 7.4)洗涤5 遍，再加入CSFV阳性血清，37°C孵育30分钟，PBS洗涤5遍，加入FITC标记的兔抗猪二抗， 37°C孵育30分钟，PBS洗涤5遍，显微镜下观察荧光结果。结果如图3，重组病毒VBac-E2 感染sf9细胞能够观察到荧光，而对照病毒VBac则观察不到，证明重组病毒VBac_E2在昆虫细胞中能够表达CSFV E2蛋白。
[0068](三)用步骤(二)所述的重组昆虫核型多角体病毒感染家蚕幼虫(或蛹)，生产 CSFV E2 蛋白。
[0069]准备病毒滴度为5X107pfu/ml的重组昆虫核型多角体病毒,用25 ii L微量注射器于家蚕(品种为大造，购自中国农业科学院蚕业研究所)5日龄幼虫皮下节间膜接种上述重组病毒，每条蚕接种5 ii L，于接种后第3-8天收集蚕体血淋巴。通过猪瘟病毒(CSFV-Ag)抗原ELISA检测试剂盒(购自韩国Jeno Biotech公司)进行定量测定重组CSFV E2蛋白的表达，如表1所示，ELISA检测结果表明，在接种后第5天蚕体血淋巴中重组蛋白的含量达到最闻表达。
[0070]表1.ELISA法测定重组蛋白含量
[0071]
【权利要求】
1.一种猪瘟、猪伪狂犬病二联疫苗，其特征在于，所述二联疫苗包含至少一种猪瘟病毒抗原、至少一种猪伪狂犬病毒抗原。
2.根据权利要求1所述的二联疫苗，其特征在于，所述的猪瘟病毒抗原为猪瘟活病毒、 改良/嵌合的猪瘟活病毒、至少含有猪瘟病毒的免疫原性氨基酸序列的重组病毒，至少含有猪瘟病毒的免疫原性氨基酸序列的多肽或成分的一种或任意几种的组合。
3.根据权利要求2所述的二联疫苗，其特征在于，所述的猪瘟病毒抗原为猪瘟兔化弱毒株。
4.根据权利要求2所述的二联疫苗，其特征在于，所述的猪瘟病毒抗原为猪瘟病毒E2 亚单位抗原。
5.根据权利要求1所述的二联疫苗，其特征在于，所述的猪伪狂犬病毒抗原为猪伪狂犬活病毒、改良/嵌合的猪伪狂犬活病毒，至少含有猪伪狂犬病毒的免疫原性氨基酸序列的重组病毒、猪伪狂犬病毒基因缺失病毒或弱毒病毒的一种或任意几种的组合。
6.根据权利要求5所述的二联疫苗，其特征在于，所述的猪伪狂犬病毒抗原为伪狂犬病病毒基因缺失SA215株(CCTCC，保藏编号V200002)、Ea株(CGMCC，保藏编号N0.0907)、 WKQ-001株(CCTCC，保藏号V200511)或伪狂犬病病毒弱毒株Bartha株、Bartha_K61株、 Bucharest 株、BUK 株、H 株(GCMCC，保藏号为 N0.5013)和 C 株(CCTCC，保藏编号 V201114) 的一种或任意几种的组合。
7.根据权利要求1所述的二联疫苗，其特征在于，所述的猪瘟病毒抗原为猪瘟兔化弱毒株，所述的猪痕兔化弱毒株的含量为≥3.0X IO3'0TCID50/头份，优选地为0.6~1.5 X IO4 0TCID50/ 头份，更优选的为 1.0X 104_ tlTCID5tl/ 头份。
8.根据权利要求1所述的二联疫苗，其特征在于，所述的猪伪狂犬病毒抗原为猪伪狂犬病毒基因缺失株(SA215株)，含量为≥5.0X IO50TCID50/头份，优选地为1.0xIO6 0TCID50/ 头份。
9.根据权利要求1~8任意一项所述的二联疫苗，其特征在于，还包括冻干保护剂。
10.一种猪瘟、猪伪狂犬病二联疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤:分别培养猪瘟病毒液和猪伪狂犬病毒液，获得猪瘟病毒液和猪伪狂犬病毒液，将猪瘟病毒液和猪伪狂犬病毒液按一定比例配制，制备成二联疫苗。
11.根据权利要求10所述的制备方法，其特征在于，将猪瘟病毒液和猪伪狂犬病毒液按如下比例配制，使得猪瘟病毒液的含量为1.0X IO4 ciTCID5tl/头份，猪伪狂犬病毒液的含量为 1.0xio6 0tcid50/ 头份。
12.根据权利要求10所述的制备方法，其特征在于，使用猪瘟E2蛋白代替培养猪瘟病毒液的步骤，并将猪瘟E2蛋白与培养的猪伪狂犬病毒液按如下比例配制，使得猪瘟E2蛋白的含量20ii g/头份，猪伪狂犬病毒液的含量为1.0XIO6 ciTCID5ci/头份，制备成二联疫苗。
13.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述方法在将猪瘟病毒液和猪伪狂犬病毒液按一定比例配制之后，还包括加入冻干保护剂的步骤。
14.一种猪瘟、猪伪狂犬病二联疫苗的效力检验方法，其特征在于，所述方法采用间接免疫荧光方法，包括以下步骤:将病毒接种于细胞，待细胞长至单层后用丙酮溶液固定，然后加入一抗和二抗，最后根据荧光数计算疫苗效价。
15.根据权 利要求14所述的方法，其特征在于，所述的细胞为传代细胞，更优选ST传代细胞；所述的固定用丙酮溶液优选80%浓度；所述的一抗优选猪抗猪瘟病毒血清；所述的二抗优选兔抗猪IgG(IgG-FITC)。
16.一种权利要求1-9任意一项所述的二联疫苗在治疗和预防猪瘟和猪伪狂犬病的疫苗中应用。
【文档编号】A61P31/22GK103505724SQ201210222016
【公开日】2014年1月15日 申请日期:2012年6月29日 优先权日:2012年6月29日
【发明者】张许科, 孙进忠, 白朝勇 申请人:普莱柯生物工程股份有限公司