大黄素-8-β-D-葡萄糖苷在制备治疗突触功能障碍性疾病的药物和保健产品中的应用的制作方法

专利名称：大黄素-8-β-D-葡萄糖苷在制备治疗突触功能障碍性疾病的药物和保健产品中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及药学领域，尤其是一种大黄素-8-β-D-葡萄糖苷在制备治疗突触功能障碍性疾病的药物和保健产品中的应用。
背景技术：
众所周知，神经信息的传递是通过突触部位神经递质的释放来完成，神经递质贮存于突触囊泡中，囊泡是神经末梢特有的细胞器，含递质的囊泡群积聚在突触活性区。神经元受到刺激，产生神经冲动，传至突触前膜，引起突触前膜去极化，细胞外Ca2+内流，触发突触囊泡向突触前膜靠近和融合，引起突触囊泡释放神经递质。突触素与钙离子有很强的结合力，促使突触小泡与突触前膜融合，参与细胞排粒过程中“融合孔”的形成。因而，突触素对神经递质的快速释放和突触小泡的胞吐具有重要作用。而突觸功能失常與神經退化性疾病的密切關係。已有研究证明，在神经退行性疾病早期都有突触的功能异常和突触丢失，而伴有认知或运动等功能障碍。如在老年性痴呆疾病(AD)中，AD患者及APP转基因动物脑组织中突触素的表达显著下降；在糖尿病脑病中，患有糖尿病脑病大鼠海马内突触素的表达显著下降。因此，对突触的保护是一个重要的神经保护治疗措施实施的靶点，对突触功能障碍及缺失进行有效的干预可能延缓神经退行性疾病的进程。

发明内容
本发明的目的是提供一种大黄素-8_β -D-葡萄糖苷在制备治疗突触功能障碍性疾病的药物和保健产品中的应用，其治疗效果好，副作用小。本发明是这样实现的大黄素-8_β -D-葡萄糖苷在制备治疗突触功能障碍性疾病药物和保健产品中的应用。大黄素-8-β-D-葡萄糖苷与药用载体或添加剂混合制成片剂、颗粒剂、粉剂、胶囊剂、扁囊剂、栓剂、糖浆剂、乳剂、口服液、注射液或粉针剂。中药虎杖cuspidatum Sied. et Zuc.)又称阴阳莲、苦仗、斑根、紫金龙，为寥科属植物干燥根及根茎，为我国传统中药。主要分布于华东、中南及辽宁、陕西、甘肃、四川、贵州、云南等地。虎杖具有活血化瘀、清热解毒、去谈止咳、祛风利湿等功效。我们通过活性筛选发现虎杖70%乙醇提取物的正丁醇萃取物(ASB)能够明显地上调细胞突触素I蛋白水平的表达，且能对抗Αβ25_35所导致α3、α7亚单位蛋白质的表达降低，具有较好的开发应用价值。为了阐明虎杖中上调细胞突触素I蛋白水平的表达的物质基础，我们采用活性追踪法对其活性部位进行了追踪，确定了其活性成分为大黄素-8-β -D-葡萄糖苷。虎杖有效部分活性筛选
I.I实验材料及试剂
仪器隔水式电热恒温培养箱(SHELLAB2300型，美国)；Beckman 21R型冷冻离心机(美国Beckman公司)；电热恒温水浴锅(北京市光明医疗仪器厂)；_101型倒置显微镜(江南公司);BIO-RAD Power-pac 3000 电泳仪(美国 BIO-RAD 公司);SANYO SM-P30 型制冰机(日本三洋电机)；TS-92型万向摇床(江苏海门市其林贝尔仪器制造有限公司)；ELX800型酶标仪(美国BIO-TEC公司)；HARRIS-80°C冰箱(美国)；细胞富集器(美国)；超净工作台(苏净集团安泰公司)；2300型CO2培养箱(Sheldon Manufacturing公司)。试剂
DMEM培养液购自Gibco Invitrogen公司(英国)；源于人脑的神经母细胞瘤细胞株(SH-SY5Y 细胞)购于 German Collection of Microorganisms and Cell Cultures 公司(德国)；其他化学试剂购自Sigma公司。I. 2活性筛选 供试样品的制备
取虎杖粗粉，加10倍量的70%的乙醇提取2次，每次2小时，滤过。滤液回收乙醇至清膏。取浸膏加水分散，分别用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇分别萃取。回收溶媒分别得PE萃取物(PEP) ,EtOAc萃取物(PEE)、n_Bu0H萃取物(PBEB)，母液回收溶媒后得H2O部分(CW)。取各萃取物适量用DMEM液(DMS0助溶)配制成浓度为I g生药/mL的样品溶液，备用。活性筛选
A.细胞培养，A β及药材的处理
先用含15%小牛血清的DMEM培养液培养SH-SY5Y细胞，待细胞生长稳定后，改用不含血清的DMEM培养液继续培养，培养箱中含5% CO2，温度为37°C。在SH-SY5Y细胞中加入10μ mol/L的Αβ25_35，培养48小时。为观察各种药材对Aβ毒性作用的影响，先分别加入0. Img/mL及I mg/mL药材提取物培养24小时后,再加入Αβ培养48小时。每一实验组设3个复孔，重复三次实验。B. MTT 测定
MTT是一种四甲基偶氮唑盐，经活细胞线粒体琥珀酸脱氢酶催化可生成蓝紫色的还原ΜΤΤ，该产物在490 nm波长处有极大的吸收峰，可用比色法测定MTT水平[1]，常用来表示细胞的损伤程度和功能状况。向96孔细胞培养板中加入I X IO4/孔SH-SY5Y细胞，待细胞生长稳定后分别加入0. 001、0. 01、0. 1、1、5及10 μ mol/L A β ^42，培养48小时后加入5 mg/mL MTT试剂，代谢4小时后加入酸性SDS溶液溶解过夜并于490 nm处测定吸收值。为筛选药材提取物的安全浓度，选择0. 05 5 mg/mL浓度的样品溶液处理SH-SY5Y细胞，24小时后测定其MTT还原率，以检测其对细胞是否具有毒性作用及其安全浓度范围。1.3试验结果
SH-SY5Y细胞经Αβ及虎杖各组分处理后，测定其MTT还原率发现，10 μ mol/LΑβ25_35&理细胞后引起MTT还原率明显降低；而用虎杖PEP、PEE、PEB、PEW预处理细胞后，PEP、PEE显示有细胞毒性作用，PEB能明显减弱A β对细胞的毒性作用，ASW减弱A β对细胞的毒性作用不明显，Αβ组与ΡΕΒ+Αβ组之间的差异有统计学意义(P < 0.01)。对抗Αβ细胞毒活性检测结果表明PEB > PEff > PEE=PEP。虎杖有效部位化学成分研究2.1.实验材料及器材 样品来源及鉴定
虎杖药材采自新疆，经贵阳医学院药学院生药与植物学教研室鉴定本品为寥科植物虎故{Polygonum cuspidatum Sied. et Zuc.)的干燥根及根莖。实验仪器
Waters2475半制备高效液相色谱仪；Angilentll00高效液相色谱仪；IN0VA-400型核磁共振仪(TMS为内标)；HP 5973质 谱仪(电离条件为70 eV) ;KQ_250B型超声波清洗仪(昆山市超声仪器有限公司)；国产X-4型显微熔点仪测定，温度计未校正JrukerVECT0R-22型红外光谱仪测定(KBr压片);紫外光谱岛津-2401型紫外光谱仪测定。实验材料
实验所用硅胶(200 300目)和高效薄层层析板(GF254),聚酰胺薄层层析板(青岛海洋化工厂生产)；Sephadex LH-20 (Amersham Pharmacia Biotech公司生产)；反相娃胶(RP-C18)(德国Merck公司生产)；D_101型大孔吸附树脂(天津农药股份有限公司树脂分公司生产)；工业用微晶纤维素。常用试剂石油醚、乙酸乙酯、氯仿、丙酮、甲醇、二乙胺、甲酸等。层析用溶剂均为工业纯(重蒸)，其它溶剂均为分析纯。显色剂碘、10% H2SO4乙醇溶液、5% FeCl3乙醇液、2% K3 [Fe (CN)6]水溶液。2. 2实验方法 提取
取虎杖粗粉13 kg,用10倍量70%的乙醇提取2次，每次2 h，合并滤液，减压回收乙醇得浸膏。取浸膏加水分散，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇分别萃取。回收溶媒得石油醚萃取物PEP) 18 g，EtOAc萃取物(PEE) 480 g，n_BuOH萃取物(PEB) 448 g，母液回收溶媒后得 H2O 部分(PEW) 534 g0取正丁醇(PEB)部分用水分散后，通过DlOl大空树脂柱层析，分别用水、20%乙醇、50%乙醇及90%乙醇洗脱，收集各部分洗脱液，回收乙醇病浓缩至浸膏,分别得水部50g，20%乙醇洗脱部235g，50%乙醇洗脱部28g，90%乙醇洗脱部15g。20%乙醇洗脱部分经硅胶柱层析，乙酸乙酯-甲醇(25:1-甲醇)洗脱，分别得到A— G七个部分。下面对其各部分分别进行分离纯化。分离
(I) A部分洗脱物的分离
取A部分洗脱物(7. 3g),加乙醇超声使其充分溶散后,称取拌样娃胶10. 5g (按样娃胶I : 1-1 I. 5)加热条件下拌样，硅胶柱层析(200 300目)，乙酸乙酯-甲醇梯度洗脱(25:1 — I: I)洗脱得5个流份(A1 5)，取A2部分经反复硅胶柱层析，乙酸乙酯-甲醇20:1-5:1)洗脱，得化合物H-I (I. 6g)。A3反复凝胶柱层析，氯仿-甲醇(I: I)洗脱，得化合物H-2 (23mg)。A4经多次硅胶柱层析，氯仿-甲醇(18:1-2:1)洗脱，得到化合物H-3 (52mg)。(2) B部分洗脱物的分离
取B部分洗脱物(15 g)，硅胶柱层析(200 300目)，乙酸乙酯-甲醇(18:1-1:1)梯度洗脱，得到7个流份(B1^7)15 B2经过反复硅胶柱层析，二氯甲烷-甲醇(15:1-1:1)梯度洗脱，得到化合物H-4 (37mg);B3采用制备型HPLC色谱纯化，色谱条件为C18柱(200X)，检测波长为254nm，流动相为甲醇-水(80 :20)，流速为3ml/min，最好得到化合物H_5(21mg);B5经硅胶反复柱层析，氯仿-甲醇(15:1-1:1)梯度洗脱，得到化合物H-6(26mg)。·
(3)C部分洗脱物的分离
取C部分洗脱物(4.8 g)，硅胶柱层析(200 300目)，氯仿-甲醇(15:1 - 1:1)梯度洗脱，得到5个流份((卜5)。C2经过反复硅胶柱层析，二氯甲烷-甲醇(15:1-2:1)洗脱，得到化合H-7的粗品220mg，经过反复凝胶柱层析，氯仿-甲醇(I I)为洗脱剂，得到化合物 H-7 (168mg)。 (4) D部分洗脱物的分离
取D部分洗脱物(4.1 g)，硅胶柱层析(200 300目)，氯仿-甲醇(12:1 - 1:1)梯度洗脱，得到3个流份(0卜5)。D2经过反复硅胶柱层析，氯仿-甲醇(12:1-1:1)洗脱，得到化合物H-9的粗品26mg，经过反复凝胶柱层析，甲醇为洗脱剂，得到化合物H-9 (24mg)。(5) E部分洗脱物的分离
取E部分洗脱物5.8 g)硅胶柱层析(200 300目)，氯仿-甲醇(10:1 - 1:1)梯度洗脱，得到5个流份化卜7)。E3&E5经过反复硅胶柱层析，氯仿-甲醇(10:1-1:1)洗脱，得到化合物H-9 (68mg)及化合物H-IO (56mg)。化合物结构鉴定
化合物I (η-i):橙红色结晶(甲醇)，不溶于水，易溶于氯仿，dmso。1HnmrgoomHz,DMSO-Cl6), δ 7. 61 (1H br s, H4), 7 25 (1H d, J=2. 4Hz, H5), 7. 09 (1H br s, H2) ,6. 63 (1Hd, J=2. 4Hz, H7) ,2. 46 (3H s, Me) ；13C 匪R(400MHz，DMSO-A) :21. 37 (CH3 )，107.83 (C7, 108. 62 (C8a), 109. 09 (C5), 113. 04 (C9a), 120. 19 (C2), 123. 57 (C4), 132. 62 (C4a),134. 67 (C10a)，147. 33 (C3)，161. 62 (C6)，164. 6 (C1)，165. 29 (C8)，189. 73 (C9)，181. 34 (C10)。以上数据与文献所报道的大黄素(Emodin)数据一致。化合物2 (H-2):橙色针晶(氯仿-丙酮)，mp 278 279°C，紫外灯(365nm)下显橙色荧光，三氯化铁-铁氰化钾显蓝色。1HNMR (400MHz, DMSOch6) ) δ :7.22 (1H，br s，H2)，7. 61 (1H, br s, H4), 7. 10 (1H, br s, H5), 6. 57 (1H, br s, H7), 4. 60 (2H，s，-CH2OH) ; 13NMR(400MHz,DMSOch6) δ :161.35 (C7), 120. 65 (C2), 152. 74 (C3), 116. 95 (C4), 132. 78 (C4a),113.93 (C5), 164. 37 (C6)), 107. 81 (C7), 165. 54 (C8), 189. 58 (C9), 181. 22 (C10), 108. 74(Cga),108. 85 (C9a),135. 00 (C10a),61. 91 (CH2OH)0 以上理化常数、1HNMR 谱数据与文献中报道6-羟基芦荟大黄素(citreorosein) —致，13C NMR谱数据与结构相符。化合物3 (H-3):橙红色针状结晶(氯仿)。EI-MS m/z (%) :284 [Μ] (100)，255 [M-CH0]+ (33)，241[M-CH3C0]+ (37) ； 1Hnmr(^omHz)CDCI3) δ :6.99(1 H, s,H2)，7.54(1 H, s, H4) ,7. 25(1 H, d, J=2. 5 Hz, H5), 6. 60(1 H, d, J=2. 5Hz, H7), 2. 42(3H, s’ CH3), 3. 86 (3 H, s, OCH3)，12. 20，12. 20 (I H each, s’ OH) ；13C 匪R(400MHz，DMS0-d6) δ 164. 87 (C1)，120. 84 (C2)，148. 11 (C3)，124. 09 (C4)，107. 87 (C5)，162. 14 (C6)，106. 37 (C7)，166. 26 (C8)，190. 46 (C9)，181. 49 (G10)，132. 91 (C4a)，110. 23 (C8a)，113. 15 (C9a)，134. 60 (C10a)，21. 74 (CH3)，55. 75 (OCH3)。以上碳氢谱数据与文献报道大黄素_6_甲醚(Physcion) 一致。化合物4 (H-4):桔黄色针晶(甲醇)。EI-MS m/z (%) :284 [M] +(100)，255 [M-CHO]+ (52) ； 1H NMR(400MHz，DMS0_d6) δ :7.10(1 H, s. H2), 7. 40(1 H, s. H4),7. 18(1 H, d, J=2. O Hz, H5), 6. 82(1 H, d, J=2. 0 Hz, H7). 2. 36(3 H, s. CH3), 3. 88(3 H,s，OCH)，13. 21 (I H, s, OH) ； 13C 匪R(400MHz，DMS0_d6) δ 163. 38 (C1), 119. 01 (C2),146. 53 (C3)，124. 95 (C4)，106. 93 (C5)，161. 63 (C6)，104. 94 (C7)，164. 32 (C8)，186. 22 (C9)，182. 21 (C10)，131. 97 (C4a)，112. 67 (C8a)，114. 32 (C9a)，136. 75 (C10a) ,21. 28 (CH3)，56. 28 (OCH3)。以上碳氢谱数据与文献报道的大黄素-8-甲醚(Quistin) —致。化合物5(H-5):红棕色片状结晶(甲醇)，mp 195 197°C，EI-MS m/z 254[M+,基峰]，226[M-C0+20] 198[M-2C0+ ,14], 152(21) ； 1H NMR(400MHz，DMS0_d6 ) δ 11. 97(1H,s’ C8-OHorC1-OH)，11. 87 (1H, s’ C8-OHorC1-OH) 7. 84 (1H, d, J=8. OHz, H4 ),7. 76 (1H, dd,J=8. 0Hz，7. 5 Hz, H5), 7. 71 (1H, d, J=7. 5Hz, H6), 7. 82 (1H，d, J=4. 5Hz, H3), 7. 39 (1H, d,J=4. 5Hz，H2)，2.45 ( 3H, s,Ar-CH3)与大黄酚对照品共TLC Rf值一致，混合后熔点不下降以上波谱数据与文献报道数据对照确定该化合物为大黄酚(chrysophanol)。化合物6 (H-6):桔黄色针状结晶(乙醇)。mp :318 320°C;EI-MS m/z (%) 284(M+ 185,139,115,97 NMR(400 MHz，CDCl3) δ :7. 46 (1H，d，J=I. 5 Hz, H4) ,7. 44 (1H, t,J=7. 7Hz, H6), 7. 34 (IH, d, J=L 5 Hz, H2), 7. 17 (1H, dd, J=L OHz, J=7. 3Hz, H5), 7. 14 (1H，dd,J=L 0 Hz, J=7. 3 Hz, H7) ；13C NMR(400 MHz，CDCl3) δ 186. 9 (C9), 182. 3 (C10), 165. 2 (C3),161. 6 (C1)，161. 2 (C8)，136. 8 (C5a)，132. 6 (C6)，132. 5 (C4a)，124. 7 (C8a) , 119. 8 (C5)，114. 9 (C4) ,113.6 (C7)，108. 8 (C2)，107. 8 (Cla).以上数据与文献报道大黄酸(Rhein)数据一致。化合物7(H_7):橙黄色粉末，不溶于水，易溶于氯仿，DMSO。UV(MeOH) Amax 433，284，221 nm :1 HNMR(400MHz, DMS0-d6) -J. 45 (1H br s’ H4), 7. 28 (1H d, J=2. 3Hz, H5),7. 14(1H br s，H2)，6. 99 (1H d，J=2. 3Hz，H7)，5. 06 (1H d，J=7. 7Hz，H1)，3. 75 (1H dd, J=Il. 9,1·6Ηζ，Η6' a )，3. 54(1H dd，J=Il. 9，I. 6Hz，H6 ' β ), 3. 50-3. 20 (4H) CNMR(400MHz,DMS0-d6) δ 161. 66 (Cl), 125. 14 (C2), 147. 06 (C3), 119. 30 (C4), 132. 07 (C4a),106. 59 (C5), 164. 72 (C6) )，107. 51 (C7), 160. 68 (C8), 114. 49 (C8a), 186. 41 (C9), 114. 41(C9a), 181. 84 (CIO), 136. 34 (C10a),21. 33 (3-CH3)，100. 93 (Cl, ),73.29 (C2, ),77.46(C3, ),69.89 (Cf ),76.55 (C5, ),60.84 (C6,)。该化合物为大黄素 _8_0-β-D 葡萄糖苷(Emodin-8-0- β -D-glucopyranosid)与文献所报道的大黄素-8-0-β -D-卩比喃葡萄糖苷数据一致。化合物8 (Η-8):黄色结晶(乙醇)，mp. 314-317°C，溶于乙醇。1H NMR(400MHz,DMS0-d6), δ 6. 27 (1H br s, H4), 7 25 (1H d, J=2. 4Hz, H5), 7. 09 (1H br s, H2) ,6. 63 (1Hd, J=2. 4Hz, H7) ,2. 46 (3H s, Me) ； 13C 匪R(400MHz，DMSO-A) :21. 37 (CH3 )，107.83 (C7, 108. 62 (C8a), 109. 09 (C5), 113. 04 (C9a), 120. 19 (C2), 123. 57 (C4), 132. 62 (C4a),134. 67 (C10a)，147. 33 (C3)，161. 62 (C6)，164. 6 (C1)，165. 29 (C8)，189. 73 (C9)，181. 34 (C10)。以上数据与文献中报道的槲皮素(Quercetin) —致。化合物9 (H-9):白色针状结晶(甲醇)，mp 256-258°C，紫外灯光(365nm)下显蓝色荧光。1HNMR (400MHz, CDCl3) δ 9. 56 (1Η, s’ C4, -OH) ,9. 20 (2H, s’ C3-OH, C5-OH),7. 39 (2H, d, J=8. 5Hz, H2', H6')，6. 74 (2H, d, J=8. 5Hz, H3', H5')，6. 93 (1H, d, J=16. 3Hz,乙烯 H0)，6. 80(1H，d, J=16. 3Hz,乙烯 Ha )，6·38 (2H, d, J=2. OHz, H1, H6),6. 11 (1H, t,H4) ;13C 匪 R (400MHz，CDCl3) δ 126. 35 (Ca) , 128. 58(C0) , 139. 97(0^ , 104. 99 (C2),
159.21 (C3, C5)，102. 46 (C4)，128. 77 (Cr)，128. 58 (C2'，C5O，116. 22 (C3'，C5')，157. 92 (C4')。以上数据与文献中报道的白藜芦醇(Resveratrol) —致。化合物10 (H-10):白色针晶(MeOH-水)。EI-MS m/z (%) :389 [M-H] 一(100)，227 [389-162] — (32) ; 1H NMR(400MHz，CD3OD) δ 6. 83 (1Η, t, J=2. OHz, H2), 6. 47 (lH，t，J=2. OHz, H4), 6. 67 (1Η, t, J=2. OHz, H6), 7. 41 (1Η, d, J=8. 5Hz, H2')，6· 84 (2Η, d, J=8. 5 Hz,H3'，H5-) ,7. 41 (1Η, d, J=8. 5 Hz, H6')，6· 90 (1Η, d, J=16. 3 Hz, Hj，7· 08 (1H, d, J=16. 3 Hz,Hb) ,4. 94 (1H, d, J=7. 7 Hz, SUgarH1) ；13C NMR(00MHz，CD3OD) δ :140.91(^),106. 76 (C2), 160.29 (C3)，104. 03 (C4)，159. 42 (C5)，108. 29 (C6)，126. 56 (Ca)，129. 73 (Cb)，129. 95 (C/ )，128. 84 (C2- ),116. 48 (C3') ,158.29 (C4') ,116.48 (C5' )，128. 81 (C6')，C1 6 的 δ 值依次为102. 16, 74. 81, 78. 53, 71. 59, 77. 81,62. 86 以上碳氢谱数据与文献报道白藜芦醇苷(Polydatin ) 一致。虎杖有效部分单体的活性筛选
3.1活性筛选方法同“虎杖有效部分活性筛选”
3.2结果
结果发现大黄素-8-β -D-葡萄糖苷能较好地对抗Κβ引起的细胞毒性。大黄素-8_β -D-葡萄糖苷对细胞突触素I蛋白水平表达的影响
4.I材料
D-MEM培养液购自Gibco Invitrogen公司(英国)；源于人脑的神经母细胞瘤细胞株(SH-SY5Y 细胞)购于 German Collection of Microorganisms and Cell Cultures 公司(德国)；兔抗突触素及兔抗B—actin抗体分别购自Epitomics及Sigma公司；HRP标记的抗羊及抗鼠二抗购自Santa Cruz Biotechnology Inc (美国)。聚乙烯二氟(PVDF)膜、ECL-Plus发光试剂、高效显影胶片购自Amersham公司；其它化学试剂均购自Sigma公司。4.2 方法
A.细胞培养，β -淀粉样肽及化学单体的处理
先用含15%胎牛血清的DMEM培养液培养SH-SY5Y细胞，待细胞生长稳定后，改用不含血清的DMEM培养液继续培养，培养箱中含5% CO2，温度为37 °C。在SH-SY5Y细胞中加入I μ mol/L的Ai^42，培养48小时。为观察大黄素_8_ β _D_葡萄糖苷对A β卜42毒性作用的影响，先分别加入0. 05mg/ml大黄素_8_ β-D-葡萄糖苷培养24小时后,再加入培养48小时。每一实验组均设3个复孔，重复三次实验。2. 3 3-4, 5_ 二甲基噻唑 _2，5_ 二酌·四唑溴化物(3_(4，5-dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenyltetrazoIium bromide, MTT )测定
为筛选各化学单体的安全浓度，选择0，0.005，0.025，0.05，0.1，0. 25, 0.5，I, 5，10mg/ml浓度处理SH-SY5Y细胞后24小时后测定MTT还原率，以检测其对细胞是否具有毒性作用及其安全浓度范围。B.细胞分组诱导及相应的药物干预
Cl)正常对照组不经药物处理，培养期为48小时。(2)Αβ处理组在培养的细胞中加入I μ M A^_42，培养时间为48小时用PBS溶解后，37 °C孵育72小时)。
(3)大黄素-8-i3_D-葡萄糖苷处理组加入O. lmg/ml大黄素_8_ β _D_葡萄糖苷培养48小时。(4)化合物单体和A β处理组先加入O. lmg/ml大黄素_8_ β -D-葡萄糖苷预培养24小时后，再按照A β处理组方法进行处理。C.药物处理后MTT还原率测定
向96孔细胞培养板中，加入一定数量(约I X IO4/孔)待检测细胞，分组药物处理细胞后测定MTT水平。D.突触素蛋白表达测定
细胞经上述分组处理后，提取细胞总蛋白，测定蛋白浓度。用蛋白印迹(Westernblotting)方法检测SH-SY5Y细胞SYP蛋白水平。以Bandscan软件分析结果时以β-actin蛋白条带作为内参照，计算SYP蛋白条带与β -actin蛋白条带像素灰度的百分比值作为SYP蛋白质表达的相对水平比。E.统计学分析
每组所得结果用均数土标准差表示，结果用SPSS12. O统计软件进行单因素方差分析。*P〈0. 05或**P〈0. 01表示差异有显著性或高度显著性意义。4. 3大黄素-8- β -D-葡萄糖苷安全浓度筛查
4.3. I大黄素-8-β-D-葡萄糖苷的浓度等于或大于200 μ M时，SH-SY5Y神经细胞MTT还原率出现降低，表明样品浓度等于或大于200 μ M时明显降低细胞增殖能力，具有一定的细胞毒性作用在0-160 μ M范围时细胞MTT还原率无明显变化，表明该浓度对细胞毒性作用较小。因此选择此浓度范围研究药物选用浓度。
表L大賞囊·Ι>-葡萄糖苷安全浓度Jf选(i 土S》
___WM imgM)___QD57O__
00.90!金 O OS 0.0C5 0.02
_￡05__3 W72± 0.09
太黃營4- P -D-葡藝糖苷 _OJ__I. Hfe O QtI_
O 251。遞知 OOS
OSI _ O 02
10.64 土 ....................................................................................................................................5...................................................................................................................................................................................................................——O......03.............................................................................
_O 0J3*,
注:与对麗組比较，Cl. OI4. 3. 2大黄素-8- β -D-葡萄糖苷对SH-SY5Y神经细胞SYP蛋白表达水平的影响 选用O. lmg/ml大黄素-8-β-D-葡萄糖苷处理细胞48小时，收集细胞，测定细胞SYP
蛋白水平，以Bandscan软件分析结果时以β -actin蛋白条带作为内参照,计算SYP蛋白条带与β-actin蛋白条带像素灰度的百分比值作为SYP蛋白表达的相对水平比。结果表明大黄素-8-β -D-葡萄糖苷可上调细胞SYP蛋白水平。如图I所示。4. 3. 3大黄素-8- β -D-葡萄糖苷对抗A β对SYP蛋白水平的影响
与对照组相比，I μΜ APh2处理细胞后引起SYP蛋白水平明显降低。用O. lmg/ml大黄素-8-B-D-葡萄糖苷预处理细胞可减弱Ai^_42对细胞SYP蛋白水平的下调作用。如图2所示。由于采用了上述技术方案，本发明采用大黄素-8_β-D-葡萄糖苷作为神经保护齐U，将其制备为药物，可有效治疗突触功能障碍性疾病，如老年性痴呆症，而且副作用小。本发明的化合物为中药虎杖的提取物，因此其材料来源方法，成本低廉。本发明方容易实施，成本低廉，使用效果好。


附图I为大黄素-8-B-D-葡萄糖苷对细胞SYP蛋白表达水平的影响；与对照组比较，> < 0.01 ；
附图2为大黄素-8-B-D-葡萄糖苷对抗A β对SYP蛋白水平的影响；
与对照组比较，< 0.01 ;与六3处理组比较，< 0.05。
具体实施例方式本发明的实施例I :取大黄素-8-β -D-葡萄糖苷5g、药用淀粉75 g、微晶纤维素20 g，将药用淀粉先干燥，过120目筛，再与大黄素-8-β-D-葡萄糖苷、微晶纤维素混合，过两次120目筛，填入硬胶囊中，制成1000粒本发明胶囊。每粒硬胶囊含主药成分O. 5 mg。本发明的实施例2 :取大黄素-8-β -D-葡萄糖苷5g、羟丙甲纤维素6g、羧甲淀粉钠10g，微晶纤维素Sg，乳糖115g、淀粉50g，硬脂酸镁Ig ;将主药与辅料充分混匀后投入高速搅拌机中，喷雾加水适量，整粒，水分控制在3 4%，然后压片，制成1000片，包薄膜衣。本发明的实施例3 :取大黄素-8-β-D-葡萄糖苷5g，加入400 ml聚乙二醇200溶解，再加入适量蒸馏水进行稀释，然后再加入适量蔗糖并调整体积至1000 ml,搅匀，过滤，灌装成10 ml或20 ml每只，灭菌包装。
权利要求
1.大黄素-8-0-D-葡萄糖苷在制备治疗突触功能障碍性疾病的药物和保健产品中的应用。
2.根据权利要求I所述的大黄素-8-0-D-葡萄糖苷在制备治疗突触功能障碍性疾病的药物和保健产品中的应用，其特征在于大黄素-8- ^ -D-葡萄糖苷与药用载体或添加剂混合制成片剂、颗粒剂、粉剂、胶囊剂、扁囊剂、栓剂、糖浆剂、乳剂、口服液、注射液或粉针剂。
全文摘要
本发明公开了一种大黄素-8-β-D-葡萄糖苷作为在制备治疗突触功能障碍性疾病的药物和保健产品中的应用。本发明能有效治疗神经退行性疾病如老年性痴呆症，而且副作用小。本发明采用大黄素-8-β-D-葡萄糖苷作为神经保护剂，将其制备为药物，可有效治疗突触功能障碍性疾病，如老年性痴呆症，而且副作用小。本发明的化合物为中药虎杖的提取物，因此其材料来源方法，成本低廉。本发明方容易实施，成本低廉，使用效果好。
文档编号A61P25/00GK102764265SQ20121028028
公开日2012年11月7日 申请日期2012年8月8日 优先权日2012年8月8日
发明者肖海涛, 郝小燕, 齐晓岚 申请人:贵阳医学院