I型组蛋白去乙酰化酶抑制剂在抑制肾脏纤维化中的应用的制作方法

I型组蛋白去乙酰化酶抑制剂在抑制肾脏纤维化中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供了I型HDAC抑制剂在制备抑制促纤维化受体的组合物或药物中的用途。本发明还提供I型HDAC抑制剂在抑制TβRI、EGFR和PDGFR中的用途，以及体外非治疗性的抑制肾脏细胞纤维化的方法。本发明的抑制剂在抑制促纤维化受体的同时不影响拮抗纤维化的受体的表达和磷酸化，因此是一种选择性抑制剂，从而能够作为副作用低的纤维化治疗药物。
【专利说明】I型组蛋白去乙酰化酶抑制剂在抑制肾脏纤维化中的应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及医学领域。具体地说，本发明涉及利用I型组蛋白去乙酰化酶抑制剂抑制肾脏纤维化。
【背景技术】
[0002]组蛋白去乙酰化酶(HDAC)是一类酶家族，其除去组蛋白的乙酰基以沉默基因转录[1，2]并催化许多非组蛋白蛋白质去乙酰化[3-7]以调节它们的功能。HDAC有四类:1型(HDAC1、2、3 和 8) ；11 型(HDAC4、5、6、7、9 和 10)、III 型(SIRT1-7)和 IV 型(HDACll) [8]。前两类型的HDAC认为是“经典” HDAC，是目前用于治疗癌症和其它疾病的泛-HDAC抑制剂(SP，曲古抑菌素A(TSA)、伏立诺他)的主要靶点[8，9]。
[0003]除了肿瘤外，HDAC抑制剂还对一些非恶性疾病显示治疗作用。例如，HDAC抑制剂能有效缓解一些神经退化性疾病[10，11]并减轻心脏[12，13]、肝脏[14，15]和皮肤[16]的组织纤维化。因此，HDAC可以成为治疗慢性肾病(CKD)的新型靶点。然而，HDAC抑制作用介导肾脏纤维化的减弱的分子机理未知。
[0004]大多数CKD的发病机理涉及导致肾脏纤维化的血液动力学和炎性过程复杂机制，其特征在于肾脏成纤维细胞的活化和过量胞外基质(ECM)蛋白的累积[27，18]。以前的研究证明许多细胞因子和生长因子是刺激成肌纤维细胞增殖/活化以及诱导ECM产生的强效有丝分裂原[19，20]。这些生长因子和细胞因子通过与其受体结合施加其生物学效应。各种慢性肾病显示几种细胞因子/生长因子受体的表达增加，包括转化生长因子受体(T^R) [21]、表皮生长因子受体(EGFR) [22-24]和血小板衍生生长因子受体(I3DGFR) [25]。通过药学或遗 传学方法抑制T β R、EGFR和TOGFR能在动物模型中减弱肾脏纤维化[26-30]。这提示这些受体在肾脏纤维发生中起至关重要的作用。
[0005]最近的研究表明，HDAC抑制剂能抑制包括EGFR在内的各种蛋白质表达。例如，伏立诺他或TSA通过EGFR mRNA的转录阻遏降低EGFR在肺和结肠直肠癌细胞中的表达[31，32];抑制HDAC6增强EGFR的内吞作用以及随后通过微管蛋白乙酰化增加的降解
[33]。在培养的近曲小管细胞和糖尿病大鼠肾脏中，伏立诺他也显示降低EGFR蛋白和mRNA水平，并减弱细胞增殖[34]。因此，细胞因子/生长因子受体可以是HDAC抑制剂的靶点。
[0006]与上述受体相反，外源性肝细胞生长因子激活C-Met缓解了肾脏间质纤维化
[35]，从而提示c-Met作为抗纤维化介质的重要作用。
[0007]因此，本领域急需能导致T β R,PDGFR和EGFR下调，但同时能维持c_Met水平的治疗方法和药物来治疗肾脏纤维化。

【发明内容】

[0008]本发明的目的是提供能下调促纤维化受体，但不影响拮抗纤维化的受体的药物组合物和治疗方法，从而能治疗肾脏纤维化。
[0009]在第一方面，本发明提供I型HDAC抑制剂的用途，所述I型HDAC抑制剂用于制备抑制促纤维化受体的组合物。
[0010]在优选的实施方式中，所述组合物是药物组合物。
[0011]在另一优选的实施方式中，所述促纤维化受体选自下组
[0012]在另一优选的实施方式中，所述组合物还抑制Smad-3、STAT3和ERK1/2途径的活化；和/或所述组合物不影响c-Met的表达或磷酸化。
[0013]在另一优选的实施方式中，所述I型HDAC抑制剂是MS-275或其药学上可接受的盐。 [0014]在另一优选的实施方式中，所述药物组合物用于抑制肾脏纤维化。
[0015]在第二方面，本发明提供I型HDAC抑制剂的用途，所述I型HDAC抑制剂用于制备治疗或预防肾脏纤维化的药物。
[0016]在另一优选的实施方式中，所述I型HDAC抑制剂包括MS-275或其药学上可接受的盐。
[0017]在另一优选的实施方式中，所述药物还抑制选自下组的一种或多种促肾脏纤维化受体:Τ β R1、EGFR 和 PDGFR。
[0018]在另一优选的实施方式中，所述药物还抑制Smad-3、STAT3和ERK1/2途径的活化；和/或所述药物不影响c-Met的表达或磷酸化。
[0019]在第三方面，本发明提供I型HDAC抑制剂在抑制TPR1、EGFR和TOGFR中的用途。
[0020]在另一优选的实施方式中，所述抑制是非治疗性的和体外的。
[0021]在另一优选的实施方式中，所述I型HDAC抑制剂还抑制Smad-3、STAT3和ERK1/2途径的活化；和/或
[0022]所述I型HDAC抑制剂不影响c_Met的表达或磷酸化；和/或
[0023]所述I型HDAC抑制剂还抑制肾脏纤维化。
[0024]在另一优选的实施方式中，所述I型HDAC抑制剂是MS-275或其药学上可接受的盐。
[0025]在第四方面，本发明提供体外非治疗性的抑制肾脏细胞纤维化的方法，其特征在于，包括步骤:在I型HDAC抑制剂存在下，培养肾细胞，从而抑制肾脏细胞的纤维化；
[0026]较佳地，所述I型HDAC抑制剂是MS-275或其药学上可接受的盐。
[0027]应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
【专利附图】

【附图说明】
[0028]图1显示了 MS-275降低梗阻肾脏中的ECM沉积。(A)显示各种处理后肾脏组织的Masson染色的显微照片。(B)相对于10个随机肾皮质的整个面积，分析Masson-阳性肾小管间质面积(蓝色)(200X)(平均值土SEM)。数据表示为平均值土SEM(n=6)。上标字母不同的平均值彼此显著不同(P〈0.05)。
[0029]图2显示了 MS-275抑制梗阻肾脏中胶原1、纤连蛋白、a -SMA的表达并增强乙酰基-组蛋白Η3的表达。肾脏组织裂解物用纤连蛋白、胶原1、α -SM,乙酰基-组蛋白Η3或GAPDH的特异性抗体作免疫印迹分析(A)。通过光密度分析法定量纤连蛋白(B)、胶原I (C), a -SMA (D)、乙酰基-组蛋白Η3 (E)的表达水平，并用GAPDH标准化。数据表示为平均值土 SEM(n=6)。上标字母不同的平均值间有显著差异(P〈0.05)。
[0030]图3显示了 MS-275对梗阻肾脏中UUO-诱导T β RI表达和smad3磷酸化的作用。在所示时间点(A)或在输尿管梗阻后第7天(B)收集肾脏组织，细胞裂解物分别用T β RI (A, B)、p-Smad和Smad(B)的特异性抗体作免疫印迹分析。通过光密度分析法分别定量T β RI和p-Smad的表达水平，并用GAPDH和Smad3标准化(C，D)。数据表示为平均值土SEM(n=6)。上标字母不同的平均值间有显著差异(P〈0.05)。
[0031]图4显示了 MS-275对梗阻肾脏中UUO-诱导TOGFR表达和磷酸化的作用。在所示时间点㈧或在输尿管梗阻后第7天(B)收集肾脏组织，细胞裂解物用P-PDGFRP和TOGFRi^的特异性抗体作免疫印迹分析(A，D)。通过光密度分析法分别定量p-PDGFRi3和TOGFRi^的表达水平，并用I3DGFRP (B, E)和GAPDH(C，F)标准化。数据表示为平均值土SEM(n=6)。上标字母不同的平均值间有显著差异(P〈0.05)。
[0032]图5显示了 MS-275对梗阻肾脏中UUO-诱导EGFR表达和磷酸化以及Lcn2表达的作用。在输尿管梗阻后第7天收集肾脏组织，细胞裂解物用p-EGFR、EGFR或Lcn_2的特异性抗体作免疫印迹分析(A)。通过光密度分析法分别定量p-EGFR(B)、EGFR (C)或Lcn_2 (D)的表达水平，并用EGFR或GAPDH标准化。数据表示为平均值土SEM(n=6)。上标字母不同的平均值间有显著差异(P〈0.05)。
[0033]图6显示了 MS-275对梗阻肾脏中G2/M期的上皮细胞细胞周期停滞和TGF-β I表达的作用。在输尿管梗阻后第7天收集肾脏组织。显微照片显示丝氨酸10的P-组蛋白Η3有免疫荧光染色(红色)(A)。随机计数10个肾皮质视野中的P-组蛋白Η3-阳性细胞(200 X)(平均值土 SEM)⑶。组织裂解物用丝氨酸10的P-组蛋白Η3的特异性抗体作免疫印迹分析(C)。采用ELISA测定肾脏组织提取物的TGF-β 1(D)。数据表示为平均值土SEM(n=6)。上标字母不同的平均值间有显著差异(P〈0.05)。
[0034]图7显示了 MS-275对梗阻肾脏中c_Met的磷酸化和MET表达的作用。在所示时间点(A)或在输尿管梗阻后第7`天(D)收集所示各种处理后的肾脏组织，细胞裂解物用p-c-Met和MET的特异性抗体作免疫印迹分析(A，D)。通过光密度分析法定量不同组中p-c-MET (B, E)和c-MET (C，F)的表达水平，并用MET或GAPDH(B)标准化。数据表示为平均值土 SEM(n=6)。上标字母不同的平均值间有显著差异(P〈0.05)。
[0035]图8显示了 MS-275对梗阻肾脏中STAT3和ERK1/2磷酸化的作用。肾脏组织裂解物用磷酸-STAT3 (p-STAT3)、STAT3、磷酸-ERK1/2 (p-ERKl/2)和ERK1/2的特异性抗体作免疫印迹分析(A)。通过光密度分析法定量p-STAT3、STAT3、p-ERKl/2和ERK1/2的表达水平。激活的 STAT3 ⑶和 ERK1/2 (D)分别用 p_STAT3/STAT3、p-ERK/ERK 之比表述。用 GADPH 标准化STAT3(C)和ERK1/2(E)的蛋白质水平。数据表示为平均值土SEM(n=6)。上标字母不同的平均值间有显著差异(P〈0.05)。
[0036]图9显示了 MS275对培养的肾脏间质成纤维细胞中TGF-β I诱导胶原1、a -SMA和纤连蛋白及乙酰基-组蛋白Η3表达的作用。在MS-275存在下(0-2.0 μ Μ)，血清饥饿的NRK-49F细胞与2ng/ml TGF- β I温育24小时。细胞裂解物用胶原1、a -SMA、纤连蛋白、乙酰基-组蛋白Η3或GAPDH(A)和T β R1、p_Smad3或Smad3 (E)的抗体作免疫印迹分析(A)。此为三个或更多个免疫印迹实验的代表。通过光密度分析法定量所示蛋白质的表达水平，并用GAPDH标准化(B、C、D)。数据表示为平均值土SEM。上标字母不同的平均值间有显著差异(P〈0.05)。
[0037]图10显示了 MS275对培养的肾脏间质成纤维细胞中H)GFR、EGFR、cMET、STAT3和ERK1/2的磷酸化和表达的作用。将不同剂量的Μ3-275(0-2.0μΜ)直接加入血清培养的NRK-49F，并温育24小时。细胞裂解物用所示蛋白质的抗体作免疫印迹分析(Α，Ε)。此为三个或更多个免疫印迹实验的代表。通过光密度分析法定量所示蛋白质的表达水平。分别用它们本身的总蛋白标准化P-DGFRP、p-EGFR和p-c-MET。用α -微管蛋白标准化TOGFR、EGFR和c-MET。数据表示为平均值土SEM。上标字母不同的平均值间有显著差异(Ρ〈0.05)。
[0038]图11显示了 MS275对培养的肾脏间质成纤维细胞中胶原1、a -SMA、纤连蛋白和乙酰基-组蛋白Η3表达的作用。在MS-275存在下(0-2.0 μ Μ)，血清饥饿的NRK-49F细胞与5%FBS温育24小时。制备细胞裂解物，用胶原1、a -SMA、纤连蛋白、或乙酰基-组蛋白Η3或GAPDH(A)的抗体作免疫印迹分析(A)。此为三个或更多个免疫印迹实验的代表。通过光密度分析法定量所示蛋白质的表达水平，并用GAPDH标准化(B、C、D)。数据表示为平均值土SEM。上标字母不同的平均值间有显著差异(Ρ〈0.05)。
[0039]图12显示了 MS275对培养的肾脏间质成纤维细胞增殖的作用。NRK-49F细胞血清饥饿24小时(对照)，然后在MS-275不存在或2.0 μ M(A)或0-2.0 μ M MS-275 (B-E)存在下，在含5%FBS(A-C)或2ng/ml TGF-β I的DMEM中温育48小时。相差照片(200X)显示MS-275对细胞增殖的作用(A)。通过计数细胞(B，D)或通过MTT试验(C，E)评估细胞增殖。数据表示为平均值土SEM。上标字母不同的平均值间有显著差异(P〈0.05)。
[0040]图13显示MS-275改善了 UUO损伤后的肾脏破坏作用。显微照片显示了各种处理后肾脏组织的PAS染色(A)。基于方法中描述的评分表，对形态改变评分(B)。数据表示为平均值土SEM(n=6)。上标字母不同的平均值间有显著差异(P〈0.05)。
[0041]图14显示MS-275降低梗阻肾脏中的Lcn2表达。输尿管梗阻后第7天收集肾脏组织。显微照片显示所示各种处理后Lcn2的免疫荧光染色(A)。计数10个随机肾皮质视野中的Lcn-2阳性细胞(200X)(平均值土SEM) (B)。上标字母不同的平均值间有显著差异(Ρ〈0.05)。
[0042]图15显示MS-275不诱导肾脏成纤维细胞的细胞死亡。在有或无2 μ M MS-275存在下，NRK-49F细胞与5%FBS培养36小时，或在有或无Η202250 μ M存在下培养2小时，收集细胞，进行免疫印迹分析活化的PARP和caspase-3。
[0043]图16显示TSA抑制I/II型HDAC阻止梗阻肾脏中UUO-诱导的T β RI表达和EGFR及TOGFR的磷酸化/表达。在输尿管梗阻后第7天收集肾脏组织(A-C)，细胞裂解物用T β RI或 GADPH ⑷、p-EGFR、EGFR 或 α -微管蛋白⑶、p-PDGFR β、PDGFR β 或 GADPH(C)的特异性抗体进行免疫印迹分析。显示了 3个或更多个实验的代表性免疫印迹。
【具体实施方式】
[0044]发明人经过广泛而深入的研究，出乎意料地发现特异性I型HDAC抑制剂不仅下调介导肾脏纤维化的生长因子受体，还能维持具有抗纤维化作用的受体的完整性，进而发现特异性I型HDAC抑制剂能够作为肾脏纤维化的治疗药物。在此基础上完成了本发明。
[0045]促纤维化受体[0046] 本文所用的术语“促纤维化受体”表示在纤维发生中表达或活性增加并在其中起至关重要作用的细胞因子受体和生长因子受体。在具体的实施方式中，所述促纤维化受体包括转化生长因子-β受体(Τβ R)、表皮生长因子受体(EGFR)和血小板衍生生长因子受体(PDGFR)。
[0047]HDAC 抑制剂
[0048]本文所用的术语“HDAC抑制剂”具有本领域普通技术人员通常理解的含义，即，能够抑制、阻遏、降低、减弱或破坏HDAC表达或活性的物质。类似地，本文所用的术语“I型HDAC抑制剂”表示能够特异性抑制、阻遏、降低、减弱或破坏I型HDAC的表达或活性，而对其它类型的HDAC没有影响的物质。
[0049]在具体的实施方式中，可选择的I型HDAC抑制剂有MS-275和SK7041。据报道用 MS-275(Anticancer Drugs,2011, 22(6), 494-9)和 SK7041(Kim, IA, Ii CancerRes.2006, 12:940-9)处理能有效杀伤肿瘤细胞。
[0050]在治疗肾脏纤维的优选实施方式中，所述I型HDAC抑制剂是MS-275。
[0051]此外，据报道，I型和II型HDAC有相反作用，II型HDAC可抑制心脏肥大而I型HDAC促进心脏肥大。因此，如果同时抑制I型和II型HDAC，会抵消抑制I型HDAC带来的治疗益处。所以，特异性的I型HDAC抑制剂会产生远高于泛HDAC抑制剂所产生的治疗益处。
[0052]MS-275
[0053]MS-275，也称为Entinostat，是一种合成的苯酰胺组蛋白抑制剂。MS-275是特异性针对I型HDAC的新一代HDAC抑制剂，其抑制I型HDAC中的HDACl和HDAC3。MS-275的结构上含有一个氨苯基，与其它HDAC抑制剂(如trichostatin A)的分子结构不同。分子式为C21H2tlN4O3,分子量为376.4085。MS-275对于皮肤T细胞淋巴瘤和其它恶性肿瘤也显示有作为抗肿瘤药物的治疗潜能[36，37]。
[0054]药学上可接受的盐
[0055]本文所用的术语“药学上可接受的盐”表示MS-275与酸(包括有机酸和无机酸)或碱(包括有机碱或无机碱)形成的盐，其中所述盐具备与MS-275相同或基本上相似的药理学活性，并且对施用对象无毒副作用。
[0056]本发明所用的材料与方法
[0057]化学试剂与抗体
[0058]p-STAT3、STAT3、p_Smad3、Smad3、p-ERKl/2、ERK1/2、ρ-EGF 受体、p-PDGF β 受体、PDGF^受体、细胞周期蛋白D1、细胞周期蛋白E、p-Met、乙酰基-组蛋白H3、切割的胱冬酶-3、切割的 PARP 抗体购自 Cell Signaling Technology (Danvers, MA)。Met、纤连蛋白、胶原 I (A2)、GAPDH, EGF 受体、HDACl、HDAC2、HDAC3、HDAC8 抗体购自 Santa Cruz。MS-275、a-SMA和α -微管蛋白抗体和其他化学试剂购自Sigma (St.Louis, MO)。lipocalin_2、TGF-β 1、TGF-β I 酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒购自 R&D systems (Minneapolis, MN)。HDAC 试验试剂盒购自 Upstate (Lake Placid, NY)。
[0059]细胞培养与处理
[0060]370C，5%C02和95%空气的气氛下，将NRK-49F细胞培养于Dulbecco改进的eagle培养基(DMEM) (Sigma-Aldrich, St.Louis, MO)，其含有 5% 胎牛血清(FBS)、0.5% 青霉素和链霉素。为检测MS-275对肾间质成纤维细胞活化的影响，将MS-275直接加入亚融合的NRK-49F细胞培养基中，后按图中指定的时间孵育。NRK-49F以0.5%FBS的DMEM培养基饥饿24小时，然后加入TGF-β I (2ng/ml), 24小时。
[0061]测定细胞增殖
[0062]细胞增殖效率以3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5_联苯基四唑鎗溴化物(MTT)方法检测，并计数细胞。对MTT检测，将MTT加入(终浓度，0.5mg/ml)培养基中，2小时。二甲基亚砜释放四唑，分光光度计在570nm波长处读数。细胞计数，不同干预后以胰蛋白酶处理细胞，0.4%台盼蓝染色。不同细胞计数使用显微镜下血球计数法完成。
[0063]UUO模型和MS-275处理
[0064]UUO 模型由雄性 C57 小黑鼠建立，重约 20_25g (Jackson Laboratory, BarHarbor，ME)，如以前实验所述[38]。简要地说，在腹部正中切口，左侧输尿管分离、结扎。为检测MS-275对UUO损伤诱导的肾脏纤维化的影响，将MS-275 (20mg/kg)溶于50 μ I DMSO中，UUO损伤后立即腹腔注射，每日相同剂量。对照组，只分离不结扎输尿管，每日注入等剂量的DMS0。7天后杀死小鼠，切取肾脏，进行mRNA、蛋白和组织学检测。
[0065]免疫荧光和免疫组化染色
[0066]免疫荧光和免疫组化染色如以往的常规方法进行[38]。肾组织固定于4.5%缓冲福尔马林中，脱水，石蜡切片包埋。肾脏普通组织学分析，使用PAS染色。免疫荧光染色，一抗乙酰基-组蛋白H3 (1:200)、a-SMA (1:200)和荧光二抗(1:200)用于检测荧光表达。每块肾组织的检查和评分(每种情况评估I次)，由肾脏病理科(L.Wang)双盲法检测得到。形态学损伤(上皮细胞坏死，管腔坏死和小管扩张)每块肾脏切3-4片，每片10-12视野，按下述比例定量分析:(none=0 ；<10%=1 ;11_25%=2 ;26_75%=3 ;和>75%=4)。为评估肾脏纤维化的程度，三色法马松染色按说明书完成(Sigma，St.Louis，MO)。胶原组织面积(蓝色区域)使用 Image Pro-Plus 软件(Media-Cybernetics, Silver Spring, MD, USA)定量分析，画线法，围绕阳性染色区域边界，每个显微镜视野的(400X)平均比率计算和绘制完成。
[0067]免疫印迹分析
[0068]NRK-49F细胞核组织切片的免疫印迹分析按通常的方法完成。灰度值分析以NIH软件计算完成(National Institutes of Health, Bethesda, MD)。
[0069]统计学分析
[0070]全部实验至少重复4次。图中的数值以均值土标准差代表。组间比较采用单因素方差分析(One-way analysis of variance, AN0VA)。多均数比较采用Tukey实验。两组间差异比较采用Student t-检验。图中统计学的差异性，以P〈0.05具有统计学差异。
[0071]本发明的优点:
[0072]本发明发现特异性I型HDAC抑制剂能够降低致纤维化生长因子受体的表达，但不影响具有抗纤维化作用的受体的表达，因此特异性I型HDAC抑制剂的抑制作用具有选择性，其副作用较低，是一种理想的肾脏纤维化治疗药物。
[0073]下面 结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如 Sambrook 等人,分子克隆:实验室手册(Cold Spring Harbor Laboratory Press,2001)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
[0074]本发明进行的所有动物研究均得到罗德岛医院科研动物照料和使用委员会的批准。
[0075]实施例1.MS-275抑制I型HDAC减弱UUO损伤后肾脏纤维化的发展
[0076]发明人研究了特异性的I型HDAC抑制剂一 MS-275在UUO小鼠诱导的肾脏纤维化进展中的作用。如图1所示，UUO损伤诱导胶原沉积，三色法马松染色显示注射MS-275导致胶原沉积明显减少。马松染色显示区域半定量分析显示与假手术组比较，梗阻组ECM蛋白沉积升高6倍。UUO后MS-275治疗导致肾脏纤维化下降90%，与UUO组比较。除此之外，MS-275也改善了损伤肾脏的形态学，如肾小管扩张改变(图13)。上述数据显示，I型HDAC在肾脏纤维化发展中起到重要作用；MS-275是有效的抗纤维化药物。
[0077]实施例2.MS-275抑制梗阻肾脏中纤连蛋白、胶原I和a -SMA的表达
[0078]肾间质成纤维细胞的活化和ECM蛋白过度堆积是启动慢性肾脏纤维化关键环节。因此，发明人检测了 MS-275对a -SMA(肾间质成纤维细胞活化标志物)、纤连蛋白、I型胶原(两种主要的梗阻性肾病ECM蛋白)表达的影响。图2A-D，a -SMA和I型胶原的水平，UUO组较假手术(Sham)组明显升高。MS-275干预大部分阻断了梗阻性肾病中a-SMA的表达，使I型胶原下降到基础水平。MS-275并不影响a-SMA和I型胶原在对照组中的表达。尽管纤连蛋白在Sham组中检测不到，UUO损伤后其表达上调。MS-275治疗后阻断了纤连蛋白表达。MS-275抑制HDAC的效率，由免疫印迹技术检测乙酰化组蛋白Η3表达来评估。图2Α, E显示乙酰化组蛋白Η3在Sham组肾脏中几乎检测不到，UUO损伤后其表达轻度下降，MS-275干预后上调了乙酰化组蛋白表达，5倍增长，梗阻性肾病与Sham组相比。总之，以上数据提示I型HDAC在肾间质成纤维细胞活化和UUO损伤后的ECM蛋白沉积作用中至关重要。
[0079]实施例3.MS-275抑制梗阻肾脏中T β RI表达和Smad3活化
[0080]TGF- β受体表达上调和Smad信号通路激活是肾脏纤维化的主要发生机制。
[0081]在三种TGF-β受体(TGF-β I型、II型、III型受体)中，TGF-β I型受体可以直接作用并使Smad3磷酸化，激活其下游信号。因此，发明人以免疫印迹技术检测了 TGF-β I型受体和Smad3磷酸化情况。图3A显示，单侧输尿管结扎诱导TGF- β I型受体呈时间依赖性增长，在手术后7天开始上调、14天达到高峰，持续至少21天。与其一致，输尿管结扎也诱导了 Smad3磷酸化。MS-275注射后阻断了上述反应(图3B、C、D)。Smad3在Sham组肾脏中仍大量表达，在UUO损伤组中，MS-275干预组与单纯UUO组其表达不受影响(图3B)。这些数据显示UUO损伤诱导了 TGF- β I型受体和Smad3磷酸化表达上调，阻断I型HDAC活性抑制了 TGF-β信号通路活化。
[0082]实施例4.MS-275抑制梗阻肾脏中PDGFR的磷酸化和表达
[0083]TOGFR在肾间质成纤维细胞和肾脏旁细胞中大量表达，在肾间质成纤维细胞和肾脏旁细胞转化为肌成纤维细胞中发挥重要作用。TOGFR总蛋白的基础水平而不是磷酸化TOGFR，在Sham组肾脏中可以检测到。UUO损伤诱导了 I3DGFR蛋白水平表达增加和其磷酸化，呈时间依赖性增加，UUO术后21天达到高峰(图4A、B、C)。注射MS-275完全阻断了PDGFR磷酸化并抑制了梗阻性 肾病I3DGFR表达下降到基础水平(图4D、E、F)。这些数据显示，PDGFR亦受I型HDAC调控。[0084]实施例5.MS-275抑制梗阻肾脏中EGFR和Lcn2的磷酸化和表达[0085]以前的研究显示，EGFR活化有助于延迟性肾脏缺血、肾切除、血管紧张素II注射损伤导致的肾脏纤维化发展。发明人的研究也显示，UUO损伤诱导了持续性总EGFR和磷酸化EGFR表达，其在肾脏纤维化中至关重要。在本文中，发明人检测了 MS-275是否影响UUO模型中EGFR的表达和活化。如图5A、B、C所示，MS-275注射阻断了 EGFR磷酸化，也明显降低梗阻性肾病中EGFR的表达。与此一致的是，MS-275降低了载脂蛋白2(也称为中性粒细胞明胶相关蛋白，Lcn2)的表达。Lcn2可调控肾脏纤维化，是EGFR下游调控基因(图5D)。免疫荧光显示Lcn2主要表达部位为UUO损伤后的小管上皮细胞，在Sham组中未检测到Lcn2表达(图14)。因此MS-275在抑制EGFR信号通路也是有效的。
[0086]实施例6.MS-275抑制上皮细胞细胞周期G2/M停滞和TGF- β I产生
[0087]有证据显示肾脏上皮细胞周期G2/M逃逸导致细胞转分化为显著的前纤维化细胞型，该类细胞可释放TGF-β I。发明人最近的研究显示肾脏上皮细胞G2/M逃逸由EGFR介导，MS-275 能够抑制 EGFR 表达和磷酸化(J Am Soc Nephrol, 23 (5):854-67, 2012) ? 因此，MS-275抑制上皮细胞周期逃逸是可能的。为了验证这种假设，发明人检测了肾小管丝氨酸10位点的磷酸化组蛋白H3，G2/M阶段细胞逃逸的标志物，使用免疫荧光染色和免疫组化分析。p-H3染色阳性的细胞仅仅偶尔被观察到少量表达在Sham组和MS-275单独治疗组，但在UUO损伤组明显表达上调。MS-275干预的UUO小鼠p_H3染色阳性细胞明显减少(图6A，B)。免疫印迹提示，P-H3在Sham组小鼠中几乎检测不到，在UUO损伤后其表达上调，MS-275干预后阻断了 p-H3表达(图6C)。因为小管细胞G2/M逃逸，增加了 TGF-β I产生，发明人通过ELISA方法，进一步检查了 MS-275对TGF-β I表达水平的影响。图6D显示，UUO损伤使TGF- β I产生增加，大部分被MS-275干预所抑制。这些数据显示，抑制HDAC能够降低TGF- β I产生，通过减轻损伤肾脏小管上皮细胞G2/M逃逸所致。
[0088]实施例7.MS-275不影响梗阻后肾脏中c_MET的磷酸化和表达
[0089]与前面所述3个受体相比，c-MET被配体(肝细胞生长因子)激活，可保护肾脏组织、抑制肾脏纤维化进展，已在很多肾脏病模型中被报道。因此，发明人进一步检查了 UUO损伤及抑制HDAC活性对C-MET表达和磷酸化的影响。
[0090]结果表明，总c-MET及磷酸化c-MET在UUO损伤后上调，并呈时间依赖性(图7A-C)。然而，MS-275干预并不影响c-MET磷酸化和表达(图7D、E、F)。因此，HDAC看来不参与UUO损伤肾脏c-MET的活化和表达。
[0091]实施例8.MS-275抑制梗阻后肾脏中STAT3和ERK1/2的磷酸化
[0092]STAT3和ERK1/2信号通路在梗阻性肾病被活化，并与肾脏纤维化进展和前纤维化细胞因子如TGF-β I释放有关。因为这些信号通路是很多生长因子和细胞因子受体活化的结果，并且MS-275治疗降低了 EGFR和TOGFR信号通路，因此推测抑制HDAC活性可能抑制STAT3和ERK1/2信号通路激活。为了验证这个假设，发明人检测了 MS-275对梗阻性肾病STAT3和ERK1/2磷酸化的影响。UUO损伤诱导了 STAT3磷酸化，并上调了总STAT3的表达。MS-275注射后完全阻断了 STAT3磷酸化并大部分阻断了其蛋白总体水平表达(图8A-C)。ERKI/2磷酸化和表达在UUO损伤后亦上调。MS-275干预使ERK1/2磷酸化降低到基础水平，但仅部分降低了总ERK1/2表达水平(图8Α，D, Ε)。这些数据提示HDAC也调控了 STAT3和ERKI/2磷酸化和表达。[0093]实施例9.MS-275阻断培养的肾脏间质成纤维细胞中TGF-β I诱导的胶原I和a-SMA及纤连蛋白的表达
[0094]TGF-β I能够诱导静止的肾间质成纤维细胞变型为肌成纤维细胞。为直接阐明I型HDAC在TGF-β I诱导的肾间质成纤维细胞活化中的作用，我们在有或无MS-275存在情况下，以TGF-β I刺激肾间质成纤维细胞(NRK-49F)。TGF-β I (2ng/ml)刺激NRK-49F 24小时，导致I型胶原和α平滑肌激动蛋白(α-SMA)和纤连蛋白的表达增加。MS-275以剂量依赖性方式抑制了上述三种蛋白表达(图9A-C)，提示MS-275可抑制肾间质成纤维细胞活化。MS-275以剂量依赖性方式上调乙酰化组蛋白H3(图9A，D)。与体内实验一致的，MS-275抑制了梗阻性肾病中TGF-β RI和Smad3磷酸化，而Smad3表达不受药物影响(图9E)。这些数据，连同MS-275对TGF-β RI和a -SMA和细胞外基质蛋白在损伤性肾脏中的抑制效果，提示I型HDAC在肾间质成纤维细胞活化和肾间质纤维化中起关键作用。
[0095]实施例10.MS-275阻断血清诱导的H)GFR、EGFR，而非c-MET的磷酸化和表达并激活培养的肾脏间质成纤维细胞
[0096]除了 TGF-β外，在肾间质纤维化中，其他细胞因子也被释放到肾间质，刺激受体活化和诱导肾间质成纤维细胞转分化为肌成纤维细胞。因为血清中包括了一系列复杂的细胞因子，能够刺激肾间质成纤维细胞活化，发明人进一步检测了 MS-275在5%血清培养基时对生长因子受体(EGFR、H)GFR、c-Met)磷酸化和表达的影响。如图10所示，MS-275治疗以剂量依赖性抑制了 EGFR和TOGFR的磷酸化和表达。而c-Met磷酸化和表达不受药物影响(图10A-D)。我们也观察了 MS-275可抑制STAT3和ERKI/2磷酸化(图10E)。
[0097]除此之外，发明人检查了 HDAC对肾间质成纤维细胞活化的影响。与体内实验观察的一致，MS-275治疗抑制了肾间质成纤维细胞活化，在培养的肾间质成纤维细胞中抑制了I型胶原、a -SMA和纤连蛋白表达(图11Α，B)。MS-275抑制了 HDAC，增加了乙酰化组蛋白Η3的作用(图11Α，D)。总之，这些数据提示I型HDAC是肾间质成纤维细胞转分化为肌成纤维细胞，并且MS-275在抑制肾间质成纤维细胞活化是有效的。
[0098]实施例11.MS275抑制血清和TGF- β 1-刺激的肾脏间质成纤维细胞增殖
[0099]肾间质成纤维细胞增殖有助于间质纤维化进展。为确定I型HDAC在这个过程中的作用，MS-275直接加入5%FBS的培养基，或血清饥饿细胞以TGF-β I (2ng/ml)刺激。细胞增殖评估通过MTT技术或计算细胞数目完成。MS-275刺激细胞24小时明显降低了血清或TGF-β I引起的肾间质成纤维细胞增殖(图12A-E)。MS-275的抑制效应以剂量依赖性增强，0.5 μ M起效，在2 μ M达到最高抑制效果。明显的，MS-275并不抑制细胞增殖，而不诱导细胞死亡。因为MS-2752 μ M处理并不诱导切割PARP或切割胱冬酶3表达，2个凋亡指标。作为阳性对照，切割PARP或切割胱冬酶3在H2O2暴露的同型细胞3小时可检测到表达(图 15)。
[0100]实施例12.给予TSA导致UUO损伤后肾脏中的T β RI, EGFR和TOGFR下调
[0101]发明人最近的研究提示，注射TSA，一种泛HDAC抑制剂，同时抑制I型和II型HDAC活性，也会抑制肾间质成纤维细胞活化和增殖，减轻UUO诱导的肾脏纤维化的进展(Am JPhysiol Renal Physiol.2009; 297:F996_F1005)。发明人还进一步检查了 TSA 对 3 种前纤维化生长因子受体表达和磷酸化的影响，如以上描述的。与MS-275对这些受体的影响一致，TSA干预也导致了这3种受体的下调，抑制了 EGFR、PDGFR的磷酸化(图16)。TSA和MS-275相似的抑制效果，提示I型而不是II型HDAC在介导前纤维化生长因子下调方面起
基本作用。
[0102]在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
[0103]参考文献
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【权利要求】
1.1型HDAC抑制剂的用途，其特征在于，用于制备抑制促纤维化受体的组合物。
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述促纤维化受体选自下组:Ti3R1、EGFR和PDGFR。
3.如权利要求1或2所述的用途，其特征在于，所述组合物还抑制Smad-3、STAT3和ERK172途径的活化；和/或 所述组合物不影响c-Met的表达或磷酸化。
4.如权利要求1或2所述的用途，其特征在于，所述I型HDAC抑制剂是MS-275或其药学上可接受的盐。
5.如权利要求1或2所述的用途，其特征在于，所述药物组合物用于抑制肾脏纤维化。
6.1型HDAC抑制剂的用途，其特征在于，用于制备治疗或预防肾脏纤维化的药物。
7.如权利要求6所述的用途，其特征在于，所述I型HDAC抑制剂包括MS-275或其药学上可接受的盐。
8.1型HDAC抑制剂在抑制T β R1、EGFR和TOGFR中的用途。
9.如权利要求8所述的用途，其特征在于，所述I型HDAC抑制剂还抑制Smad-3、STAT3和erk1/2途径的活化；和/或 所述I型HDAC抑制剂不影响C-Met的表达或磷酸化；和/或 所述I型HDAC抑制剂还抑制肾脏纤维化。
10.一种体外非治疗性的抑制肾脏细胞纤维化的方法，其特征在于，包括步骤:在I型HDAC抑制剂存在下，培养肾细胞，从而抑制肾脏细胞的纤维化； 较佳地，所述I型HDAC抑制剂是MS-275或其药学上可接受的盐。
【文档编号】A61K45/00GK103585630SQ201210293429
【公开日】2014年2月19日 申请日期:2012年8月16日 优先权日:2012年8月16日
【发明者】庄守纲 申请人:上海市东方医院