嵌合抗原受体iRGD-scFv(G250)-CD8-CD28-CD137-CD3ζ及其用途的制作方法

专利名称：嵌合抗原受体iRGD-scFv(G250)-CD8-CD28-CD137-CD3ζ及其用途的制作方法
技术领域：
本发 明属于生物与新医药技术领域。具体是一种嵌合抗原受体iRGD-scFv(G250)-⑶8-⑶28-⑶137-⑶3 ζ的制备。其制备涉及利用分子生物学技术，将编码肿瘤穿透肽iRGD、抗人肾癌G250抗原的单链抗体、⑶8的跨膜区和胞内区及⑶28、⑶137、⑶3 ζ的胞内信号结构域的核苷酸序列依次连接起来，得到编码嵌合抗原受体iRGD-scFv (G250) -CD8-CD28-⑶137-⑶3 ζ的融合基因片段，并在其5’末端插入信号肽Ig kappa的编码序列。然后将该基因片段插入慢病毒表达载体，包装成慢病毒。利用该慢病毒感染人T淋巴细胞，使细胞表达该嵌合抗原受体。这种T淋巴细胞能够识别肾癌细胞表面抗原G250，用于肾癌治疗。
背景技术：
嵌合抗原受体(chimericantigen receptor, CAR)是模拟 T 细胞受体(T cellreceptor, TCR)功能的人工受体，由抗原识别结构域(单链抗体)和T淋巴细胞的一系列信号结构域(来源于⑶8、⑶28、⑶137、⑶3 ζ和FcR Y等分子)依次连接而成。根据胞内信号结构含有结构域的不同，CAR被划分为三代。第一代CAR仅含有一个胞内信号结构域(⑶3 ζ或FcR Y )0为增强CAR修饰T淋巴细胞在体内的增殖和存活能力，一些共刺激分子(如⑶28和⑶137)的胞内信号结构域被加入到第一代CAR中，形成第二代CAR (含有一个共刺激分子)和第三代CAR (含有两个共刺激分子)。CAR修饰的T淋巴细胞能够通过其抗原识别结构域(单链抗体)识别肿瘤细胞表面抗原，然后通过胞内信号结构域将识别信号传递至胞内，激活T淋巴细胞的杀伤活性，杀死肿瘤细胞。CAR修饰的T淋巴细胞治疗肿瘤，是一种利用人体自身淋巴细胞进行的免疫治疗手段，相对于目前临床使用的放、化疗来讲，具有毒副作用较弱的特点。由于CAR修饰的T淋巴细胞通过其CAR的抗原识别结构域识别肿瘤细胞，然后启动杀伤作用，因此具有靶向性的特点。由于CAR修饰的T淋巴细胞通过CAR的抗原识别结构域直接识别肿瘤细胞表面抗原，并通过来源于⑶8、⑶28、⑶137和⑶3 ξ的信号结构域直接将识别信号传递至胞内，激活T淋巴细胞的杀伤活性，因此可以绕开常规细胞免疫的主要组织相容性复合体(majorhistocompatibility complex, MHC)的限制性。嵌合抗原受体修饰的T淋巴细胞治疗恶性血液病已经取得较好效果，但对实体瘤治疗效果有限。主要原因是嵌合抗原受体修饰的T淋巴细胞穿透实体瘤的能力有限，所以增强其肿瘤穿透能力是增强CAR修饰T淋巴细胞对实体瘤治疗效果的重要途径。iRGD肽是一种具有肿瘤通透作用的短肽，其原理是iRGD中的RGD三肽与肿瘤血管内皮细胞表面高表达的αν整合素(av integrins)结合,将药物导向肿瘤部位；在细胞表面蛋白酶的作用下，氨基酸K和G之间的肽键被水解断开,暴露出C末端规则(C end rule, CendR)基序(CRGDK)5CendR基序与肿瘤细胞表面的neuropilin-1结合，使肿瘤组织通透性增加，便于T淋巴细胞进入肿瘤组织内部。G250是一种表达于肾癌细胞表面的肾癌特异性抗原，抗G250单克隆抗体(G250-McAb)能与所有的肾透明细胞癌(占肾癌的90%)及65%的非透明肾细胞癌结合，但不与正常肾细胞发生反应。利用131I标记G250-McAb定位肾转移癌，90%以上的转移癌，包括肝、肺、骨及淋巴结转移均被发现，有些仅8mm没被CT及MRI发现的微小肿瘤亦被显示。G250-McAb与肾癌细胞结合的高特异性、高灵敏性，使其可应用于肾癌的靶向治疗。将G250-McAb与GFP表达载体偶联可使报告基因GFP转染率大幅升高。因此，可以利用G250单链抗体(scFv)作为抗原识别结构域识别肾癌细胞表面抗原。目前临床上使用的CAR，其scFv大多来自于鼠源抗体，其修饰的T淋巴细胞在体内会引起人抗鼠scFv的免疫反应。此免疫反应会降低CAR修饰的T淋巴细胞在体内的增殖和存活能力，进而降低其治疗效果。

发明内容
为解决上述问题，本发明提供一种嵌合抗原受体RGD-scFv(G250)-CD8-CD28-CD137-CD3(及其用途，本发明采用人源化抗人肾癌抗原G250scFv可以有效降低这种免疫反应，延长CAR修饰T细胞在体内的存活时间，提升治疗效果。本发明的技术方案如下一种嵌合抗原受体RGD-scFv (G250) -CD8-CD28-CD137-CD3 ζ，其特征在于，提供的嵌合抗原受体 iRGD-scFv(G250)-CD8-CD28-CD137-CD3 ζ是一种融合蛋白，由肿瘤穿透肽iRGD、人源化抗人肾癌抗原G250单链抗体、⑶8的跨膜区和胞内区及⑶28、⑶137和⑶3 ζ的胞内信号结构域依次串联构成。其氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO. I所示，其编码基因序列如序列表中SEQ ID NO. 2所示。利用该嵌合抗原受体修饰的T淋巴细胞，能够通过识别人肾癌细胞表面的G250抗原，杀死肾癌细胞。本发明通过基因合成技术合成由编码⑶8的跨膜区和胞内区及⑶28、⑶137和⑶3ζ胞内信号结构域的核苷酸序列构成的融合基因片段⑶8-⑶28-⑶137-⑶3 ζ。通过巢式PCR在抗人肾癌G250抗原的单链抗体编码基因[ScFv(G250)]的5’端依次加上Ig kappa信号肽和肿瘤穿透肽iRGD的编码序列，得到融合基因序列Igkappa-iRGD-SCFv(G250)。然后通过重叠延伸PCR技术将融合基因片段Igkappa-iRGD-SCFv(G250)和CD8-CD28-CD137-CD3 ζ 拼接成编码嵌合抗原受体 iRGD-scFv (G250)-CD8-CD28-CD137-CD3ζ 的融合基因片段，命名为 Igkappa-iRGD-scFv(G250)-CD8-CD28-CD137-CD3 ζ。然后将该融合基因片段插入慢病毒表达载体中，包装成携带Igkappa-iRGD-scFv (G250) -CD8-CD28-CD137-⑶3ζ编码基因的慢病毒。利用该慢病毒感染T淋巴细胞，使T淋巴细胞表达该嵌合抗原受体。通过体外的Cr51释放分析实验证明该嵌合抗原受体修饰的T淋巴细胞对肾癌细胞具有杀伤作用。因此本发明所述的嵌合抗原受体iRGD-scFv (G250)-⑶8-⑶28-⑶137-⑶3 ζ可在肾癌的治疗中应用。


图I是本发明所述的在scFv(G250)的5’端依次加上Ig kappa信号肽和肿瘤穿透肽iRGD编码序列的4次巢式PCR扩增电泳图，图中，I泳道DNA分子量标记(IKb Marker I)；2泳道用PPl和P5进行第一次巢式PCR的扩增产物；3泳道用引物P2和P5进行第二次巢式PCR的扩增产物；4泳道用引物P3和P5进行第三次巢式PCR的扩增产物；5泳道用引物P4和P5进行第四次巢式PCR扩增得到的融合基因片段Igkappa-iRGD-SCFv(G250)；图2是本发明所述编码嵌合抗原受体Igkappa-iRGD-scFv(G250)-CD8-CD28_CDl37-⑶3 ζ 的融合基因全长序列扩增电泳图，图中，I泳道DNA分子量标记(IKb Markerl)；2 泳道编码 Igkappa-iRGD-scFv(G250)的序列；3 泳道编码 CD8-CD28-CD137-CD3 ζ 的序列；4 泳道编码嵌合抗原受体 Igkappa-iRGD-scFv(G250)-CD8-CD28-CD137-CD3 ζ 的融合基因序列。图3是本发明所述的慢病毒表达质粒(pLVX-Igkappa-iRGD-scFv(G250)-CD8-CD28-CD137-CD3 ζ )的示意图，其中，逆时针序列为正向基因片段，顺时针为反向基因片段。图4 是本发明所述慢病毒表达质粒 pLVX-Igkappa-iRGD-scFv(G250)-CD8-CD28-⑶137-⑶3 ζ的限制性内切酶酶切片段电泳鉴定图，其中，I泳道DNA分子量标记(1Kb、Markerl) ；2 泳道慢病毒表达质粒 pLVX-Igkappa-iRGD-scFv (G250)-CD8-CD28-CD137-CD3ζ ；3泳道用限制性内切酶EcoR I和Xba I双酶切慢病毒表达质粒pLVX-Igkappa-iRGD-scFv(G250)-CD8-CD28-CD137-CD3 ζ 后所得到的编码 Igkappa-iRGD-scFv (G250)-CD8-CD28-CD137-CD3 4 的 DNA 片段(1630bp)和载体片段(8192bp)；图5是本发明所述的嵌合抗原受体iRGD-scFv(G250)-CD8-CD28-CD137-CD3 ζ修饰的T淋巴细胞明视野图。图6是绿色荧光视野下观察嵌合抗原受体iRGD-scFv (G250)-CD8-CD28-CD137-CD3ζ在T淋巴细胞中的表达效率图。图7是Western blot检测人肾癌细胞Ketr-3和人胚肾细胞HEK293中G250的表达量。图8是本发明所述的嵌合抗原受体iRGD-scFv(G250)-CD8-CD28-CD137-CD3 ζ修饰的T淋巴细胞对人肾癌细胞Ketr-3杀伤作用的Cr51释放分析图，其中， CAR-Tcells :嵌合抗原受体iRGD-scFv (G250)-CD8-CD28-CD137-CD3 ζ修饰的T淋巴细胞实验组；音T cells :不加修饰的T淋巴细胞实验组。图9是本发明所述的嵌合抗原受体iRGD-scFv(G250)-CD8-CD28-CD137-CD3 ζ修饰的T淋巴细胞对人胚肾细胞ΗΕΚ293杀伤作用的Cr51释放分析图，其中，+ CAR-Tcells :嵌合抗原受体iRGD-scFv (G250)-CD8-CD28-CD137-CD3 ζ修饰的T淋巴细胞实验组；
T cells :不加修饰的T淋巴细胞实验组。
具体实施例方式实施例I :荷载嵌合抗原受体iRGD-scFv (G250)-CD8-CD28-CD137-CD3 ζ的慢病毒表达载体的构建。(一)融合基因片段Igkappa-iRGD-scFv (G250)的制备Pl :5 -TGCCGCGGCGACAAGGGCCCCGACTGCGACATTGTGATGACCCAiRGDscFv(G250)GTCTCA-3，P2:5’ -GCCAGCGTGATCATGAGCCGCGGCTGCCGCGGCGACAAGGGCCIg kappa 信号肽iRGDCCGACT-3，P3:5 ’ -TGCAGATCTTCAGCTTCCTGCTGATCAGCGCCAGCGTGATCATGAIgkappa 信号肽 迎-3， P4:5，-ATATCTCGAGCCACCATGGACTTCCAGGTGCAGATCTTCAGCTTCEcoR IIg kappa 信号妝CTGC-3，P5:5，-TGGTCGCGGCGCTGGCGTCGTGGTTGAGGAGACGGTGACTGAGCD8hingescFv (G250)GTTCCT-3，P6:5 ’ -AGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCAACCACGACGCCAGCGCCGCscFv (G250)CD8hingeGACCA-3，P7:5，-AATT TCTAGATCAGCGAGGGGGCAGGGCCTGCATGTG-3，Xba I0)3ζ以上引物由华大基因科技有限公司合成。以携带人源化抗人肾癌抗原G250scFv编码基因的质粒pcDNA3. 1-scFv (G250)(人G250scFv的DNA编码序列如序列表中的SEQ ID NO. 4所示)为模板，用引物Pl和P5进行第一次PCR扩增，得到长774bp的DNA片段，Pl序列中引入肿瘤穿透肽iRGD的编码序列。PCR反应条件参照Primer star DNA聚合酶(购自Takara公司)的说明书，反应体系(50ul)如下双蒸水31.5ul5 X 反应 buffer : IOuldNTP Mix 4ulPl (IOmM) : IulP5 (IOmM) : IulpcDNA3. 1-scFv (G250) (lOOng/ul) 2ulPrimer star DNA 聚合酶0. 5ul将上述第一次PCR的产物跑I. 5%琼脂糖凝胶进行分离，用琼脂糖凝胶DNA片段回收试剂盒(天根生化科技有限公司)进行DNA片段回收，具体方法见说明书。分别用P2/P5、P3/P5和P4/P5三对引物，以前一次PCR产物为模板重复上述PCR操作，最终得到长度为855bp的DNA片段，该DNA片段依次包含编码Ig kappa信号肽、肿瘤穿透肽iRGD和人源化抗人肾癌抗原G250 scFv的基因序列，并在氨基末端加上了 EcoR I的酶切位点。将该DNA片段命名为Igkappa-iRGD-scFv(G250)(见图I)。(二)融合基因片段 Igkappa-iRGD-scFv (G250)-CD8-CD28-CD137-CD3 ζ 制备以含有⑶8的跨膜区和胞内区及⑶28、⑶137和⑶3 ζ胞内信号结构域编码序列的质粒 PUC57-CD8-CD28-CD137-CD3 ζ (CD8-CD28-CD137-CD3 ζ 的 DNA 编码序列如序列表SEQ ID NO. 7所示)为模板，以引物Ρ6和Ρ7进行PCR扩增，得到长824bp的DNA片段，P7引Λ Xba I的酶切位点。PCR反应条件参照Primer star DNA聚合酶(购自Takara公司)的说明书，反应体系(50ul)如下双蒸水31.5ul5 X 反应 buffer : IOuldNTP Mix 4ulP6 (IOmM) : IulP7 (IOmM) : IulpUC57-CD8-CD28-CD137-CD3 ζ (lOOng/ul) 2ulPrimer star DNA 聚合酶0. 5ul将上述PCR产物跑1%琼脂糖凝胶进行分离，琼脂糖凝胶DNA片段回收试剂盒(天根生化科技有限公司)回收DNA片段。得到编码⑶8的跨膜区和胞内区及⑶28、⑶137和⑶3 ζ胞内信号结构域的DNA片段，命名为⑶8-⑶28-⑶137-⑶3 ζ。以回收得到的Igkappa-iRGD-scFv (G250)和 CD8-CD28-CD137-CD3 ζ DNA 片段为模板，用引物Ρ4和Ρ7进行重叠延伸PCR扩增得到长度1630bp，含有Igkappa信号肽、肿瘤穿透肽iRGD、人源化抗人肾癌抗原G250单链抗体、⑶8的跨膜区和胞内区及⑶28、⑶137和CD3 ζ 胞内信号结构域的 DNA 片段，命名为 Igkappa-iRGD-scFv(G250)-CD8-CD28-CD137-CD3 ζ (见图2)。PCR反应条件参照Primer star DNA聚合酶(Takara公司)的说明书，反应体系(50ul)如下双蒸水31.5ul5 X 反应 buffer : IOuldNTP Mix 4ulP4 (IOmM) lulP7 (IOmM) lulIgkappa-iRGD-scFv(G250)DNA 片段(lOOng/ul) lulCD8-CD28-CD137-CD3 ζ DNA 片段(lOOng/ul) lulPrimer star DNA 聚合酶0. 5ul(三)将融合基因片段Igkappa-iRGD-scFv (G250)-CD8-CD28-CD137-CD3 ζ 插入慢病毒表达载体pLVX-IRES-ZsGreen将融合基因片段Igkappa-iRGD-scFv(G250)-CD8-CD28-CD137-CD3 ζ 和慢病毒表达载体pLVX-IRES-ZsGreen(购自Clontech公司)用限制性内切酶EcoR I和Xba I双酶切，具体方法见说明书。酶切产物经琼脂糖凝胶电泳分离后用琼脂糖凝胶DNA片段回收试剂盒进行DNA片段回收。将回收的融合基因片段和载体片段通过T4连接酶(购自Fermentas公司)进行连接。将连接产物转化E. coli DH5a，37°C培养后挑取单克隆，37°C培养12h后用质粒提取试剂盒(天根生化科技有限公司)提取质粒，具体方法见说明书。提取的质粒经限制性内切酶EcoR I和Xba I双酶切鉴定(见图4)。将鉴定正确的质粒送华大基因科技有限公司对插入的融合基因片段进行测序，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO. 2所示。将测序结果正确的重组质粒命名为pLVX-iRGD-scFv(G250)-CD8-CD28-CD137-CD3 ζ (见图3)。实施例2 :嵌合抗原受体 iRGD-scFv (G250) -CD8-CD28-CD137-CD3 ζ 修饰的 T 淋巴细胞的制备
(一)慢病毒的包装制备用QIAGEN公司的质粒提取试剂盒(Catalog no. 12662)分别提取慢病毒表达质粒pLVX-iRGD-scFv(G250)-CD8-CD28-CD137-CD3 ζ 和辅助质粒 psPAX2、pMD2. G。三种质粒以4:3:1的比例用lipo2000转染试剂(购自Invitrogen公司)进行转染,具体方法见lipo2000转染试剂说明书。转染48小时后，将含有病毒的细胞培养上清吸入EP管中，4°C 2000g离心lOmin，转移上清至新EP管中，4. 5 μ m滤器过滤后_80°C保存。(二)T淋巴细胞的制备取IOml健康人的新鲜血液，用淋巴细胞分离液(购自Mediatech公司)分离外周血单核细胞。用含有300IU/ml的IL-2、50ng/ml的0KT-3和5%人AB血清(购自Invitrogen
公司)的AM-V培养基(购自Invitrogen公司)诱导培养48h，得到T淋巴细胞。(三)慢病毒感染T淋巴细胞及感染后T淋巴细胞的扩增培养从-80°C取出2ml病毒液，加入终浓度为8 μ g/ml的聚凝胺(购自Sigma公司)，用该病毒液重悬I X IO6个上述诱导培养的T淋巴细胞。将细胞悬液加入24孔板的I个孔中，1000g，32°C，离心Ih0 371，5%0)2培养箱内培养811后，100(^，321，再次离心Ih0吸弃I. 4ml培养上清，加入I. 4ml新鲜的含有300IU/ml的IL_2、50ng/ml的0KT-3和5%人AB血清的AIM-V培养基，继续培养。每2-3天检测一次细胞浓度，当细胞浓度达到2 X IO6个/ml时，IOOOg, 320C，离心lh。吸取Iml细胞悬液，加入另一个孔中，分别向两个孔中加入Iml新鲜的含有300IU/ml的IL-2和5%人AB血清的AIM-V培养基，继续扩大培养。如此反复，直至细胞扩增至足够的用量。(四)免疫荧光观察嵌合抗原受体iRGD-scFv (G250)-CD8-CD28-CD137-CD3 ζ 在 T淋巴细胞内的表达效率取IX IO6个上述慢病毒感染并扩增的T淋巴细胞，重悬于80 μ I PBS中，加入20 μ IFITC 标记的山羊抗人 IgG，F (ab，)2 抗体(构自 eBioscience)，4°C 孵育 30min，PBS 洗涤细胞两次，取100 μ I PBS重悬细胞，取细胞悬液制作细胞涂片，用荧光显微镜观察嵌合抗原受体iRGD-scFv (G250)-CD8-CD28-CD137-CD3 ζ在T淋巴细胞中的表达效率(见图5、图6)。实施例三嵌合抗原受体iRGD-scFv (G250) -CD8-CD28-CD137-CD3 ζ修饰的T淋巴细胞的抗肿瘤作用(一)Western Blot检测人肾癌细胞Ketr_3和人胚肾293细胞G250抗原表达量取对数生长期的人肾癌Ketr-3细胞和人胚肾293细胞(HEK293)，PBS洗细胞3次，用细胞刮刀刮下细胞，4°C，3000rpm离心5min收集细胞沉淀，加入300ullysis buffer(20mM Tris-HCl，ΡΗ7· 9，150mM NaCl,IOmM KCl，0. 5mMEDTA，0. 5%NP_40，10%Glycerol, I. 5mM MgCl2,0. 5mM PMSF, 2mM DTT，2. 5mM CaCl2)，冰上裂解 lOmin，涡旋振荡，2min/次，共5次，17000g4°C离心5min，吸取上清。取适量上清液，用鼠抗人G250的单克隆抗体进行Western blot检测，以Actin为内参。结果显示G250抗原在Ketr-3细胞内高表达，在HEK293细胞内不表达(见图7)。(二)Cr51释放分析检测嵌合抗原受体修饰的T细胞对肾癌细胞的特异杀伤活性分别收集I X IO6个肾癌细胞Ketr-3 (高表达G250抗原)和人胚肾293细胞，重悬于0. 5ml RPMI 1640培养基中(含有5%人AB血清)，加入3. 7mBq的Na2Cr51O4, 37°C水浴中标记lh，PBS洗涤细胞三次，用上述培养基重悬细胞，调整细胞浓度至5X IO4个/ml。向96孔板中加入标记后的Ketr-3细胞和HEK293细胞，每孔100 μ I。然后按不同效靶比(I: I、3: I、10: I、30:1)加入嵌合抗原受体修饰的T淋巴细胞，37°C共孵育4h。每种细胞设置3个阴性对照孔(自发释放，只加100 μ I完全培养基)和3个阳性对照孔[最大释放，加100 μ I1%ΝΡ-40(ν/ν)]。培养4h后，IOOOg离心培养板lOmin，每孔吸取100 μ I上清在伽马计数仪上测定每分钟放射活性(cpm值)。细胞杀伤活性按以下公式计算细胞杀伤活性(％)=[(实验组cpm-自发释放组cpm) / (最大释放组cpm-自发释放组cpm) ] X 100%。结果显示嵌合抗原受体修饰的T细胞对人肾癌Ketr-3细胞有显著的杀伤活性(见图8)，对HEK 293细胞无明显杀伤活性(见图9)。
序列表〈110〉徐州医学院<120> 嵌合抗原受体 iRGD-scFv (G250) -CD8-CD28-CD137-CD3 ζ 及其应用<160>7<170>PatentIn Version 3. 2<210>1<211>512<212>PRT〈213〉人工序列〈223〉嵌合抗原受体 iRGD-scFv (G250) -CD8-CD28-CD137-CD3 ζ〈400〉ICys Arg Asy Asp Lys Gly Pro Asp Cys Asp He Val Met Thr Gln Ser Gln Arg51015Phe Met Ser Thr Thr Val Gly Asp Arg Val Ser He Thr Cys Lys Ala Ser Gln20253035Asn Val Val Ser Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys404550Leu Leu He Tyr Ser Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr55606570Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr He Ser Asn Met Gln Ser Glu75808590Asp Leu Ala Asp Phe Phe Cys Gln Gln Tyr Ser Asn Tyr Pro Trp Thr Phe Gly95100105Gly Gly Thr Lys Leu Glu He Lys Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly110115120125Ser Gly Glu Gly Ser Asp Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys130135140Leu Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn145150155160
Tyr Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Leu Val Ala165170 175180Ala He Asn Ser Asp Gly Gly He Thr Tyr Tyr Leu Asp Thr Val Lys Gly Arg185190 195Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Ser Ser200205 210 215Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Leu Phe Tyr Cys Ala Arg His Arg Ser Gly Tyr220225 230Phe Ser Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Thr Thr235240 245 250Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr He Ala Ser Gln Pro Leu255260 265270Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg275280 285Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp He Tyr lie Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys290295 300 305 Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val lie Thr Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu310315 320His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His325330 335 340Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Lys Arg Gly345350 355360Arg Lys Lys Leu Leu Tyr He Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr365370 375Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly380385 390 395Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln400405 410Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp415420 425 430Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Gln Arg435440 445450Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala455460 465Glu Ala Tyr Ser Glu He Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His
470475480485Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu490495500His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg505510<210>2 <211>1536<212>DNA〈213〉人工序列〈220〉<221>misc_feature〈222〉(I)......(1536)〈223〉嵌合抗原受体 iRGD-scFv (G250) -CD8-CD28-CD137-CD3 ζ 的融合基因〈400〉2TGCCGCGGCG ACAAGGGCCC CGACTGCGAC ATTGTGATGA CCCAGTCTCA AAGATTCATG60TCCACAACAG TAGGAGACAG GGTCAGCATC ACCTGCAAGG CCAGTCAGAA TGTGGTTTCT120GCTGTTGCCT GGTATCAACA GAAACCAGGA CAATCTCCTA AACTACTGAT TTACTCAGCA180TCCAATCGGT ACACTGGAGT CCCTGATCGC TTCACAGGCA GTGGATCTGG GACAGATTTC240ACTCTCACCA TTAGCMTAT GCAGTCTGAA GACCTGGCTG ATTTTTTCTG TCAACAATAT300AGCAACTATC CGTGGACGTT CGGTGGAGGC ACCAAGCTGG AAATCAAAGG CAGCACCAGC360GGCAGCGGCA AGCCCGGCAG CGGCGAGGGC AGCGACGTGA AGCTCGTGGA GTCTGGGGGA420GGCTTAGTGA AGCTTGGAGG GTCCCTGAAA CTCTCCTGTG CAGCCTCTGG ATTCACTTTC480AGTAACTATT ACATGTCTTG GGTTCGCCAG ACTCCAGAGA AGAGGCTGGA GTTGGTCGCA540GCCATTMTA GTGATGGTGG TATCACCTAC TATCTAGACA CTGTGAAGGG CCGATTCACC600ATTTCAAGAG ACAATGCCAA GAACACCCTG TACCTGCAAA TGAGCAGTCT GAAGTCTGAG660GACACAGCCT TGTTTTACTG TGCAAGACAC CGCTCGGGCT ACTTTTCTAT GGACTACTGG720GGTCAAGGAA CCTCAGTCAC CGTCTCCTCA ACCACGACGC CAGCGCCGCG ACCACCAACA780CCGGCGCCCA CCATCGCGTC GCAGCCCCTG TCCCTGCGCC CAGAGGCGTG CCGGCCAGCG840GCGGGGGGCG CAGTGCACAC GAGGGGGCTG GACTTCGCCT GTGATATCTA CATCTGGGCG900CCCCTGGCCG GGACTTGTGG GGTCCTTCTC CTGTCACTGG TTATCACCAG GAGTAAGAGG960AGCAGGCTCC TGCACAGTGA CTACATGAAC ATGACTCCCC GCCGCCCCGG GCCCACCCGC1020AAGCATTACC AGCCCTATGC CCCACCACGC GACTTCGCAG CCTATCGCTC CAAACGGGGC1080AGAAAGMAC TCCTGTATAT ATTCAMCAA CCATTTATGA GACCAGTACA AACTACTCM1140GAGGAAGATG GCTGTAGCTG CCGATTTCCA GAAGMGAAG AAGGAGGATG TGAACTGAGA1200GTGAAGTTCA GCAGGAGCGC AGACGCCCCC GCGTACCAGC AGGGCCAGAA CCAGCTCTAT1260AACGAGCTCA ATCTAGGACG MGAGAGGAG TACGATGTTT TGGACAAGAG ACGTGGCCGG1320GACCCTGAGA TGGGGGGAAA GCCGCAGAGA AGGAAGAACC CTCAGGAAGG CCTGTACAAT1380GMCTGCAGA MGATMGAT GGCGGAGGCC TACAGTGAGA TTGGGATGAA AGGCGAGCGC1440CGGAGGGGCA AGGGGCACGA TGGCCTTTAC CAGGGTCTCA GTACAGCCAC CAAGGACACC1500
TACGACGCCC TTCACATGCA GGCCCTGCCC CCTCGC 1536<210>3<211>241<212>PRT〈213〉人工序列〈223〉人源化抗人肾癌抗原G250单链抗体
<400>3Asp He Val Met Thr Gln Ser Gln Arg Phe Met Ser Thr Thr Val Gly Asp Arg51015Val Ser He Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Val Ser Ala Val Ala Trp Tyr20253035Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu He Tyr Ser Ala Ser Asn Arg404550Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr55 60 65 70Leu Thr He Ser Asn Met Gln Ser Glu Asp Leu Ala Asp Phe Phe Cys Gln Gln75 80 85 90Tyr Ser Asn Tyr Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu He Lys Gly95 100 105Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Asp Val Lys Leu110 115 120 125Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Leu Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys130 135 140Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Thr145 150 155 160Pro Glu Lys Arg Leu Glu Leu Val Ala Ala He Asn Ser Asp Gly Gly He Thr165 170 175 180Tyr Tyr Leu Asp Thr Val Lys Gly Arg Phe Thr He Ser Arg Asp Asn Ala Lys185 190 195Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Leu Phe200 205 210 215Tyr Cys Ala Arg His Arg Ser Gly Tyr Phe Ser Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly220 225 230Thr Ser Val Thr Val Ser Ser235240<210>4<211>723<212>DNA〈213〉人工序列
〈220〉<221>misc_feature〈222〉(I)......(723)〈223〉编码人源化抗人肾癌抗原G250单链抗体的基因〈400〉4
GACATTGTGA TGACCCAGTC TCAAAGATTC ATGTCCACAA CAGTAGGAGA CAGGGTCAGC 60ATCACCTGCA AGGCCAGTCA GAATGTGGTT TCTGCTGTTG CCTGGTATCA ACAGAAACCA 120GGACAATCTC CTAAACTACT GATTTACTCA GCATCCAATC GGTACACTGG AGTCCCTGAT 180CGCTTCACAG GCAGTGGATC TGGGACAGAT TTCACTCTCA CCATTAGCAA TATGCAGTCT 240GAAGACCTGG CTGATTTTTT CTGTCAACAA TATAGCAACT ATCCGTGGAC GTTCGGTGGA 300GGCACCAAGC TGGAAATCAA AGGCAGCACC AGCGGCAGCG GCAAGCCCGG CAGCGGCGAG 360GGCAGCGACG TGAAGCTCGT GGAGTCTGGG GGAGGCTTAG TGAAGCTTGG AGGGTCCCTG 420AAACTCTCCT GTGCAGCCTC TGGATTCACT TTCAGTAACT ATTACATGTC TTGGGTTCGC 480CAGACTCCAG AGAAGAGGCT GGAGTTGGTC GCAGCCATTA ATAGTGATGG TGGTATCACC 540TACTATCTAG ACACTGTGAA GGGCCGATTC ACCATTTCAA GAGACAATGC CAAGAACACC 600CTGTACCTGC MATGAGCAG TCTGAAGTCT GAGGACACAG CCTTGTTTTA CTGTGCAAGA 660CACCGCTCGG GCTACTTTTC TATGGACTAC TGGGGTCAAG GAACCTCAGT CACCGTCTCC 720TCA 723<210>5<211>9<212>PRT〈213〉人工序列〈223〉肿瘤穿透肽iRGD<400>5Cys Arg Gly Asp Lys Gly Pro Asp Cys5<210>6<211>262<212>PRT〈213〉人工序列〈223〉CD8-CD28-CD137-CD3 ζ<400>6Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr He Ala Ser Gln51015Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His20253035Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp He Tyr He Trp Ala Pro Leu Ala Gly404550Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val He Thr Arg Ser Lys Arg Ser Arg
55606570Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg75808590
Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Lys95100105Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr He Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val110115120125Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu130135140Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr145150155160Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu165170175180Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro185190195Gln Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys200205210215Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu He Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys220225230Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp235240245250Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg255260<210>7<211>840<212>DNA〈213〉人工序列〈220〉<221>misc_feature〈222〉(I)......(840)〈223〉编码 CD8-CD28-CD137-CD3 ζ 的融合基因<400>7ACCACGACGC CAGCGCCGCG ACCACCAACA CCGGCGCCCA CCATCGCGTC GCAGCCCCTG 60TCCCTGCGCC CAGAGGCGTG CCGGCCAGCG GCGGGGGGCG CAGTGCACAC GAGGGGGCTG 120GACTTCGCCT GTGATATCTA CATCTGGGCG CCCCTGGCCG GGACTTGTGG GGTCCTTCTC 180CTGTCACTGG TTATCACCAG GAGTAAGAGG AGCAGGCTCC TGCACAGTGA CTACATGAAC 240ATGACTCCCC GCCGCCCCGG GCCCACCCGC AAGCATTACC AGCCCTATGC CCCACCACGC 300
GACTTCGCAG CCTATCGCTC CAAACGGGGC AGAAAGAAAC TCCTGTATAT ATTCAAACAA 360
CCATTTATGA GACCAGTACA AACTACTCAA GAGGAAGATG GCTGTAGCTG CCGATTTCCA 420GAAGAAGAAG AAGGAGGATG TGAACTGAGA GTGAAGTTCA GCAGGAGCGC AGACGCCCCC 480GCGTACCAGC AGGGCCAGAA CCAGCTCTAT AACGAGCTCA ATCTAGGACG AAGAGAGGAG 540TACGATGTTT TGGACAAGAG ACGTGGCCGG GACCCTGAGA TGGGGGGAAA GCCGCAGAGA 600AGGAAGAACC CTCAGGAAGG CCTGTACAAT GAACTGCAGA AAGATAAGAT GGCGGAGGCC 660TACAGTGAGA TTGGGATGAA AGGCGAGCGC CGGAGGGGCA AGGGGCACGA TGGCCTTTAC 720CAGGGTCTCA GTACAGCCAC CAAGGACACC TACGACGCCC TTCACATGCA GGCCCTGCCC 780CCTCGC 840
权利要求
1.一种嵌合抗原受体iRGD-scFv(G250)-CD8-CD28-CD137-CD3 ζ，其特征在于该嵌合抗原受体由肿瘤穿透肽iRGD、人源化抗人肾癌抗原G250的单链抗体、CD8的hinge区和跨膜区及⑶28、⑶137、⑶3的胞内信号结构域依次串联构成。
2.如权利要求I所述的嵌合抗原受体iRGD-scFv(G250)-CD8-CD28-CD137-CD3ζ，其特征在于该嵌合抗原受体的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO. I所示。
3.如权利要求I所述的嵌合抗原受体iRGD-scFv(G250)-CD8-CD28-CD137-CD3ζ，其特征在于该嵌合抗原受体含有针对人肾癌抗原G250的人源化单链抗体，其氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO. 3所示。
4.如权利要求I所述的嵌合抗原受体iRGD-scFv(G250) -CD8-CD28-CD137-CD3 ζ，其特征在于该嵌合抗原受体的氨基末端含有一个具有肿瘤穿透功能的iRGD肽，其氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO. 5所示。
5.如权利要求I所述的嵌合抗原受体iRGD-scFv(G250) -CD8-CD28-CD137-CD3 ζ，其特征在于该嵌合抗原受体以⑶8的hinge区和跨膜区、⑶28、⑶137、⑶3的胞内信号结构域串联而成的结构域为信号传导结构，其氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO. 6所示。
6.权利要求I所述的嵌合抗原受体的用途，该嵌合抗原受体的编码基因能够被转移至T淋巴细胞内，表达该嵌合抗原受体的T淋巴细胞能够单独用于治疗肾癌。
全文摘要
本发明属于生物与新医药技术领域。公开了一种嵌合抗原受体(Chimeric Antigen Receptor,CAR)iRGD-scFv(G250)-CD8-CD28-CD137-CD3ζ及其应用。该嵌合抗原受体由肿瘤穿透肽iRGD、人源化抗人肾癌抗原G250的单链抗体、CD8的hinge区和跨膜区及CD28、CD137、CD3ζ的胞内信号结构域串联构成。该嵌合抗原受体可用于修饰T淋巴细胞。修饰后的T淋巴细胞可用于肾癌治疗。
文档编号A61P35/00GK102775500SQ20121027567
公开日2012年11月14日 申请日期2012年8月3日 优先权日2012年8月3日
发明者张宝福, 张青, 方琳, 李慧忠, 李连涛, 杨洁, 程乾, 章龙珍, 裴冬生, 赵铁锁, 郑骏年 申请人:郑骏年