海参糖胺聚糖在制备治疗冠脉综合症药物中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了海参糖胺聚糖在制备治疗冠脉综合症药物中的应用，动物试验证明，重均分子量为90kDa至130kDa海参糖胺聚糖中的一种以上，具有显著的抗血小板聚集、抗凝、促进纤溶、降低血粘度、调节血脂、抗病毒等多种生理活性，可以用于制备治疗冠脉综合症药物，能安全、有效的用于冠脉综合症的预防和治疗。海参糖胺聚糖组合物在一定剂量下静脉滴注具有显著抑制血小板聚集作用，并且不具有明显抗凝血作用，即由于抗凝作用引发出血的几率更小，因此基于其抗血小板活性的开发，用于治疗冠脉综合症更为安全、有效，具有广阔研究开发前景。
【专利说明】海参糖胺聚糖在制备治疗冠脉综合症药物中的应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及海参糖胺聚糖的医药用途，具体涉及分子量为90kDa至130kDa的海参糖胺聚糖在预防和治疗冠脉综合症中的应用。
【背景技术】
[0002]急性冠状动脉综合征(Acute Coronary Syndrome, ACS)是以冠状动脉粥样硬化斑块破裂(rupture)或糜烂(erosion),继发完全或不完全闭塞性血栓形成为病理基础的一组临床综合征，它是包括不稳定心绞痛(UA)，非ST段抬高型心肌梗死和ST段抬高型心肌梗死的一系列临床病征。血小板的激活在ACS的发生中起着重要作用。长期的临床实践中发现，许多患者的临床症状各异，其冠状动脉却具有非常相似的病理生理改变，即冠状动脉粥样硬化斑块由稳定转为不稳定，继而破裂导致血栓形成。因此急性冠脉综合征的抗栓治疗是非常重要的，尤其在非ST段抬高型ACS中更是如此，抗栓治疗可分为抗血小板治疗和抗凝血酶治疗。
[0003]非ST段抬高急性冠脉综合征:包括不稳定心绞痛和非ST段抬高心梗。2011年3月美国心脏病学会/美国心脏协会(ACC/AHA)发布了新版不稳定性心绞痛/非ST段抬性心肌梗死(UA/NSTEMI)治疗指南，其中关于抗血小板和抗凝治疗的建议如下: [0004]I早期院内药物治疗:抗血小板及抗凝是UA/NSTEMI治疗的基石。对抗血小板以及抗凝治疗有详细的规 定:
[0005]I)应当迅速开始抗血小板治疗。首选阿司匹林(Level of Evidence:A)
[0006]2)阿司匹林过敏或胃肠道疾患不能耐受的患者，应当使用氯吡格雷(Level ofEvidence: A)
[0007]3)在不准备做早期介入治疗的住院患者，入院时除了使用阿司匹林外，还应尽可能使用氯吡格雷，用药时间为l(Level of Evidence:A) 一 9个月(Level of Evidence:B)
[0008]4)在准备做介入的住院患者，应当使用使用氯吡格雷I个月以上(Level ofEvidence:A),如果没有出血的高危因素,贝U可使用9个月(Level of Evidence:B)
[0009]5)在准备做择期CABG并且正在使用使用氯吡格雷的患者，应当停药5 — 7天(Level of Evidence:B)
[0010]6)除了使用阿司匹林或使用氯吡格雷进行抗血小板治疗外，还应当使用静脉普通肝素或皮下 LMWH 抗凝(Level of Evidence: A)
[0011]7)对于准备行心导管检查和PCI的患者，除使用阿司匹林和普通肝素外，还应使用 GPIIb/IIIa 受体拮抗剂(Level of Evidence:A)
[0012]2出院后用药指南:抗血小板药是长期用药(二级预防)。
[0013]近年来抗血小板药主要包括阿司匹林、噻氯吡啶、双嘧达莫、氯吡格雷、拉米非班等，该类药物具有抑制血小板聚集作用，其副作用有所不同，但共同的副作用是出血。抗血小板药抑制血小板聚集，血小板是初期止血作用所必需的，另一方面它又是动脉血栓形成的启动物，因此严格控制用药剂量，临床适应证和禁忌证十分重要。[0014]因此，寻求一种更为安全的用于预防和治疗冠脉综合症的药物，是人们十分期望的。
[0015]“海参，有人称之为“海人参”，因补益作用类似人参而得名，既是宴席上的佳肴，又是滋补人体的珍品，其药用价值也较高。《中医大辞典》记载海参的功效:“补肾益精，养血润燥。治精血亏损、虚弱劳祛、阳痿、梦遗、肠燥便艰”。《本草从新》补肾益精，壮阳疗痿。”《药性考》:“降火滋肾、通肠润燥。”《纲目拾遗》:“生百脉血，治休息痢。”《本草求新》:“润五脏，滋精利水”。
[0016]目前，已经证实海参中具有药用活性的成份主要有蛋白质、多肽、脂类、皂甙及多糖等。海参蛋白具有极高的营养价值；海参中已经分离出具有抗炎、抗肿瘤、提高免疫力活性的多肽；海参脂类中的神经节苷脂具有协同神经生长因子的作用，此外海参皂甙具有很强的抗真菌作用。
【发明内容】
[0017]本发明的目的是提供一种海参糖胺聚糖在制备治疗冠脉综合症药物中的应用，以克服现有技术存在的上述缺陷，满足人们的需要。
[0018]本发明的再 一个目的是提供一种含有分子量为90kDa至130kDa海参糖胺聚糖的药物制剂。
[0019]发明人发现，海参糖胺聚糖抗血小板聚集及抗凝等方面较岩藻糖具有更强的活性。抗血小板药物预防和治疗冠脉综合症的作用非常明显。海参糖胺聚糖具有在一定剂量具有显著抑制血小板聚集作用同时不具有抗凝血活性，相对于市售的同类药物具有显著的安全性优势。
[0020]动物试验证明，重均分子量为90kDa至130kDa海参糖胺聚糖中的一种以上，具有显著的抗血小板聚集、抗凝、促进纤溶、降低血粘度、调节血脂、抗病毒等多种生理活性，可以用于制备治疗冠脉综合症药物；
[0021]所述冠脉综合症包括急性心肌梗死(AMI)、不稳定型心绞痛(UA)或动脉血栓等。
[0022]优选的，所述海参糖胺聚糖的重均分子量为95000Da~125000Da中的一种以上，更优选为1000OODa~120000Da中的一种以上；
[0023]所述的“重均分子量为90000Da至130000Da之间的海参糖胺聚糖中的一种以上”指的是，可以是重均分子量为95000Da至125000Da之间的海参糖胺聚糖中的一个，也可以是重均分子量为1000OODa至1200000Da之间的海参糖胺聚糖各种分子量的组合，为一种组合物。
[0024]本发明所述的海参糖胺聚糖的制备方法，可采用专利“一种玉足海参糖胺聚糖的提取方法”文献提供的方法，优选的，包括如下步骤:
[0025]I)从海参中提取海参多糖；
[0026]从海参中提取海参多糖的步骤，包括对海参进行浸泡、绞碎、酶解并沉淀获得海参多糖粗品，然后对海参多糖粗品纯化、脱色，得到海参多糖；
[0027]所述酶解是用水解蛋白酶和复合胰酶进行酶解；
[0028]所述水解蛋白酶可采用商业化产品，如Alcalase，诺维信(沈阳)生物技术有限公司的产品；所述复合胰酶如无锡市雪梅酶制剂科技有限公司的产品，雪梅牌[0029]对海参多糖粗品纯化是用DEAE-纤维素柱进行纯化。
[0030]所述海参选自玉足海参、黑海参、糙海参、梅花参、二色桌片参、白底福肛参，优选为玉足海参和糙海参；[0031]2)采用是用凝胶过柱收集重均分子量介于90kDa至130kDa之间的海参糖胺聚糖；
[0032]收集的海参糖胺聚糖的多分散度小于2，优选小于1.5，更优选小于1.4 ；
[0033]所述多分散度指的是本领域常用的衡量聚合物分子量分布的指数，用于表征聚合物分子量分布的宽度。多分散度在本文或其他文献中又被称多分散指数、多分散性或分布宽度指数，是重均分子量(Mw)与数均分子量(Mn)之比，即Mw / Mn。这个比值随分子量分布宽度而变化。在单分散时，Mw / Mn等于I，随着分子量分布变宽，Mw / Mn值逐渐变大；
[0034]其中，步骤2)后还包括冷冻干燥的步骤；
[0035]本发明还涉及一种药物组合物，包括治疗有效量的所述的海参糖胺聚糖和药学上可接受的载体；
[0036]所述的载体是指药学领域常规的载体，例如:稀释剂、赋形剂如水等；粘合剂如纤维素衍生物、明胶、聚乙烯吡咯烷酮等；填充剂如淀粉等；崩裂剂如碳酸钙、碳酸氢钠；润滑剂如硬脂酸钙或硬脂酸镁等。另外，还可以在组合物中加入其他辅助剂如香味剂和甜味剂，优选的为甘露醇、乳糖、右旋糖酐、葡萄糖、甘氨酸、水解明胶、聚维酮和氯化钠中的一种或几种，优选甘露醇；
[0037]所述药物组合物为冻干粉针剂时,所述海参糖胺聚糖的重量含量为0.5-2%,优选1% ;静脉滴注速度为100ml/h ;静脉滴注给药剂量为0.01mg/kg~6mg/kg大鼠体重,优选
0.5 ~3mg/kg ；
[0038]本发明的组合物的各种剂型可以采用医学领域常规的方法进行制备，其中活性成分的含量为0.1%~99.5% (重量比)。
[0039]经大量实验研究表明，该药物组合物能安全、有效的用于冠脉综合症的预防和治疗。其预防和治疗冠脉综合症，是与其抗血小板聚集、抑制血小板和内皮细胞的粘附相关。并且近年来随着血小板生理、生化功能的逐步阐明，新型的血小板聚集抑制剂将会不断出现，海参糖胺聚糖组合物在一定剂量下静脉滴注具有显著抑制血小板聚集作用，并且不具有明显抗凝血作用，既由于抗凝作用引发出血的几率更小，因此基于其抗血小板活性的开发，用于治疗冠脉综合症更为安全、有效，具有广阔研究开发前景。
【专利附图】
【附图说明】
[0040]图1本发明的海参糖胺聚糖组合物纯度图。
[0041]图2本发明的海参糖胺聚糖组合物的分子量分布图谱。
【具体实施方式】
[0042]海参主要含有两种多糖一种为海参糖胺聚糖，另一种为海参岩藻多糖。海参多糖同海参皂苷一样也具有多种生理活性，生理活性主要表现为:抑制栓塞、抗凝血、提高免疫力、促进纤维蛋白质溶解、抗肿瘤作用、降血糖等。本发明的海参选自玉足海参、糟海参、黑海参、梅花参、二色桌片参、白底辐肛参，优选玉足海参。其中，玉足海参产于我国南海北海等地，分布广泛、资源丰富、价格适宜，而且海参糖胺聚糖含量丰富，是理想的原材料。
[0043]在本发明的制备海参糖胺聚糖一个优选实施方案中，为了获得适合于静脉注射的高纯度海参糖胺聚糖组合物，可以依次将干燥的玉足海参体壁绞碎，经酶解后离心，上清液用乙醇沉淀，干燥得沉淀物I ;将该沉淀物I加水溶解后，加入氯化钙，离心，上清液用乙醇醇沉，干燥得沉淀物II ;将沉淀物II加水溶解后，加入醋酸钾，取上清液，加乙醇沉淀，干燥得海参多糖粗品；将海参多糖粗品过DEAE-纤维素柱，用乙醇醇沉，加入双氧水脱色处热源，可得分子量为90~130kDa的海参多糖。
[0044]本发明提供一种药物组合物制剂，其中包括海参糖胺聚糖组合物和药学上可接受的载体。本发明是含有海参糖氨基糖的药物制剂为冻干粉针剂，药学上可接受的载体甘露醇、、乳糖、右旋糖酐、葡萄糖、甘氨酸、水解明胶、聚维酮和氯化钠中的一种或几种。本发明的药物组合物中活性成分的含量为0.5~3%，，优选1%。
[0045]本发明提供一种药物组合物制剂在防治冠脉综合症的药物中的应用。优选非ST段抬高心梗给药的剂量一般由医师根据患者的具体情况(如年龄、体重、性别、患病时间、身体状况等)确定。一般而言，以海参糖胺聚糖计，给药的剂量为0.1~5mg/kg患者体重，优选为 0.1 ~lmg/kg,优选为 0.1 ~0.6mg/kg。
[0046]为了便于理解，以下将通过具体的附图和实施例对本发明进行描述。需要特别指出的是，这些描述仅仅是示例性的描述，并不构成对本发明范围的限制。
[0047]实施例1
[0048]称取玉足海参药材2kg，水浸过夜。将海参体壁淋干水分，绞碎，称重并补水至6Kg，置60°C水浴中，加入氢氧化钠调pH至8.0±0.2，加入水解蛋白酶Alcalase40ml (投料量的2%)搅拌，酶解4小时，85°C以上灭活10分钟，降温至50°C ±2°C，加入氢氧化钠调pH至8.0±0.2，再加复合胰酶IOg (投 料量的0.2%)搅拌酶解4小时，煮沸5分钟，冷却。4°C离心，收集上清液，加入盐酸调PH至2.5±0.2，4°C冷藏2小时，离心，收集上清液，调pH至7.0±0.2，加0.8倍乙醇，4°C静置过夜。
[0049]离心，收集沉淀称重，加15倍(v/w)蒸馏水，加热至85°C ±2°C，待完全溶解后，加入氢氧化钠PH调至9.0±0.2，按量加入氯化钙至溶液最终浓度达到3%，升温至90°C以上保持10分钟，冷却至室温，4°C离心，收集上清液，用饱和碳酸钠溶液调pH至11.0±0.2，离心，收集上清液，用6mol/LHCl溶液调pH至6.0±0.2，加0.8倍乙醇，4°C冷藏过夜。
[0050]冷藏液离心，收集沉淀称重，加2倍体积蒸馏水，加热使其充分溶解，加乙酸钾使其最终浓度为2mol/L，4°C静置过夜。离心，收集沉淀称重，加2倍体积蒸馏水，加热使其充分溶解，加乙酸钾使其最终浓度为2mol/L，4°C静置过夜。离心，沉淀用冷2mol/L乙酸钾溶液洗涤三次，然后依次用体积浓度80%乙醇、体积95%乙醇、无水乙醇洗涤，待乙醇挥发尽后80°C干燥，称重，得粗品III。
[0051]粗品III 35g加0.05mol/L、pH6.0的HAc-NaAc缓冲液溶解制成重量浓度2%的溶液上柱，溶液通过纤维素层析柱后，用1.5倍柱体积的0.4mol/LNaCl的HAc-NaAc缓冲液(ρΗ6.0±0.2)洗涤，再用lmol/LNaCl的HAc-NaAc缓冲液(ρΗ6.0±0.2)洗脱，根据紫外检测仪在220nm处数值的变化速度收集洗脱液，置60°C水浴中，用NaOH调pH至11 ±0.2，按体积量加入3%双氧水，保持4小时，冷却，离心，收集上清液，用HCl调pH至7.0±0.2，加I倍量乙醇，4°C静置过夜。[0052]离心，收集沉淀，依次用95%乙醇、无水乙醇，称重(湿重)，得粗品V。
[0053]粗品V用蒸馏水溶解成5%的溶液，用截留分子量I万的超滤膜浓缩至原体积的1/2，补加水至原体积，再超滤至1/2体积，再加水重复一次，超滤液冷冻干燥，得海参糖胺聚糖，其分子量都在90kDa~130kDa，D值< 1.5，纯度为98%以上。
[0054]该实例得到的海参糖胺聚糖，经示差折光检测器(RID-10A，岛津)可得到纯度为100.0%的纯品(见图1)。
[0055]经该实例得到的海参糖胺聚糖经凝胶柱(TSK gel G4000PWXL)色谱分析知该产品的重均分子量108756，D值为1.40 (见图2)，其中:图2A为色谱图，图2B为分子量分布图，图2C为分子量累积重量分布曲线。
[0056]注射用含有海参糖胺聚糖的药物组合物的制备，以上IOg海参糖胺聚糖加入注射用水，配成1%的溶液，再加入甘露醇20g溶解，精滤，灌装，冷冻干燥，得到1000支注射用海参糖胺聚糖的冻干粉针剂。
[0057]实施例2
[0058]海参糖胺聚糖的药效学研究
[0059]I海参糖胺聚糖对大鼠凝血系统的影响
[0060]1.1试验目的
[0061]观察舌下静脉注射海参糖胺聚糖后对大鼠凝血系统的影响。
[0062]1.2试验材料
[0063]1.2.1供试样品:
[0064]实施例1的海参糖胺聚糖；配制:精密称取后以注射用生理盐水溶解并稀释至所需浓度。
[0065]1.2.2试验动物:
[0066]品系:SD大鼠；来源:上海西普尔-必凯实验动物有限公司；性别:雄性；体重:220-250克；动物合格证号:SCXK (沪)2008-0016 ;饲养:动物饲养于正压净化通风动物房内，室温23 ± I °C，湿度50~70 %，人工照明模拟昼夜变化，自由进食与饮水。
[0067]1.2.3试验仪器
[0068]自动凝血分析仪Sysmex CA-1500
[0069]1.3试验方法
[0070]将SD大鼠40只，分成4个不同的给药组，阴性对照组(舌下静脉注射生理盐水0.5ml/100g) ；GAG低、中、高三个剂量组(0.3,0.6、lmg/kg)舌下静脉注射给药，体积
0.5ml/100g,注射速度 lmin。
[0071]GAG低、中、高三个剂量组，空白对照组舌下静脉注射给药后30min腹主动脉采血测定PT、APTT、TT数值。
[0072]各组动物在手术前IOmin用3%速可眠腹腔注射麻醉(0.lml/100g体重)，仰卧固定后腹腔手术，用一次性3.2%柠檬酸钠抗凝真空采血管采血。
[0073]1.4试验结果
[0074]GAG在低、中剂量(0.3mg/kg，(X6mg/kg)对APTT、TT、PT均无明显影响。但是在lmg/kg时则产生较明显的改变，但是未超过150% — 250%的范围。
[0075]表1GAG大鼠凝血时间
【权利要求】
1.海参糖胺聚糖在制备治疗冠脉综合症药物中的应用，所述海参糖胺聚糖的重均分子量为90kDa至130kDa的海参糖胺聚糖中的一种以上。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，优选的，所述海参糖胺聚糖的重均分子量为95kDa~125kDa中的一种以上，更优选为90kDa~120kDa中的一种以上。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述冠脉综合症包括急性心肌梗死、不稳定型心绞痛或动脉血栓。
4.一种药物组合物，包括治疗有效量的权利要求1~3任一项所述的海参糖胺聚糖和药学上可接受的载体。
5.根据权利要求4所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物为冻干粉针剂。
6.根据权利要求5所述的药物组合物，其特征在于，所述海参糖胺聚糖的重量含量为0.5-2%。
7.根据权利要求6所述的药物组合物，其特征在于，静脉滴注速度为100ml/h;静脉滴注给药剂量6mg/kg~0.01mg /kg大鼠体重。
【文档编号】A61P9/10GK103536621SQ201210240028
【公开日】2014年1月29日 申请日期:2012年7月11日 优先权日:2012年7月11日
【发明者】王志国, 刘全海, 汪寄宇 申请人:上海开润生物医药有限公司, 哈尔滨红豆杉生物制药有限公司