专利名称：一种抑制原发性肝癌生长和转移的新方法
技术领域：
本发明涉及ー种肝癌治疗方法，该方法以可以抑制肝癌生长和转移的miRNA-885-5p作为靶点来治疗肝癌，通过瘤内注射合成的miRNA-885_5p模拟物(miRNA-885-5p Agomir)来实现治疗作用。
背景技术：
原发性肝细胞癌是常见的消化道恶性肿瘤，在世界范围内是排名第五的恶性肿瘤，世界毎年新发现恶性肿瘤病人约635万例，其中肝癌大约占26万例，26万例中42. 5%发生在我国且其发病率仍然呈逐年递增的趋势。肝癌发现一般为晚期，有效的治疗方法为肝切除和肝移植，常规化疗对肝癌治疗效果并不明显，所以肝癌的早期诊断尤为重要，探索有·效的肝癌临床诊断标记物和治疗策略具有重要意义。随着分子生物学技术的不断发展，人们对肿瘤发生发展机制的了解越来越深入。依据肿瘤发生中涉及的异常分子和基因，设计和研制针对特定分子和基因靶点的药物，选择性杀伤肿瘤细胞，这种方法称为肿瘤分子靶向治疗。近年来，肿瘤分子靶向治疗已经成为肿瘤治疗新的发展方向，肿瘤分子靶向药物的研究和临床应用使肿瘤治疗水平提升到ー个新的高度。miRNA在细胞生长、发育、分化、死亡等生物过程中起着重要的作用，同时，miRNA几乎參与了血细胞生成、胰岛素分泌、神经系统构成和人类癌细胞生长等每ー个生命活动的过程。序列分析表明，有1/3以上的人类基因直接受到miRNA的调控，而且越来越多的试验证据表明miRNA还有很多功能未被发现。miRNA具有肿瘤抑制因子及癌基因的作用，被称作oncogenic miRNA,即oncomiR。oncomiR的失调与基因突变或表观遗传变异(包括缺失突变、扩增突变、点突变及DNA异常甲基化等)有夫。其表达情况与人类多种恶性肿瘤的发生、发展、诊断、预后相关。miR-885-5p是一种已知的小分子RNA, NCBI基因库查询显不该基因定位于3号染色体的p25. 3的10411173-10411246区间(负链)，由Berezikov E等克隆测序发现。miR-885_5p的相关基本信息为!Accession No MIMAT0004947,基本序列为5’ UCCAUUACACUACCUGC⑶⑶3’。miR-885_5p在肿瘤中的研究还处于刚刚起步阶段，现有的研究表明其在神经母细胞瘤起到抑制肿瘤生长的作用。另外，新近的研究发现miR-885-5p可以抑制胶质瘤的转移。我们的前期研究发现，miR-885-5p和肝脏病的发病过程相关。然而，其对原发性肝癌发生发展的影响还未见报道。本发明首次发现miRNA-885_5p可以作为抑制肝癌生长和转移的靶点，激活miRNA-885-5p活性的miRNA-885_5p模拟物可用于治疗肝癌。
发明内容
本发明的目的在于解决目前原发性肝癌治疗困难，化疗耐药性较高的问题，提供了一种靶向治疗肝癌的新方法，所述方法以可以抑制肝癌生长和转移的miRNA-885-5p作为靶点，利用miRNA激动剂来治疗肿瘤，其中miRNA激动剂包括miRNA-885_5p模拟物。通过瘤内注射合成的miRNA-885-5p模拟物，例如由广州锐博生物科技有限公司合成的miRNA-885_5p 模拟物(miRNA-885_5p agomir)来实现肝癌的治疗。miRNA agomir 是经过特殊化学修饰的miRNA激动剂，其通过模拟内源性miRNA进入miRISC复合物来调节靶mRNA的表达而发挥作用。与普通的miRNA mimics相比，agomir在动物体内具有更高的稳定性和miRNA促进效果。miRNA agomir在体内具有浓度梯度相关性,稳定性高,其作用时间可长达数周。本发明建立了 N0D/SCID小鼠皮下异种成瘤模型，通过瘤内注射PBS、对照agomir或miRNA-885-5p agomir设置对照组和试验组，跟踪测量试验组和对照组的瘤体体积，并用H&E染色的方法对对照组和试验组中的肿瘤坏死细胞的情况进行评判。实验结果表明miRNA-885-5p agomir能够抑制肝癌细胞的生长。
此外，本发明还通过建立具有示踪作用的肝癌稳定细胞系和具有示踪作用的高表达miR-885-5p肝癌稳定细胞系，进ー步构建了 N0D/SCID小鼠原位肝癌模型。在确定小鼠原位肝癌模型建立成功后，通过体内化学发光成像监测肿瘤病灶的生长情况，在NOD/SCID小鼠原位肝癌模型建成8周后，将小鼠处死，将肺脏取出用多聚甲醛固定作石蜡切片，在用H&E染色后，通过显微镜观察肺部肿瘤结节，以确定肝癌细胞有无转移。通过过表达miR-885-5p的实验组和对照样品进行比较后发现，高表达miR-885_5p可以抑制肝癌细胞的原位生长和肺部转移。本发明还涉及miR-885-5p模拟物在制备治疗肝癌的药物中的用途，其中所述药物用于抑制肝癌生长或转移，所述药物除包含miR-885-5p模拟物外，还可以包含药学上常见的药物载体，其中所述载体是注射溶媒、等渗调节剂、PH调节剂、稳定剂、保护剂等。注射溶媒选自注射用水、注射用油、こ醇、甘油、聚こニ醇等；所述等渗调节剂选自氯化钠、氯化钾、葡萄糖、碳酸氢钠、乳酸钠、甘油等，氯化钠浓度范围一般为0. 5-0. 9%，葡萄糖浓度范围一般为4-5%，甘油浓度范围一般为2. 25%左右；所述的pH调节剂选自乳酸、柠檬酸、磷酸氢ニ钠、磷酸ニ氢钠、磷酸、碳酸钠、碳酸氢钠等，乳酸的浓度范围一般为0. 1%左右，柠檬酸的浓度一般为0. 5%左右，磷酸氢ニ钠和磷酸ニ氢钠的浓度一般为I. 7%和0. 71%左右，碳酸钠、碳酸氢钠的浓度一般为0. 06%和0. 005%左右；所述稳定剂选自肌酐、甘氨酸，肌酐的浓度一般为0. 5-0. 8%，甘氨酸的浓度一般为I. 5-2. 25% ;所述保护剂选自乳糖、蔗糖、麦芽糖、人血白蛋白，乳糖的浓度一般为2-5%，蔗糖的浓度一般为2-5%，麦芽糖的浓度一般为2-5%，人血白蛋白的浓度一般为0. 2-2%。所述药物可以制备成常见的剂型，例如注射齐U、颗粒剂、片剂、胶囊、气雾剂等，所述注射剂可以是溶液型、混悬型或乳剂型，可以通过皮下注射、肌肉注射、静脉注射或静脉滴注的方式给药。所述的模拟物包含双链RNA，其中双链RNA的正义链的具体序列为5’ UCCAUUACACUACCUGCCUCU3’，反义链的具体序列为5’ AGAGGCAGGTAGTGTAATGGA3’，所述双链RNA可以是经过修饰的RNA。更具体地，本发明中所使用的miRNA-885-5p类似物购自广州锐博生物科技有限公司，其具体名称为miR_885_5p agomir。
图I. N0D/SCID小鼠皮下成瘤后，瘤内注射miR-885_5p模拟物，可见抑制肝癌的生长;图2.将瘤体取出，固定，H&E染色后，可见注射miR-885_5p模拟物组的组织坏死情况比对照组明显；图3携带荧光素酶的高表达HCCLM3细胞生物发光强度与细胞数呈正比关系；图4携带荧光素酶的高表达HCCLM3细胞原位成瘤后，在N0D/SCID小鼠的体内示踪情况；图5原位成瘤模型建成8周后，将小鼠处死，将肺部固定，H&E染色情况；图6肺部H&E染色后，肺部结节计数对比；
具体实施例方式下面结合附图与具体实施方式
对本发明作进ー步详细描述。实施例I miR-885-5p模拟物抑制N0D/SCID小鼠皮下瘤的生长(I)用胰酶消化生长良好的野生型人肝癌SK-H印-1细胞，用PBS洗一遍并用DMEM基本培养基重悬至I X IO8细胞/4毫升；(2)对5-6周N0D/SCID雄性小鼠右侧背部皮下注射(I)中处理好的细胞200 μ 1，10天后可见小鼠右侧背部可见瘤体形成，N0D/SCID小鼠皮下成瘤的模型建成；(3)瘤内注射miR-885-5p模拟物2ηΜ/100 μ 1，2次/周。注射6次，跟踪量瘤体体积。其中miR-885-5p模拟物购自广州锐博生物科技有限公司，其具体名称为miR-885-5p agomir,其中包含双链RNA，双链RNA的正义链的具体序列为5’ UCCAUUACACUACCUGCCUCU3’，反义链的具体序列为5’ AGAGGCAGGTAGTGTAATGGA3’，所述双链RNA是经过化学修饰的具有更高稳定性的RNA。同时设置瘤内注射PBS的空白对照组、对照agomir的阴性对照组。跟踪结果如图I所示。将瘤体取出，固定，H&E染色后，可见注射miR-885-5p模拟物的试验组的组织坏死情况比对照组明显严重。H&E染色结果如图2所示。实施例2 miR-885-5p抑制肝癌的转移(I)具有示踪作用的肝癌稳定细胞系的建立用293T细胞铺六孔板，密度为I. 5X IO6细胞/孔，用于转染；用lipo-2000将含有荧光素酶基因的慢病毒表达质粒和慢病毒包装质粒(慢病毒表达系统均购自美国biosettia生物公司)转染入前一天铺板的293T细胞；转染16小时后更换新鲜DMEM培养基，换液后24小时收集病毒上清，储于_80°C冰箱备用；用人肝癌HCCLM3细胞铺六孔板，密度为I X IO5细胞/孔，用于病毒感染；待病毒上清常温化冻后，混合2毫升不含抗生素的全培养基和I毫升病毒上清加入HCCLM3细胞孔内，并加入阳离子多聚物基因载体polybrene24 Hg/孔(购自Sigma公司)，1600rpm，37°C离心I小时；离心结束后换新鲜全培养基2毫升/孔，继续置于37°C培养箱进行培养；48小时后向上述病毒感染后的HCCLM3细胞中加入Bsd进行药筛共计3天，以得到稳定表达海肾荧光素酶的人肝癌HCCLM3细胞，简称HCCLM3/Iuci0(2)具有示踪作用的高表达miR-885_5p肝癌稳定细胞系的建立用293T细胞铺六孔板，密度为I. 5X IO6细胞/孔，用于转染；用lipo-2000将含有miR-885-5p的慢病毒表达质粒和慢病毒包装质粒(慢病毒表达系统均购自美国biosettia生物公司)转染入前一天铺板的293T细胞；转染16小时后更换新鲜DMEM培养基，换液后24小时收集病毒上清，储于_80°C冰箱备用；用(I)建立的高表达海肾荧光素酶的人肝癌HCCLM3细胞铺六孔板,密度为IX IO5细胞/孔,用于病毒感染；待病毒上清常温化冻后，混合2毫升不含抗生素的全培养基和I毫升病毒上清加入高表达荧光素酶HCCLM3细胞孔内，并加入polybrene 24 μ g/孔，1600rpm, 37°C离心I小时；离心结束后换新鲜全培养基2毫升/孔，继续置于37°C培养箱进行培养；48小时后向上述病毒感染后的HCCLM3细胞中加入puromycin进行药筛共计3天，以得到稳定表达海肾突光素酶和过表达miR-885_5p的人肝癌HCCLM3细胞，简称HCCLM3/luci-miR-885-5p细胞。通过核酸杂交技术对细胞中的miR-885-5p的含量进行检测，检测结果表明与未导入miR-885_5p的HCCLM3/luci细胞相比，HCCLM3/luci-miR-885-5p细胞中，miR-885_5p的表达明显增加。(3) N0D/SCID小鼠原位肝癌模型的建立 分别用胰酶消化生长良好的人肝癌HCCLM3/luci或HCCLM3/luci-miR-885_5p细胞，用PBS洗一遍并用DMEM基本培养基重悬至3. 75 X IO7细胞/I. 2毫升；对5-6周NOD/SCID雄性小鼠右侧背部皮下注射上述处理好的细胞200 μ 1，10天后可见小鼠右侧背部可见瘤体形成，N0D/SCID小鼠皮下成瘤的模型建成；将瘤体取出剪成直径为Imm左右大小用穿刺针植入另外4-6周的雄性N0D/SCID小鼠肝内。过表达miR-885_5p和阴性对照NOD/SCID小鼠原位肝癌模型形成。(4)体内化学发光成像监测肿瘤病灶生长情况向(3)中N0D/SCID小鼠腹腔注射萤火虫荧光素酶底物D-Luciferin(150mg/kg)，待5分钟后利用Xenogen IVIS Lumina II活体成像系统检测化学发光信号，曝光时间根据情况设为5-30秒；检测结果如图3、4所示。从图4显示的结果可以看出，与阴性对照组相比，过表达miR-885-5p的实验组中肿瘤病灶的生长明显减弱。(5) H&E染色检测N0D/SCID小鼠肝癌向肺转移情况N0D/SCID小鼠原位肝癌模型建成8周后，将小鼠处死，将肺脏取出用多聚甲醛固定作石蜡切片，H&E染色后，显微镜观察肺部肿瘤结节。H&E染色步骤具体如下ニ甲苯10分钟；ニ甲苯10分钟；无水こ醇5分钟；无水こ醇10分钟；95%こ醇3分钟；80%こ醇5分钟；自来水洗2分钟；蒸馏水洗I分钟；苏木素染色4分钟；7jC洗2分钟；O. 5%的盐酸酒精分化2秒钟；水洗2分钟O. 5%的氨水反蓝10秒钟；自来水洗2分钟；蒸馏水洗I分钟；伊红染色50秒；80%こ醇蘸ー下；5%こ醇蘸ー下；无水こ醇3分钟；无水こ醇10分钟；ニ甲苯5分钟；ニ甲苯10分钟；中性树胶封片。检测结果如图5、6所示。从图5、6的结果可以看出与对照组相比，过表达miR-885-5p的实验组中发生肺部转移机率明显低于对照组。*p〈0. 05。
权利要求
1.miRNA-885-5p模拟物在制备用于治疗肝癌的药物中的用途，其特征在于所述的模拟物包含双链RNA，其中双链RNA的正义链的具体序列为5’ UCCAUUACACUACCUGCCUCU3’，反义链的具体序列为5’ AGAGGCAGGTAGTGTAATGGA3’。
2.根据权利要求I所述的用途，其特征在于所述药物用于抑制肝癌生长。
3.根据权利要求I所述的用途，其特征在于所述药物用于抑制肝癌发生转移。
4.根据权利要求I或2所述的用途，其特征在于所述药物还包括药学上可接受的载体，其中所述载体是注射溶媒、等渗调节剂、PH调节剂、稳定剂、保护剂。
5.根据权利要求I或2所述的用途，其特征在于所述药物是注射剂，所述注射剂是溶液型、混悬型或乳剂型。
6.根据权利要求4或5所述的用途，其特征在于所述药物可以通过皮下注射、肌肉注射、静脉注射或静脉滴注的方式给药。
全文摘要
本发明提供了一种新的抑制原发性肝癌生长和转移的生物治疗方法，所述方法以miRNA-885-5p作为靶点，通过瘤内注射合成的miRNA-885-5p的模拟物来抑制肝脏肿瘤的生长。
文档编号A61P35/00GK102727909SQ20121022221
公开日2012年10月17日 申请日期2012年6月28日 优先权日2012年6月28日
发明者张竹红, 田亚平 申请人:中国人民解放军总医院