一种藜芦生物碱的制备方法
【专利摘要】本发明提供了一种藜芦生物碱的制备方法，属于有机化学领域范畴。本制备方法以藜芦药材为原料，经过提取、萃取、上柱、结晶等一系列步骤，制备出藜芦生物碱，含量达到80％～98％。本发明的制备工艺安全合理，在制备藜芦生物碱的过程中，没有采用加热工序，不但最大程度的保证生物碱被充分提取分离，同时减少了由于加热情况下造成的产品活性成分的破坏和副产物的产生，提高了产品的得率和安全性。经多批工业化生产验证，本发明提供的工艺稳定性、重复性好，质量可控，具有很强的实用性。
【专利说明】一种藜芦生物碱的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种具有抗病毒作用的藜芦生物碱制备方法，属于有机化学领域范畴。
【背景技术】
[0002]藜芦(Falsehellebore Root and Rhizome)为百合科藜芦属植物藜芦的干燥根及根状茎。始载于《神农本草经》，味苦，性辛、寒，有毒。归肺，胃经。《本草纲目》载入草部，毒草类，有吐风痰，杀虫毒等功效。
[0003]藜芦中主要化学成分是生物碱，由于其生理活性强烈，其生物碱类成分与很多其他中药合用时会产生化学反应，出现意外，因此藜芦在中药中一直是以毒性很大而著称。如在《儒门事亲》的十八反歌云:“本草明言十八反，诸参辛芍叛藜芦……”。
[0004]随着现代对藜芦药理作用研究的深入，表明藜芦的生物活性主要体现在其所含生物碱对心血管系统的作用，特点为在产生明显而持久降压的同时，伴有心跳变慢等作用。研究还表明，藜芦生物碱表现出的毒性，主要是因为其作用于动物及人体运动神经、感觉神经及迷走神经的麻痹作用，引起临床上的中毒反应。
[0005]虽然藜芦在传统印象中是一种毒性较大的中药，目前较为广泛的应用于杀虫剂。其作用机理是藜芦碱经虫体表面或吸食进入消化系统，造成局部刺激，引起反射性虫体兴奋，继之抑制虫体感觉神经末梢，经传导和抑制中枢神经而致害虫死亡。此外，由于藜芦在其他很多方面具有较强的生理活性，仍然在临床上得到较为广泛的应用，尤其是目前已经发现其在抗肿瘤方面有独特的作用，藜芦已经成为目前研究的一个热点。
[0006]因此，运用现`代中药分离纯化技术，将藜芦中主要活性藜芦生物碱进行分离纯化，并对其药理活性、作用机制进行深入系统的研究，将会对传统中药藜芦在应用方面起到突破和提高作用。
[0007]目前从已经公开的文献和专利中，对藜芦生物碱的分离纯化报道比较少见，而且一般都还处在粗提物的阶段或者只是对其中某一两种成分的分离纯化。此外，文献中在对藜芦进行提取过程一般采用加热回流或煎煮、浓缩等方式，使得藜芦生物碱不但含量低、杂质多，而且会产生破坏作用，产生新的副产物，从而导致深入研究的难度进一步加大。
[0008]针对以上现状，本发明通过大量的实验研究，提供了一种独特的分离纯化藜芦生物碱的方法。本方法采用冷浸提取的方法，结合藜芦生物碱的理化性质，通过多次酸化后再碱化游离的方法，对藜芦生物碱进行分离纯化，并运用了萃取、树脂分离及重结晶技术，最终得到了含量高、杂质少、副产物低的藜芦生物碱。经检测，采用本发明提供的技术手段，得到的藜芦生物碱含量达到80%~98%,本品中的藜芦生物碱是由原黎芦碱、乙酰原黎芦碱、黎芦生碱、芥芬胺、黎芦胺，红玉芥芬胺等成分组成的藜芦总生物碱。
[0009]在申请号:200510025582.X名为《藜芦生物碱在治疗肿瘤方面的应用》的发明专利中公开了藜芦生物碱在制备治疗肿瘤药物中的应用，该专利中只是请求对藜芦生物碱的应用及作用机理进行保护，而未提及藜芦生物碱的制备方法。藜芦生物碱在抗肿瘤方面的应用研究在相关文献方面报道已经很多，因此申请其应用保护显然不合理。
[0010]在申请号为200910052376.6名为《高纯度藜芦胺和介芬胺的制备方法》的专利中，提供了一种高纯度藜芦胺(VERATRAMINE)和介芬胺(JERVINE)的制备方法。该方法将藜芦药材原料粉碎、乙醇回流提取、大孔吸附树脂富集、层析柱精制等步骤，最终制成高纯度的藜芦胺和介芬胺。本专利内容是针对藜芦中诸多生物碱中的两种进行分离纯化，虽然该专利中没有明确指出最终产品的得率，由于在制备过程中多次使用了加热提取和浓缩等步骤，其得率也必将很低。此外其专利申请保护的目标产物与本发明的目标产物也有本质的不同。
[0011]在申请号为201110363836.4名为《高纯度甾体生物碱计明胺的制备方法》中，公开了一种藜芦生物碱计明胺的制备方法。该方法采用了水解法经过一系列工艺制备计明胺生物碱，其制备工艺中不但采用了加热回流提取的方式，而且使用了乙醚、氯仿等易爆、毒性溶剂，在实际生产中有很大风险和危害，此外其申请保护的目标产物与本发明专利目标产物也有本质不同。
[0012]综上，本发明提供的制备工艺生产出的藜芦生物碱具有保留了藜芦本身生物碱多样性的特征，制备过程中最大程度避免了活性成分的破坏和损失，所以具有得率高、生产成本低等优势。
【发明内容】
[0013]本发明提供了一种制备藜芦生物碱的方法。
[0014]本发明的目的是根据藜芦生物碱的理化性质，采用酸性溶剂洗脱提取、碱性条件下萃取，再对藜芦生物碱进行充分富集，最后结合运用离子交换的原理，生产出高含量、低杂质的藜芦生物碱。
[0015]根据本发明的比较优 选的实施方案，制备藜芦生物碱方法包括如下步骤:
[0016](I)取藜芦药材，粉碎成粗粉，加入含一定pH值的酸性水溶液进行冷浸提取，控制提取温度、时间和提取次数；
[0017](2)合并提取液、过滤，滤液在搅拌状态下加入碱水溶液适量，调节溶液至一定pH值，再加入适量有机溶剂进行萃取，静置一段时间，分取有机层；
[0018](3)有机层加水继续萃取数次，分离并弃去水层，取有机层；
[0019](4)在有机层中加入适量的一定pH值的酸水溶液，再次进行萃取，静置，分取水层；
[0020](5)取水层溶液，过一定型号的树脂柱，上柱完成后，加水充分洗脱去除其它杂质后，改用一定浓度碱性水溶液洗脱，收集洗脱液，冷却至一定温度，静置，过滤，得藜芦生物喊粗品；
[0021](6)取藜芦生物碱粗品，加入适量含水有机溶剂，搅拌，静置结晶，过滤，干燥，即得藜芦生物碱。
[0022]上述步骤(1)中所述的“酸性水溶液”是指含有一定量盐酸或硫酸的水溶液，pH值范围为2.5~3.5 ;提取的温度为5~25°C。温度过低，则提取率较低，温度过高，则藜芦生物碱会产生较大的分解破坏，产生大量副产物。本提取方法是根据藜芦生物碱易溶于酸性水溶液中的原理，因此采用酸性水冷浸提取既可以保证藜芦生物碱被充分提取出来，又避免了加热产生的破坏，同时不再使用有机溶剂，大大减少了生产成本。
[0023]上述步骤(2)中所用的碱水溶液是指氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠、碳酸钾、碳酸氢钾或碳酸氢钠的水溶液，优选为2%的碳酸氢钠水溶液；溶液的pH值为7.5~9.5,优选为8.5 ;萃取所用的溶剂为乙酸乙酯或正丁醇，优选为乙酸乙酯。本步骤是根据藜芦生物碱在PH值大于7.5时易溶于有机溶剂而可以被萃取的原理，将藜芦生物碱转溶至有机溶剂中，而其他水溶性杂质难溶于有机溶剂，从而达到初步纯化的效果。
[0024]上述步骤⑶中所用加水量为有机溶剂体积的0.2~I倍量，萃取的次数为I~3次，优选2次。本步骤主要是通过多次萃取，可以将水溶性杂质充分分离去除，达到进一步除杂的效果。
[0025]上述步骤(4)中萃取所用一定PH值的酸水溶液是指含有一定量盐酸或硫酸的水溶液，其PH值范围为5.5~6.5 ;本步骤主要是通过在弱酸性条件下，再次将藜芦生物碱萃取至水层中，不但去除了部分小极性水溶性杂质，同时也为下一步过柱做好准备。
[0026]上述步骤(5)中所用的“一定型号的树脂柱”为离子交换树脂柱，其型号可以为D061、NKC-9和D001SS，优选D061 ;—定浓度的碱性水溶液是指浓度为0.1%~1%的氨水溶液、氢氧化钠溶液或氢氧化钾的水溶液，优选为0.5%的氢氧化钠水溶液；结晶的温度为O~20°C，优选为4°C，温度过高则很难结晶或结晶不充分，温度过低则析出杂质较多。
[0027]上述步骤(6)中，“含水有机溶剂”是指浓度为10%~40%的乙醇一水、甲醇--水或丙酮一水溶液，优选15%~20%。有机溶剂浓度太低，则结晶纯化作用不明显，有机溶剂浓度过高则产品得率低。溶剂的用量为藜芦生物碱重量的3~8倍量，优选4~6倍量。
[0028]本发明通过科学可行的方法以藜芦药材为原料，经过提取、萃取、上柱、结晶等一系列步骤，特别是根据藜芦生物碱具有热不稳定、在不同PH条件下溶解性有较大差异的性质，将藜芦生物碱进行科学合理分离纯化，巧妙的制备出藜芦生物碱。
[0029]本发明的优势在于按照本发明提供的工艺安全合理，在藜芦生物碱的过程中，没有采用加热工序，不但在最大程度上保证生物碱被充分提取分离，同时减少了由于加热情况下造成的产品活性成分的破坏和副产物的产生，提高了产品的得率和安全性。
[0030]根据上述技术方案，得到的藜芦生物含量达到80%~98%。
[0031]本发明提供的技术方案经多批工业化生产验证，工艺稳定性、重复性好，质量可控，具有很强的实用性。
【具体实施方式】
[0032]下列实施例旨在进一步举例描述本发明，不应理解为对本发明范围的限制。
[0033]实施例1
[0034](I)取藜芦药材5kg，粉碎成粗粉，分别加入pH值为3.0的的盐酸水溶液25L进行冷浸提取，提取温度为25°C，提取2次，每次3小时。
[0035](2)合并提取液、过滤，滤液在搅拌状态下加入为2%的碳酸氢钠水溶液调节溶液至pH至8.5，再加入15L 乙酸乙酯进行萃取，静置I小时，分取乙酸乙酯层。
[0036](3)在乙酸乙酯中加水分别5L萃取2次，分离并弃去水层，取乙酸乙酯层。
[0037](4)在乙酸乙酯中加入pH值为6的盐酸水溶液IOL进行萃取，静置，分取水层。
[0038](5)取水层溶液，过型号为D061的树脂柱，上柱完成后，加水25L洗脱后，改用0.5 %的氢氧化钠水溶液洗脱，收集洗脱液，冷却至4°C，静置，过滤，得藜芦生物碱粗品610go
[0039](6)取上述藜芦生物碱粗品，加入到3L浓度为15%的乙醇-水溶剂中，搅拌，静置结晶，过滤，干燥，即得藜芦生物碱310g。
[0040]经检测，上述藜芦生物碱的含量为98.0%。
[0041]实施例2
[0042](I)取藜芦药材10kg，粉碎成粗粉，分别加入pH值为3.5的的盐酸水溶液45L进行冷浸提取，提取温度为15°C，提取2次，每次2小时。
[0043](2)合并提取液、过滤，滤液在搅拌状态下加入为I %的氢氧化钠水溶液调节溶液至pH至9.0，再加入30L正丁醇进行萃取，静置2小时，分取正丁醇层。
[0044](3)正丁醇中加水分别加水IOL萃取3次，分离并弃去水层，取正丁醇层。
[0045](4)在有机层中加入pH值为5.5的硫酸水溶液15L进行萃取,静置,分取水层。
[0046](5)取水层溶液，过型号为D001SS的树脂柱，上柱完成后，加水30L洗脱后，改用0.8%的氨水溶液洗脱，收集洗脱液，冷却至10°C，静置，过滤，得藜芦生物碱粗品950g。
[0047](6)取上述藜芦生物碱粗品，加入到5.7L浓度为20%的丙酮-水溶剂中，搅拌，静置结晶，过滤，干燥，即得藜芦生物碱466g。
[0048]经检测，上述藜芦生物碱的含量为92.1 %。
[0049]实施例3
[0050](I)取藜芦药材10kg，粉碎成粗粉，分别加入pH值为2.5的的硫酸水溶液50L进行冷浸提取，提取温度为25°C，提取3次，每次2小时。
[0051](2)合并提取液、过滤，滤液在搅拌状态下加入为0.8%的氢氧化钾水溶液调节溶液至PH至7.5，再加入25L乙酸乙酯进行萃取，静置2小时，分取乙酸乙酯层。
[0052](3)乙酸乙酯中加水分别加水8L萃取2次，分离并弃去水层，取乙酸乙酯层。
[0053](4)在有机层中加入pH值为6.5的硫酸水溶液IOL进行萃取,静置,分取水层。
[0054](5)取水层溶液，过型号为NKC-9的树脂柱，上柱完成后，加水20L洗脱后，改用0.5%的氢氧化钾溶液洗脱，收集洗脱液，冷却至2°C，静置，过滤，得藜芦生物碱粗品860g。
[0055](6)取上述藜芦生物碱粗品，加入到5.16L浓度为20%的甲醇-水溶剂中，搅拌，静置结晶，过滤，干燥，即得藜芦生物碱419g。
[0056]经检测，上述藜芦生物碱的含量为85.2%。
【权利要求】
1.一种藜芦生物碱的制备方法，由以下几步组成: (1)取藜芦药材，粉碎成粗粉，加入含一定PH值的酸性水溶液进行冷浸提取，控制提取温度、时间和提取次数； (2)合并提取液、过滤，滤液在搅拌状态下加入碱水溶液适量，调节溶液至一定pH值，再加入适量有机溶剂进行萃取，静置一段时间，分取有机层； (3)有机层加水继续萃取数次，分离并弃去水层，取有机层； (4)在有机层中加入适量的一定pH值的酸水溶液，再次进行萃取，静置，分取水层； (5)取水层溶液，过一定型号的树脂柱，上柱完成后，加水充分洗脱去除其它杂质后，改用一定浓度碱性水溶液洗脱，收集洗脱液，冷却至一定温度，静置，过滤，得藜芦生物碱粗品; (6)取藜芦生物碱粗品，加入适量含水有机溶剂，搅拌，静置结晶，过滤，干燥，即得藜芦生物碱。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤(1)中所述的“酸性水溶液”是指含有一定量盐酸或硫酸的水溶液，PH值范围为2.5~3.5 ;提取的温度为5~25°C。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤(2)中所用的碱水溶液是指氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠、碳酸钾、碳酸氢钾或碳酸氢钠的水溶液，优选为2 %的碳酸氢钠水溶液；溶液的PH值为7.5~9.5，优选为8.5 ;萃取所用的溶剂为乙酸乙酯或正丁醇，优选为乙酸乙酯。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤(3)中所用加水萃取的次数为I~3次，优选2次。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤(4)中萃取所用一定pH值的酸水溶液是指含有一定量盐酸或硫酸的水溶液，其PH值范围为5.5~6.5。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤(5)中所用的“一定型号的树脂柱”为离子交换树脂柱，其型号可以为D061、NKC-9和D001SS，优选D061 定浓度的碱性水溶液是指浓度为0.1%~I %的氨水溶液、氢氧化钠溶液或氢氧化钾的水溶液,优选为0.5%的氢氧化钠水溶液；结晶的温度为O~20°C，优选为4°C。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于上述步骤(6)中“含水有机溶剂”是指浓度为10%~40%的乙醇一水、甲醇一水或丙酮一水溶液，优选15%~20% ;溶剂的用量为藜芦生物碱重量的3~8倍量,优 选4~6倍量。
【文档编号】A61K36/896GK103520431SQ201210228703
【公开日】2014年1月22日 申请日期:2012年7月4日 优先权日:2012年7月4日
【发明者】杨永安, 钟慧, 金显友, 易铭, 魏元刚, 袁继文, 黄全书, 季浩 申请人:江苏天晟药业有限公司