专利名称：一种抑制心肌细胞凋亡的药物的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种医用配置品，具体涉及一种含来自黄芪属与当归属植物的有效成分的药物制剂。
背景技术：
在动脉粥样硬化、高血压、心肌病、心肌缺血-再灌注损伤等临床上常见的心血管疾病中，心肌细胞凋亡在其病理生理变化中起了重要的作用。活性氧簇(ROS)是细胞内有氧代谢产生的一组化学性质活泼的含氧功能集团的化合物，是内源性的氧化剂。ROS大量堆积可造成心肌细胞的凋亡和功能失调；增强的氧化应激反应可以促成心肌重构和 心力衰竭的发病(Xilin Long, Michael J Goldenthal, Jose Marin-Garcia. Oxidativestress enhances phosphorylation of p53 in neonatal rat cardiomyocytes.Mol CellBiochem，2007，303(1-2) :167-174 ;Yo Koyama，Yasuchika TakeishiiHiroki Takahashi,etal.Azelnidipine inhibits H202_induced cell death in neonatal rat cardiomyocytes.Cardiovasc Drugs Ther，2007，21 (I):69-72)。现已证实，心肌细胞在各种剌激因子的诱导下存在凋亡现象，缓解心肌细胞凋亡是减轻心肌缺血性损伤、保护心脏功能的重要途径。Bcl-2家族蛋白在细胞凋亡过程中起主要调节作用，包括抑凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-xL、Bcl-w、Mcl-1、Al/Bf 11、Boo和Ced-9等；促凋亡蛋白Bax、Bakλ Bok/Mtd、Bcl-xS、Bad、Bid、Bim、Bik 和 Egl-I 等。细胞发生凋亡时，Bax、Bak可以构成跨线粒体外膜的孔，并导致膜电位的降低，使线粒体膜间隙的细胞色素C(Cytochrome C)通过电压依赖性阴离子通道(VDAC)外流。细胞色素C与Apaf-I和ATP及pro-caspase-9形成凋亡体复合物，并导致caspase-9的激活。在caspase-9被激活后，再作用于其下游的caspase-3酶原，活化caspase-3，最终诱导凋亡的发生。抑凋亡分子Bcl-2及Bcl-XL可以稳定线粒体膜电位，阻止线粒体上孔道的形成。热休克蛋白(heat shock proteins, hsp)是细胞在应激情况下启动热休克基因而产生的一种结构高度保守的蛋白质，其中hsp27可以与Cytochrome C结合而阻止其与Apaf-I 的结合(Garrido C，Bruey JM, Fromentin A，et al. HSP27 inhibits cytochromec-dependent activation of procaspase-9.FASEB J，1999，13:2061-70;Bruey JM,Ducasse C，Bonniaud P，et al. Hsp27 negatively regulates cell death by interactingwith cytochrome C. Nat Cell Biol, 2000, 2 (9) :645-52) ;hsp_90 可以与 Apaf-I 结合而阻止其与 Cytochrome C 的结合(Pandey P，Saleh A，Nakazawa A，et al. Negativeregulation of cytochrome c—mediated oligomerization of Apaf-Iand activationof procaspase-9 by heat shock protein 90. EMBO J，2000，19(16) :4310-22) ;hsp70可阻止寡聚化的 Apaf-1 与 pro-caspase-9 的募集结合(Beere HM, Wolf BB, Cain K，et al. Heat-shock protein 70 inhibits apoptosis by preventing recruitment ofprocaspase-9 to the Apaf-lapoptosome. Nat Cell Biol，2000，2(8):469-75;Saleh A，Srinivasula SM，Balkir L，et al. Negative regulation of the Apaf-lapoptosome byHsp70. Nat Cell Biol, 2000, 2 (8) :476-83)，还可以通过如下机制对心肌细胞发挥保护作用(Latchman D S. Heat shock proteins and cardiac protection. Cardiovasc Res,2001,51(4) :637-646) (1)提高心肌细胞蛋白质的正确折叠或聚集能力，保持新合成蛋白分子的恰当构型，防止在正确的多聚体形成前新合成蛋白质的错误折叠或聚集。(2)促使受损心肌细胞、变性蛋白质的恢复或加速其降解和消除，能重新激活某些酶的作用，以维护细胞的功能和生存。(3)抑制心肌细胞凋亡。(4)保护心肌细胞肌动蛋白和细胞骨架。(5)增加心肌细胞一氧化氮合成。(6)允许心肌细胞新合成蛋白分子穿过细胞膜，陪伴蛋白分子在细胞内跨膜转运。中药是中华民族的瑰宝，比如，黄芪总皂苷提取物和当归挥发油对心肌细胞损伤有一定的保护作用。其中，黄芪总皂苷是黄芪的主要活性成分之一，包括黄芪皂苷I 珊，乙酰基黄芪皂苷，异黄芪皂苷I、II、IV等。黄芪总皂苷具有抑制异丙肾上腺素引起的心肌细胞钙超载，减少心肌细胞肌衆网的I丐负荷，改善线粒体氧化磷酸化的功能，(Meng D, Chen XJ, Bian YY, et al. Effect of astragalosides on intracellular calcium overload in culturedcardiac myocytes of neonatal rats. Am J Chin Med, 2005, 33 (I) : 11-20);亦具有改善心肌的能量代谢、抑制脂质过氧化的作用(冯琳等，黄芪总皂苷对异丙肾上腺素致大鼠心肌损伤的保护作用，中国药学杂志，2006，41 (17):1313-16)，来保护异丙肾上腺素导致的心肌细胞损伤，抑制心肌细胞凋亡。当归根油中性部分(当归挥发油包括酚性油-香荆芥酚，苯酚等，中性油-藁本内酯，a-菔烯等，酸性油-樟脑酸，茴香酸等)对于垂体后叶素引起的家兔实验型心肌缺血有明显的保护作用，能显著降低T波抬高值及ST段位移位值(杨庆利等，当归挥发油的药理作用研究，兰州医学院学报，1986，(3) :20-26)，抑制心肌缺血所致的心肌细胞凋亡。但是，含黄芪总皂苷或当归挥发油的药物抑制心肌细胞凋亡的效果尚不够理想。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种抑制心肌细胞凋亡的药物，该药物可显著提高抑制心肌细胞凋亡的效果。本发明解决上述问题的技术方案如下所述一种抑制心肌细胞凋亡的药物，该药物由有效成分和药学上可以接受的辅料组成，其特征在于所述的有效成分由以下组分组成黄芪总皂苷提取物91-226重量份，当归挥发油3-15重量份；其中，所述的黄芪总皂苷提取物由黄芪根经水提、大孔吸附树脂和乙醇结晶得到。上述技术方案中所述的黄芪总皂苷提取物可购于市售的产品，如，上海的阿拉丁试剂有限公司，也可以自行制备。如果自行制备，本发明人推荐按公开号为CN1425674A发明专利申请所述方案进行，其具体过程如下所述将黄芪根粉碎，在常压回流提取装置中，用水热回流提取两次以上；合并各部分的水提液，过滤，清液直接加入大孔吸附树脂柱上，以10倍以上体积的去离子蒸馏水洗脱糖类部分，再以5倍以上体积的0. 05-0. 5%的氢氧化钾、氢氧化钠或氢氧化钙水溶液进行洗脱，继以70-90%的乙醇洗脱黄芪皂苷，将洗脱液浓缩、离心，收集得到沉淀A部分，为高纯度的黄芪甲苷；向母液中加入乙醇至乙醇浓度为70-90%，离心，分得上清液，浓缩干燥后得到B部分；A部分和B部分混合即得。上述技术方案中所述的当归挥发油可采用常规的提取方法，即在普通的挥发油提取器中水蒸馏提取得到，也可直接购买市售的产品，如，南京文森宝国际贸易有限公司生产的当归油，北京正生生物科技有限公司生产的当归挥发油，美国Sigma公司生产的Angelica root oil (当归根油)。本发明所述的抑制心肌细胞凋亡药物可以制成本领域常用的剂型，如胶囊、片剂、颗粒剂、滴丸等。本发明所述药物中的黄芪总皂苷提取物与当归挥发油具有显著的协同增效作用，其上调抑凋亡蛋白Bcl-2、Hsp_70的表达和抑制促凋亡蛋白Bax及细胞凋亡蛋白Caspase-3 的表达的能力都强于单一的黄芪总皂苷和单一的当归挥发油，具有抑制脂质过氧化或心肌缺血所致的心肌细胞凋亡效果显著的优点。以下通过药效试验来验证本发明所述药物所能达到的抑制心肌细胞凋亡的效果。下述实验一、二、三中各实验组的所用药物及预处理情况如下I、正常对照组，不作处理。2、模型组150umol/LH202。3、黄芪总皂苷组取黄芪总皂苷提取物的制备例中例I的黄芪总皂苷提取物24mg，溶于Iml DMSO中，配成24mg/ml母液，实验使用时用无血清培养基稀释，使加药终浓度为 114. 4mg/l。4、当归挥发油组取美国Sigma公司生产的Angelica root oil IOOmg,溶于ImlDMSO中，配成100mg/ml母液，实验使用时用无血清培养基稀释，使加药终浓度为9mg/l。5、实验组I :取药物制剂制备例中例I片剂捣碎，加入Iml DMSO溶解，配成含黄芪总皂苷提取物91. 5mg/ml、当归挥发油3mg/ml的母液，使用时以无血清培养基稀释1000倍，使加药终浓度为黄芪总皂苷提取物91. 5mg/l、当归挥发油3mg/l。6、实验组2 :取药物制剂制备例中例2的滴丸以Iml DMSO溶解，配成含黄芪总皂苷提取物115mg/ml、当归挥发油9mg/ml的母液，使用时以无血清培养基稀释1000倍，使加药终浓度为黄芪总皂苷提取物115mg/l、当归挥发油9mg/l。7、实验组3 :取药物制剂制备例中例3的胶囊剂，取出内容物，溶于ImlDMSO溶液中，配成含黄芪总皂苷提取物225. 2mg/ml、当归挥发油15mg/ml的母液，使用时以无血清培养基稀释1000倍，使加药终浓度为黄芪总皂苷提取物225. 2mg/l、当归挥发油15mg/l。实验一(心肌细胞凋亡率对比实验)试验方法取20只l-3d SPF级大鼠，雌雄不论。在无菌条件下开胸取心脏，眼科剪剪成Imm3的组织块，用复合酶消化液(0. 125%胰酶+0. 1% I型胶原酶)(GIBC0)37°C作用于心肌组织块8min进行消化，消化后上清用200目筛网过滤，然后加等量完全培养基(10%FBS+1%青链霉素)终止消化，如此重复8-10次，将得到的混合液离心，取得心肌细胞，用完全培养基悬浮心肌细胞沉淀后，种于培养瓶(corning)内，C02培养箱(BB16UV/BB5060UV，Heraeus)培养90min,然后将含有心肌细胞的培养液种于96孔板(corning)内，于培养48h后换液,72h后换无血清培养基，同步24h后加药处理。实验分为7组对照组、模型组、黄芪总皂苷组、当归挥发油组、实验组I、实验组2、实验组3，每组5个复孔。黄芪总皂苷组、当归挥发油组、实验组I、实验组2和实验组3分别加入对应的药物处理30min后与模型组一起加150 μ mol/LH202作用20h，对照组不作处理。然后在酶标仪(RT-2100C)上做MTT检测，490nm处测定OD值。上述7个实验组所测定的MTT OD值见下表I。表I本发明药物对H202损伤心肌细胞存活率的作用(f ，n=5)
权利要求
1.一种抑制心肌细胞凋亡的药物，该中药制剂由有效成分和药学上可以接受的辅料组成，其特征在于所述的有效成分由以下组分组成黄芪总皂苷提取物91-226重量份，当归挥发油3-15重量份；其中，所述的黄芪总皂苷提取物由以下方法制备得到 将黄芪根粉碎，在常压回流提取装置中，用水热回流提取两次以上；合并各部分的水提液，过滤，清液直接加入大孔吸附树脂柱上，以10倍以上体积的去离子蒸馏水洗脱糖类部分，再以5倍以上体积的0. 05-0. 5%的氢氧化钾、氢氧化钠或氢氧化钙水溶液进行洗脱,继以70-90%的乙醇洗脱黄芪皂苷，将洗脱液浓缩、离心，收集得到沉淀A部分，为高纯度的黄芪甲苷；向母液中加入乙醇至乙醇浓度为70-90%，离心，分得上清液，浓缩干燥后得到B部分；A部分和B部分混合即可。
2.根据权利要求I所述的一种抑制心肌细胞凋亡的药物，其特征在于，所述的药物为片剂、胶囊剂、软胶囊、颗粒剂或滴丸。
3.根据权利要求2所述的一种抑制心肌细胞凋亡的药物，其特征在于，所述的药物为片剂，该片剂每1000片有效成分由黄芪总皂苷提取物91. 5g和当归挥发油3g组成。
4.根据权利要求2所述的一种抑制心肌细胞凋亡的药物，其特征在于，所述的药物为滴丸，该滴丸每1000粒有效成分由黄芪总皂苷提取物115g和当归挥发油9g组成。
5.根据权利要求2所述的一种抑制心肌细胞凋亡的药物，其特征在于，所述的药物为胶囊剂，该胶囊剂每1000颗有效成分由黄芪总皂苷提取物225. 2g和当归挥发油15g组成。
全文摘要
本发明涉及一种抑制心肌细胞凋亡的药物，该药物由有效成分和药学上可以接受的辅料组成，其特征在于所述的有效成分由以下组分组成黄芪总皂苷提取物91-226重量份，当归挥发油3-15重量份；其中，所述的黄芪总皂苷提取物由黄芪根经水提、大孔吸附树脂和乙醇结晶得到。本发明所述的药物上调抑凋亡蛋白Bcl-2、Hsp-70的表达和抑制促凋亡蛋白Bax及细胞凋亡蛋白Caspase-3的表达的能力都强于单一的黄芪总皂苷和单一的当归挥发油，具有抑制脂质过氧化或心肌缺血所致的心肌细胞凋亡效果显著的优点。
文档编号A61K36/481GK102764292SQ20121027174
公开日2012年11月7日 申请日期2012年7月31日 优先权日2012年7月31日
发明者职玉娟, 黄水清 申请人:广州中医药大学