猪传染性胸膜肺炎、猪链球菌二联灭活疫苗及其制备方法
【专利摘要】本发明提供了3株猪传染性胸膜肺炎放线杆菌和2株猪链球菌，几种抗原配合使用，可以将抗原之间的相互干扰将至最低；基于上述发现，本发明提供了一种具有良好的免疫原性的猪传染性胸膜肺炎、猪链球菌病二联灭活疫苗；该疫苗使用了灭活的猪传染性胸膜肺炎放线杆菌1、5、7型与猪链球菌作为抗原，其具有超强毒力及免疫原性，在疫苗制备过程中可使用较少的抗原量达到较好的免疫效果，从而降低生产及使用成本，适宜大规模生产及养殖场中的应用。本发明的猪传染性胸膜肺炎、猪链球菌二联灭活疫苗，在与单苗相同生产成本及销售价格的水平上，达到一针两防的效果，可代替单苗使用，从而大大降低了免疫成本，具有商业上的成功潜力。
【专利说明】猪传染性胸膜肺炎、猪链球菌二联灭活疫苗及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种猪传染性胸膜肺炎、猪链球菌二联灭活疫苗及其制备方法，属于兽药疫苗领域。
【背景技术】
[0002]猪传染性胸膜肺炎是由胸膜肺炎放线杆菌(ActionobacillusPleuropneumoniae,APP)引起的一种呼吸系统重要传染病。本病主要引起猪的一种伴有胸膜炎的纤维素性、出血性、坏死性肺炎，多呈最急性或急性病程而迅速死亡，发病率和死亡率均在50%以上，它可发生于任何年龄的猪只，尤其是在集约化养猪场，一旦发生会造成重大经济损失。
[0003]猪胸膜肺炎放线杆菌又称为副溶血嗜血杆菌(H.parahaemoIyties),该病原菌生长要求严格，为革兰氏阴性球杆菌，有荚膜。该病原菌血清型众多，根据NAD依赖性，可以分为生物I型和生物II型，其中依赖NAD的猪胸膜肺炎放线杆菌划为生物I型(Biovar I)，不依赖NAD的猪胸膜肺炎放线杆菌划为生物II型(Biovar II)，采用传统血清型方法，又可细分为15个血清型；其中生物I型包括血清1-12型和15型，生物II型包括血清13型和14型。猪胸膜肺炎病的病原血清型众多，给猪胸膜肺炎病的预防与控制带来了困难。
[0004]猪链球菌(Streptococcus suis)是条件致病菌,广泛分布于自然界中，在动物的呼吸道、肠道、生殖道等处常在，可引起猪脑膜炎、关节炎、心内膜炎、败血症、肺炎和突然死亡，严重危害养猪业的发展。猪链球菌为革兰氏阳性菌，可在外界环境中存活很长时间，特别是在粪便中及被污染的环境和带菌猪是重要的传染源，超急性死亡的猪只不出现任何症状。猪只不分品种、年龄和性别，一年四季都可以感染本病，哺乳和断奶后仔猪发病死亡率高达80%以上，并有一定人畜共感染性。猪链球菌至少分为5种类型:急性败血性、脑膜炎性、关节炎性、脓肿性和无乳型。
[0005]由于猪胸膜肺炎病血清型和猪链球菌的类型众多，对两种疾病共感染、同时发病的养殖场，没有有效的应对措施，常常带来巨大损失。
【发明内容】
[0006]有鉴于此，本发明的主要目的在于提供一种新型猪传染性胸膜肺炎、猪链球菌病二联多价灭活疫苗，包含至少一种已灭活的猪传染性胸膜肺炎放线杆菌抗原和至少一种猪链球菌抗原，以预防和治疗猪胸膜肺炎病和猪链球菌引起的疾病。
[0007]猪传染性胸膜肺炎放线杆菌抗原是指含有至少一种猪传染性胸膜肺炎放线杆菌抗原形式的任何组合物，所述猪传染性胸膜肺炎放线杆菌抗原接种猪可诱导、刺激或增强抵抗猪传染性胸膜肺炎放线杆菌感染的免疫应答。猪传染性胸膜肺炎放线杆菌为包括本领域技术人员熟知的临床分离的野毒株，包含目前已鉴定的I~15个血清型。优选地，所述猪传染性胸膜肺炎放线杆菌抗原是完整的猪传染性胸膜肺炎放线杆菌，优选为灭活形式，更优选，所述猪传染性胸膜肺炎放线杆菌抗原是灭活的血清型为I型、5型和7型的混合抗原；最优选为灭活的猪传染性胸膜肺炎放线杆菌血清I型LC株，和灭活的猪传染性胸膜肺炎放线杆菌血清5型YC株，和灭活的猪传染性胸膜肺炎放线杆菌血清7型YS株。
[0008]本发明的猪传染性胸膜肺炎放线杆菌抗原还可以包含以下组合物的任一种抗原:如武汉科前动物生物制品有限责任公司的猪传染性胸膜肺炎三价灭活疫苗(APP血清型I型、2型和7型)；中牧实业股份有限公司成都药械厂的猪传染性胸膜肺炎三价灭活疫苗(APP血清I型、2型和7型)。
[0009]正如本领域技术人员所知，不同的微生物野外分离株在基因序列上有微小的变异，然而，当变异不影响其蛋白质合成、结构或者主要作用功能区时，该微生物之他种野外分离株即使基因序列无法百分之百相同，其基本的生理功能并不会有所改变。因此，目前国际上常使用16S Ribosomal RNA (16S rRNA)来进行细菌型的分辨，因此在相似性的比较上可以用16S rRNA来进行比对而得到其同源性。所以，在16S rRNA具有同源性的前提下，本发明所使用的猪传染性胸膜肺炎放线杆菌抗原并不限定于本发明所使用的野外分离株。
[0010]16s rRNA基因是细菌染色体上编码rRNA相对应的DNA序列，存在于所有细菌的染色体基因组中。16S rRNA具有高度的保守性和特异性以及该基因序列足够长(包含约50个功能域)。
[0011]因此，本发明包括与猪传染性胸膜肺炎放线杆菌三株菌株(LC株、YC株和YS株)16S rRNA的同源性在80%上以上的菌株，更优选与LC株或YC株或YS株16S rRNA同源性在至少90%以上，优选地至少95%以上，更优选地至少95%~99%以上的猪传染性胸膜肺炎放线杆菌菌株，即不改变猪传染性胸膜肺炎放线杆菌三株菌株(LC株、YC株和YS株)16SrRNA的前提下，本领域技术人员可以通过简单的筛选或诱变本发明的猪传染性胸膜肺炎放线杆菌，获得与本发明猪传染性胸膜肺炎放线杆菌16S rRNA高度同源的菌株，并获得相应地具有相同或相似免疫原性的抗原组合物。
[0012]猪链球菌抗原是指含有至少一种猪链球菌抗原形式的任何组合物，所述猪链球菌抗原接种猪可诱导、刺激或增强抵抗猪链球菌感染的免疫应答。猪链球菌为包括本领域技术人员熟知的临床分离的野毒株，包含目前已鉴定的I~9个起致病作用的血清型。优选地，所述猪链球菌抗原是完整的猪链球菌，优选为灭活形式，更优选，所述猪链球菌抗原是灭活的血清型为2型和猪链球菌C群马链球菌兽疫亚种的混合抗原；最优选为灭活的猪链球菌血清2型SC株，和灭活的猪链球菌C群马链球菌兽疫亚种。
[0013]本发明的猪链球菌抗原还可以包含以下组合物的任一种抗原:如武汉科前动物生物制品有限责任公司的猪链球菌病灭活疫苗(马链球菌兽疫亚种+猪链球菌2型+猪链球菌7型)；上海海利生物技术股份有限公司的猪链球菌病灭活疫苗(马链球菌兽疫亚种+猪链球菌2型)；广东永顺生物制药有限公司的猪链球菌2型灭活疫苗；山东滨州华宏生物制品有限责任公司的猪链球菌病灭活疫苗(马链球菌兽疫亚种+猪链球菌2型)。
[0014]还包括在16S rRNA具有同源性的前提下，本发明所使用的猪链球菌抗原并不限定于本发明所使用的野外分离株。本发明还包括与猪链球菌两株菌株(SC株和马链球菌兽疫亚种)16S rRNA的同源性在80%上以上的菌株，更优选与SC株或马链球菌兽疫亚种16SrRNA同源性在至少90%以上，优选地至少95%以上，更优选地至少95%~99%以上的猪链球菌菌株，即不改变猪链球菌两株菌株(SC株和马链球菌兽疫亚种)16S rRNA的前提下，本领域技术人员可以通过简单的筛选或诱变本发明的猪链球菌，获得与本发明猪链球菌16SrRNA高度同源的菌株，并获得相应地具有相同或相似免疫原性的抗原组合物。
[0015]发明人通过长期的研究和大量的试验，发现目前猪传染性胸膜肺炎、猪链球菌病缺少合适治疗措施，特别是缺少合适的二联疫苗的原因在于，猪传染性胸膜肺炎放线杆菌的血清型众多，和猪链球菌亚型和/或亚种众多，制备针对猪传染性胸膜肺炎或猪链球菌病的单苗中多价抗原之间就会相互干扰，从而影响其疫苗的总体免疫效果。但发明人在长期的研究和大量的试验中，意外地发现了将猪传染性胸膜肺炎放线杆菌的至少三种血清型，和猪链球菌至少两种亚型或亚型联用时，会减少抗原之间的相互影响；特别是当使用猪传染性胸膜肺炎放线杆菌的三种血清型1、5、7型时，会显著地减少抗原之间的影响，在减少抗原用量的同时，获得良好的免疫原性，可以用于同时预防和治疗猪传染性胸膜肺炎和猪链球菌病。
[0016]更出乎意料地，发明人还获得了 3株猪传染性胸膜肺炎放线杆菌和I株猪链球菌，与保藏号ATCC35246的猪链球菌配合使用，可以将抗原之间的相互干扰将至最低，而获得一种具有良好的免疫原性的猪传染性胸膜肺炎、猪链球菌病二联灭活疫苗
[0017]基于上述发现，本发明的第一方面为提供猪传染性胸膜肺炎、猪链球菌病二联灭活疫苗，其含有猪传染性胸膜肺炎放线杆菌血清型的抗原和猪链球菌亚型或亚种的抗原。
[0018]优选地，本发明所述的二联灭活疫苗为含有至少三种猪传染性胸膜肺炎放线杆菌血清型的抗原和至少两种猪链球菌亚型或亚种的抗原。更优选地，本发明所述的二联灭活疫苗中，含有猪传染性胸膜肺炎放线杆菌血清I型、血清5型和血清7型的抗原；以及猪链球菌2型的抗原。
[0019]优选地，本发明所述的二联灭活疫苗，含有猪传染性胸膜肺炎放线杆菌血清I型LC株、血清5型YC株、血清7型YS株、猪链球菌2型(R群)SC株和猪链球菌C群马链球菌兽疫亚种的抗原。
[0020]优选地，本发明所述的二联灭活疫苗，所述二联灭活疫苗中抗原比例为:猪传染性胸膜肺炎放线杆菌血清I型LC株:血清5型YC株:血清7型YS株:猪链球菌2型SC株:猪链球菌C群马链球菌兽疫亚种=2:2:2:1:1。
[0021]优选地，本发明所述的二联灭活疫苗，据权利要求4所述的二联灭活疫苗，其特征在于，所述二联灭活疫苗中抗原的含量为:灭活前猪传染性胸膜肺炎放线杆菌血清I型、血清5型、血清7型活菌数各自均不少于5.0XlO7CFU / mL，猪链球菌2型和马链球菌兽疫亚种活菌数各自均不少于5X IO9CFU / mL ;或上述抗原总体积为所述疫苗总体积的75%~90%。
[0022]其次，目前在用于预防和治疗猪传染性胸膜肺炎或猪链球菌病的疫苗中，所用的佐剂为油性疫苗，这也是因为猪传染性胸膜肺炎放线杆菌的血清型众多，和猪链球菌亚型和/或亚种众多，在使用水性佐剂时，多价抗原之间就会相互干扰，从而影响其疫苗的总体免疫效果；而发明人通过大量实验，意外地发现在本发明的上述二联灭活疫苗中，加入水性佐剂并不会降低疫苗的免疫原性。
[0023]因此，本发明的第二方面在于提供含上述抗原的二联灭活疫苗水性佐剂；即本发明所述的二联灭活疫苗，还含有佐剂；更优选地，所述佐剂为水性佐剂；最优选地，所述水性佐剂选自Montanide GEL PR聚合物及其同系物的一种或几种。
[0024]此外，本发 明的疫苗还可以含有防腐剂、免疫增强剂等公知的疫苗佐剂；优选地，本发明所述的二联灭活疫苗，还含有疫苗总量0.01%的硫柳汞。
[0025]本发明的第三方面为提供上述发现中的猪传染性胸膜肺炎放线杆菌和猪链球菌，其具有超强毒力及免疫原性，在疫苗制备过程中可使用较少的抗原量达到较好的免疫效果，从而降低生产及使用成本，具体为:
[0026]猪传染性胸膜肺炎放线杆菌血清I型LC株，由普莱柯生物工程股份有限公司分离、鉴定，已在中国典型培养物中心(简称CCTCC)进行保藏，保藏日期:2011年12月9日，保藏号为:CCTCC M 2011458，地址为中国武汉?武汉大学；猪传染性胸膜肺炎放线杆菌血清5型YC株，由普莱柯生物工程股份有限公司分离、鉴定，已在中国典型培养物中心进行保藏，保藏日期:2011年12月9日，保藏号为=CCTCCM 2011459 ;猪传染性胸膜肺炎放线杆菌血清7型YS株，由普莱柯生物工程股份有限公司分离、鉴定，已在中国典型培养物中心进行保藏，保藏日期:2011年12月9日，保藏号为=CCTCC M 2011460。
[0027]猪链球菌2型SC株，由普莱柯生物工程股份有限公司分离、鉴定，已在中国典型培养物中心进行保藏，保藏日期:2011年10月12日，保藏号为:CCTCC M 2011351。
[0028]本发明的第三方面为提供了上述猪传染性胸膜肺炎、猪链球菌病二联灭活疫苗的制备方法，包括以下步骤:
[0029]I)分别繁殖培养猪传染性胸膜肺炎放线杆菌、猪链球菌；
[0030]2)灭活并以一定 比例混合；
[0031]3)加入佐剂和/或防腐剂；和/或免疫提高剂，既得猪传染性胸膜肺炎、猪链球菌病二联灭活疫苗的成品。
[0032]优选地，本发明的二联灭活疫苗的制备方法，进一步包括以下步骤:
[0033]1.根据权利要求13所述的二联灭活疫苗，其特征在于，所述步骤为:
[0034]⑴分别将猪传染性胸膜肺炎放线杆菌血清I型LC株、血清5型YC株、血清7型YS株、猪链球菌2型(R群)SC株和猪链球菌C群马链球菌兽疫亚种菌种繁殖培养，得到猪传染性胸膜肺炎放线杆菌血清I型LC株、血清5型YC株、血清7型YS株、猪链球菌2型(R群)SC株和猪链球菌C群马链球菌兽疫亚种菌液；
[0035]⑵分别将步骤⑴培养得到的猪传染性胸膜肺炎放线杆菌血清I型LC株、血清5型YC株、血清7型YS株、猪链球菌2型(R群)SC株和猪链球菌C群马链球菌兽疫亚种菌液中按各自总量加入0.2%的甲醛溶液，放置37°C灭活24h，期间搅拌3~5次，根据计数结果浓缩菌液；
[0036]⑶将上述已灭活、浓缩的猪传染性胸膜肺炎放线杆菌血清I型LC株、血清5型YC株、血清7型YS株、猪链球菌2型(R群)SC株和猪链球菌C群马链球菌兽疫亚种菌液，按2:2:2:1:1比例混合，并加入疫苗总量0.01%的硫柳汞，然后和佐剂进行乳化，佐剂含量为10%~25% ;成品猪传染性胸膜肺炎、猪链球菌病二联灭活疫苗抗原含量为灭活前猪传染性胸膜肺炎放线杆菌血清I型、血清5型、血清7型活菌数均不少于5.0X IO7CFU / mL，猪链球菌2型和马链球菌兽疫亚种活菌数均不少于5 X IO9CFU / mL。
[0037]由上可见，本发明的二联灭活疫苗可以用于预防和治疗猪传染性胸膜肺炎、猪链球菌病。
[0038]技术效果
[0039]本发明的至少有以下优点:[0040]1.本发明第一次解决了同时预防和治疗猪传染性胸膜肺炎、猪链球菌病的难题，克服了猪传染性胸膜肺炎放线杆菌和猪链球菌类型众多引起相互配合的困难，提供了能够具有良好免疫原性的抗原组合物；
[0041]2.本发明发现了 3株猪传染性胸膜肺炎放线杆菌和I株猪链球菌，几种抗原配合使用，可以将抗原之间的相互干扰将至最低，而获得一种具有良好的免疫原性的猪传染性胸膜肺炎、猪链球菌病二联灭活疫苗；
[0042]3.本发明使用了灭活的猪传染性胸膜肺炎放线杆菌1、5、7型与猪链球菌作为抗原，其具有超强毒力及免疫原性，在疫苗制备过程中可使用较少的抗原量达到较好的免疫效果，从而降低生产及使用成本，适宜大规模生产及养殖场中的应用；
[0043]4.本发明在疫苗的制备中，使用了中空纤维超滤器浓缩、生理盐水悬浮的配苗菌液大大减少了毒素，优化工艺的同时，提高了疫苗的安全性。
[0044]5.本发明首先在猪传染性胸膜肺炎、猪链球菌二联灭活疫苗使用了水性佐剂，减少了使用油性佐剂免疫猪只而发生的应激反应，不仅符合当今猪用疫苗水性佐剂发展趋势，减少了配苗过程中繁琐的程序，并降低了人力物力的需求。代表了当今猪用疫苗新的发展趋势，具有推广潜力。
[0045]6.本发明的猪传染性胸膜肺炎、猪链球菌二联灭活疫苗，在与单苗相同生产成本及销售价格的水平上，达到一针两防的效果，可代替单苗使用，从而大大降低了免疫成本，具有商业上的成功潜力。
【具体实施方式】
[0046]本发明实施例中的具体实验方法可参见《中华人民共和国兽药典(二〇一〇年版)》及附录。其他未注明的试剂或原料均可由本领域技术人员根据现有技术获得。
[0047]下面结合具体实·施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
[0048]实施例1猪传染性胸膜肺炎、猪链球菌二联灭活疫苗的制备
[0049]1.菌种
[0050]猪传染性胸膜肺炎放线杆菌血清I型LC株，由普莱柯生物工程股份有限公司分离、鉴定，已在中国典型培养物中心进行保藏，保藏日期:2011年12月9日，保藏号为:CCTCC M 2011458。
[0051]猪传染性胸膜肺炎放线杆菌血清2型XT株，公开于中国专利CN102391975A，保藏号为:CCTCC NO M 2011410。
[0052]猪传染性胸膜肺炎放线杆菌血清5型YC株，由普莱柯生物工程股份有限公司分离、鉴定，已在中国典型培养物中心进行保藏，保藏日期:2011年12月9日，保藏号为:CCTCC M2011459。
[0053]猪传染性胸膜肺炎放线杆菌血清7型YS株，由普莱柯生物工程股份有限公司分离、鉴定，已在中国典型培养物中心进行保藏，保藏日期:2011年12月9日，保藏号为:CCTCC M2011460。[0054]猪链球菌2型SC株，由普莱柯生物工程股份有限公司分离、鉴定，已在中国典型培养物中心进行保藏，保藏日期:2011年10月12日，保藏号为=CCTCC M2011351。
[0055]猪链球菌C群马链球菌兽疫亚种，来自美国菌种保藏中心，保藏号ATCC35246。
[0056]为获得免疫性强的菌种，各菌种经敏感猪体复壮鉴定合格后冻干保存并包藏。
[0057]2.猪传染性胸膜肺炎、猪链球菌二联灭活疫苗的制备
[0058]2.1.生产用种子的制备
[0059]猪传染性胸膜肺炎放线杆菌血清I型LC株、2型XT株、5型YC株、7型YS株冻干菌种，分别划线接种于TSA/NAD (含5%小牛血清)平板上，置37°C培养16~24小时，选取符合要求的菌落，接种于TSB/NAD (含5%小牛血清)液体培养基中，37°C培养12~16小时，作为一级种子；猪链球菌2型SC株、C群马链球菌兽疫亚种ATCC35246株冻干菌种，分别划线接种于Clumbia羊血平板上，置37°C培养18~24小时作为一级种子。
[0060]猪传染性胸膜肺炎放线杆菌血清I型LC株、2型XT株、5型YC株、7型YS株取一级种子的培养物，按0.1%的量加入TSB/NAD(含5%小牛血清)液体培养基中，37°C培养12~16小时，经检验纯粹后作为二级种子；猪链球菌2型SC株、C群马链球菌兽疫亚种ATCC35246株分别选取符合要求的菌落，接种于含有15ml/L犊牛血清的改良马丁肉汤培养基中，37°C静置培养12~16小时，经羊血平板纯粹检验合格后作为二级种子。
[0061]采用商售的猪传染性胸膜肺炎放线杆菌培养基、猪链球菌培养基。
[0062]2.2.菌液的培养
[0063]在猪传染性胸膜肺炎放线杆菌培养基(商售TSB)中，加入0.01%~0.05%NAD、5%~10%的血清，将猪传染性胸膜肺炎放线杆菌血清I型LC株、2型XT株、5型YC株、7型YS株菌液分别按0.1%的量加进培养基中分别培养，混匀后置37°C培养16~18小时，当菌液的浓度0D600达到2.5以上、DO值开始上升、PH值降低到6.5以下时停止培养。
[0064]在猪链球菌培养基(商售改良马丁肉汤)中，加入1.5%的L犊牛血清、0.1%~5%的葡萄糖，将猪链球菌2型SC株、C群马链球菌兽疫亚种ATCC35246株菌液分别按5%的量加进培养基中培养，混匀后置37°C培养16~18小时，当菌液浓度0D600达到2.5以上、DO值开始上升、PH值降低到6.0以下时停止培养。
[0065]2.3.灭活
[0066]向上述六种培养好的菌液中，按总量的0.2% (V/V)分别加入甲醛溶液，放置于37°C灭活24h，期间搅拌3~5次。
[0067]2.4.检验
[0068]取已经灭活的4种猪传染性胸膜肺炎放线杆菌菌液分别取5mL接种于IOOmL含0.01%~0.05%NAD、5%~10%的血清的猪传染性胸膜肺炎放线杆菌TSB培养基中，37°C培养24小时，再移植于上述IOOmL培养基中37°C培养24小时；取灭活的3种猪传染性胸膜肺炎放线杆菌菌液0.5mL划线接种于TSA/NAD平板培养基，37°C培养24小时。两种方法培养后，均无菌生长。
[0069]取已经灭活的2种猪链球菌菌液分别5mL接种于IOOmL加入1.5%的L犊牛血清、0.1%~5%的葡萄糖改良马丁肉汤培养基，37°C培养24小时，再移植于上述IOOmL培养基中37°C培养24小时；取已经 灭活的2种猪链球菌菌液0.5mL划线接种于羊血琼脂平板培养基，37°C培养24小时。两种方法培养后，均无菌生长。[0070]取上述六种已灭活的菌液分别静脉注射18~22g的Balb/C小鼠5只，每只0.2mL，三天内5/5健活，方为灭活彻底。[0071]3.猪传染性胸膜肺炎、猪链球菌二联灭活疫苗的配制
[0072]3.1.疫苗具体成分配比
[0073]现有的6种抗原成分(猪传染性胸膜肺炎放线杆菌血清I型LC株、2型XT株、5型YC株、7型YS株、猪链球菌2型SC株和C群马链球菌兽疫亚种ATCC35246株)可按照不同的搭配方式制成以下45种猪传染性胸膜肺炎、猪链球菌二联灭活疫苗。抗原总含量体积百分比在75%~90%，Montanide GEL PR佐剂占10%~25%，此处我们选择抗原总含量最优体积百分比90% ,Montanide GEL PR佐剂最优体积百分比10%。猪传染性胸膜肺炎放线杆菌血清I型LC株、2型XT株、5型YC株和7型YS株各占总体积20%，猪链球菌2型SC株和C群马链球菌兽疫亚种ATCC35246株各占总体积10% ,Montanide GEL PR佐剂占总体积10%,抗原成分不足90%部分以PBS补足。
[0074]本次配苗使用的抗原灭活前活菌数分别为猪传染性胸膜肺炎放线杆菌血清I型LC株5.0X 109CFU/ml、猪传染性胸膜肺炎放线杆菌血清2型XT株3.0X 109CFU/ml、猪传染性胸膜肺炎放线杆菌血清5型YC株2.0X 109CFU/ml、猪传染性胸膜肺炎放线杆菌血清7型YS株3.7X 109CFU/ml、猪链球菌2型SC株7.0 X 109CFU/ml和C群马链球菌兽疫亚种ATCC35246株8.0 X 109CFU/ml。配苗时疫苗中所含灭活前猪传染性胸膜肺炎放线杆菌血清I型LC株、血清2型XT株、血清5型YC株、血清7型YS株活菌数均调整为5.0X IO7CFU /mL，猪链球菌2型SC株和马链球菌兽疫亚种ATCC35246株活菌数均调整为5 X IO9CFU / mL。
[0075]表1疫苗具体成分配比
[0076]
【权利要求】
1.一种猪传染性胸膜肺炎、猪链球菌病的二联灭活疫苗，其特征在于，含有至少一种猪传染性胸膜肺炎放线杆菌抗原和至少一种猪链球菌抗原。
2.根据权利要求1所述的二联灭活疫苗，其特征在于，含有三种猪传染性胸膜肺炎放线杆菌血清型抗原和两种猪链球菌亚型或亚种抗原。
3.根据权利要求1所述的二联灭活疫苗，其特征在于，所述二联灭活疫苗含有猪传染性胸膜肺炎放线杆菌血清I型、血清5型和血清7型的抗原；以及猪链球菌2型和猪链球菌C群马链球菌兽疫亚种的抗原。
4.根据权利要求3所述的二联灭活疫苗，其特征在于，所述二联灭活疫苗含有猪传染性胸膜肺炎放线杆菌血清I型LC株、血清5型YC株、血清7型YS株、猪链球菌2型SC株和猪链球菌C群马链球菌兽疫亚种的抗原。
5.根据权利要求4所述的二联灭活疫苗，其特征在于，所述二联灭活疫苗中抗原比例为:猪传染性胸膜肺炎放线杆菌血清I型LC株:血清5型YC株:血清7型YS株:猪链球菌2型SC株:猪链球菌C群马链球菌兽疫亚种=2:2:2:1:1。
6.根据权利要求4所述的二联灭活疫苗，其特征在于，所述二联灭活疫苗中抗原的含量为:灭活前的猪传染性胸膜肺炎放线杆菌血清I型、血清5型、血清7型活菌数各自均不少于5.0X IO7CFU / mL，猪链球菌2型和马链球菌兽疫亚种活菌数各自均不少于5 X IO9CFU / mL ;或上述抗原总体积为所述疫苗总体积的75%~90%。
7.根据权利要求1~6任意一项所述的二联灭活疫苗，其特征在于，所述二联灭活疫苗中含有佐剂。
8.根据权利要求7所述的二联灭活疫苗，其特征在于，所述佐剂为水性佐剂。
9.根据权利要求8所述的二联灭活疫苗,其特征在于,所述水性佐剂选自MontanideGEL PR聚合物及其同系物的一种或几种。
10.一种猪传染性胸膜肺炎放线杆菌，其特征在于，所述猪传染性胸膜肺炎放线杆菌分别为猪传染性胸膜肺炎放线杆菌血清I型LC株，保藏号为CCTCC M2011458 ;猪传染性胸膜肺炎放线杆菌血清5型YC株，保藏号为:CCTCC M 2011459 ;猪传染性胸膜肺炎放线杆菌血清7型YS株，保藏号为=CCTCC M 2011460。
11.一种猪链球菌，其特征在于，所述猪链球菌分别为猪链球菌2型SC株，保藏号为:CCTCC M 2011351。
12.—种猪传染性胸膜肺炎、猪链球菌病的二联灭活疫苗的制备方法，包括以下步骤: O分别繁殖培养猪传染性胸膜肺炎放线杆菌、猪链球菌； 2)灭活并以一定比例混合； 3)加入佐剂和/或防腐剂；和/或免疫提高剂，即得猪传染性胸膜肺炎、猪链球菌病的二联灭活疫苗的成品； 更优选地，所述步骤为: ⑴分别将猪传染性胸膜肺炎放线杆菌血清I型LC株、血清5型YC株、血清7型YS株、猪链球菌2型(R群)SC株和猪链球菌C群马链球菌兽疫亚种菌种繁殖培养，得到猪传染性胸膜肺炎放线杆菌血清I型LC株、血清5型YC株、血清7型YS株、猪链球菌2型(R群)SC株和猪链球菌C群马链球菌兽疫亚种菌液； ⑵分别将步骤⑴培养得到的猪传染性胸膜肺炎放线杆菌血清I型LC株、血清5型YC株、血清7型YS株、猪链球菌2型(R群)SC株和猪链球菌C群马链球菌兽疫亚种菌液中按各自总量加入0.2%的甲醛溶液，放置37°C灭活24h，期间搅拌3~5次，根据计数结果浓缩菌液； ⑶将上述已灭活、浓缩的猪传染性胸膜肺炎放线杆菌血清I型LC株、血清5型YC株、血清7型YS株、猪链球菌2型(R群)SC株和猪链球菌C群马链球菌兽疫亚种菌液，按2:2:2:1:1比例混合，并加入疫苗总量0.01%的硫柳汞，然后和佐剂进行乳化，佐剂含量为10%~25% ;成品猪传染性胸膜肺炎、猪链球菌病二联灭活疫苗抗原含量为灭活前猪传染性胸膜肺炎放线杆菌血清I型、血清5型、血清7型活菌数均不少于5.0X 1O7CFU / mL，猪链球菌2型和马链球菌兽疫亚种活菌数均不少于5 X IO9CFU / mL。
13.如权利要求1-9任意一项所述的二联灭活疫苗在制备预防和治疗猪传染性胸膜肺炎、猪链球菌病中药物的应用。
【文档编号】A61K39/116GK103566364SQ201210256034
【公开日】2014年2月12日 申请日期:2012年7月23日 优先权日:2012年7月23日
【发明者】张许科, 孙进忠, 白朝勇 申请人:普莱柯生物工程股份有限公司