专利名称：一种猫爪草提取物在制备抗肺癌的药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于医药领域，具体涉及ー种猫爪草提取物在制备抗肺癌的药物中的应用。
背景技术：
肺癌是临床上最常见的恶性肿瘤之一，我国肺癌发病率在城市中占常见恶性肿瘤的首位，在农村占第三位。肺癌的恶性程度高，生物学特性复杂，且预后差，目前治疗是以手术、化疗、放疗为主，西医治疗在缩小瘤体方面有一定的优势，而中医治疗除具有直接抗肿瘤的作用外，还可以配合放疗和化疗，起到增效减毒的作用，增强患者对放疗和化疗的耐受性，提高生存质量，对某些晩期肺癌无法手术者，可服抗癌中药延长生存期，因此，综合治疗 是首选。中药猫爪草(Radix Ranunculus ternati)系毛茛科植物小毛茛(Ranunculusternatus Thunb)的干燥块根，别名三散草(浙江)、猫爪儿草(河南)、猫爪子(河南)、鸭脚板(安黴)、金花草(广西)，是20世纪50年代河南信阳地区新发现的一种草药，我国各省区均有分布，文字记载首见于《中药材手册》，《中华人民共和国药典》自1977年版开始收载。猫爪草性温，味甘、辛，入肝、肺经，具有清热解毒、消肿散结、止咳祛痰等功效，临床用于治疗肺結核、淋巴结结核、咽喉炎、疟疾等症。如中国专利申请CN 200810121086. 8公开了一种运用大孔树脂制备猫爪草总苷提取物的方法及用途。它是在粉碎的猫爪草药材或猫爪草饮片中，加入6 15倍体积百分比浓度为10% -80%的こ醇，加热回流提取，过滤，合并提取液，减压回收こ醇，提取液通过填充有大孔树脂的层析柱，用水洗涤树脂，水洗脱液弃去；用含体积百分比浓度为20 95%含水こ醇洗脱，流速为2 4BV/H，こ醇洗脱液减压浓缩至相对密度为I. I I. 25，减压或喷雾干燥，得猫爪草总苷。猫爪草总苷含量不低于20%、猫爪草苷D含量不低于1.0%重量的猫爪草总苷提取物，用于治疗结核病。近年来，猫爪草多与其它多味中药材一起使用，在中医临床上用于治疗癌症，对肺癌、淋巴癌、甲状腺瘤、乳腺肿瘤等疾病已显示出较好的治疗效果。如中国专利ZL200810195060. 8公开了ー种抗肺癌A549细胞增殖的中药提取物，它是由原料药猫爪草、金荞麦、鱼腥草、仙鹤草、冬瓜子、山茨燕、苏木、红花、法半夏、胆南星、沙參、玉竹、麦冬按ー定重量配比制成；其制法是首先将上述13味原料药加水煎煮，过滤收集提取液，浓缩得全方提取液I ;然后取提取液I用石油醚萃取，得精制提取液II ;最后将精制提取液II经大孔树脂柱富集、蒸馏水洗脱后用こ醇洗脱，收集洗脱液浓缩至IOg生药/ml，即得中药提取物，经药效学试验结果表明该中药提取物对肺癌A549细胞的増殖有显着的抑制作用。其仅是针对13味药材复配对抑制肺癌A549细胞的増殖的作用的研究，没有涉及单味猫爪草的药理研究。目前，有关猫爪草的化学成分的研究报道不多，已有的研究资料表明，猫爪草主要含氨基酸、有机酸及糖类。近十年来，国内许多学者对猫爪草脂溶性成分进行了较深入的研究，分离到包括酯类、脂肪酸、留醇及苷类等的十多种单体成分。但单味猫爪草已有的药理作用研究资料主要集中在抗結核菌及其它菌方面。有关单味猫爪草抗肿瘤方面的研究资料并不多，至今尚未见猫爪草有效成分抗肺癌作用的报道。猫爪草的药用历史较短，虽然近年来由干与其它多味中药材复配具有较好的抗肿瘤活性倍受人们关注，但仍存在不少问题(I)猫爪草资源广泛，但开发利用度不够，制剂生产未成規模；(2)猫爪草的有效成分不明确，活性部位也不明确，故应针对猫爪草药理作用着重进行其有效部位及有效成分的筛选，以期为猫爪草的进ー步开发利用提供科学依据。
发明内容
本发明的目的是提供一种猫爪草提取物在制备抗肺癌药物中的应用。该提取物的主要成份为总皂苷。一种猫爪草提取物在制备抗肺癌的药物中的应用。所述的抗肺癌的药物包括用于 预防和/或治疗肺癌的药物。所述的猫爪草提取物中含总皂苷以人參皂苷Rgl计，重量百分含量为20% 80%。所述的猫爪草提取物的制备方法，包括将干燥的猫爪草粉碎，用乙醇水溶液加热回流提取，醇提液回收こ醇后用石油醚萃取，水层以水饱和的正丁醇萃取，正丁醇萃取液再用氢氧化钠水溶液萃取，正丁醇层浓缩至浸膏，干燥至无溶剂残留，得猫爪草提取物。为了更好的提取猫爪草中的人參皂苷Rgl等皂苷及其它抗癌成分，优选所述的こ醇水溶液中こ醇的体积百分浓度为50 % 95 %，进ー步优选こ醇的体积百分浓度为95%。用こ醇水溶液加热回流提取的次数为至少3次，毎次こ醇水溶液的用量为猫爪草重量的4倍量 10倍量(进ー步优选为5倍量 8倍量)，每次提取时间为I小吋 4小时。石油醚萃取的条件为在50°C 100°C至少萃取3次，每次萃取时间为I小吋 4小吋。以水饱和的正丁醇萃取的次数为4次 8次。所述的氢氧化钠水溶液的浓度为0. lmol/L lmol/L。用氢氧化钠水溶液萃取的次数为2次 5次。所述的猫爪草提取物可制成片剂、胶囊剂、颗粒剂、ロ服液等中的任何ー种剂型。上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。本发明制备猫爪草提取物，方法简单、成本低廉。实验证明，本发明的猫爪草提取物能够有效地抑制人肺癌细胞的生长，如人肺腺癌细胞A549、人大细胞肺癌细胞NCI-H460等，对正常细胞毒性低，高效低毒，可用于制备治疗抗肺癌药物的用途。因此本发明所提供的猫爪草提取物对制备抗肺癌药物具有重要意义。
图I为RPMI1640培养液(阴性对照)对人肺腺癌细胞A549细胞体外增殖的影响的显微镜下图片；图2为100 ii g/ml猫爪草提取物对人肺腺癌细胞A549细胞体外增殖的影响的显微镜下图片；图3为RPMI1640培养液(阴性对照)对人大细胞肺癌细胞NCI-H460细胞体外增殖的影响的显微镜下图片；图4为100 ii g/ml猫爪草提取物对人大细胞肺癌细胞NCI-H460细胞体外增殖的影响的显微镜下图片；图5为RPMI1640培养液(阴性对照)对人肺腺癌细胞A549细胞凋亡的影响图片;图6为50 ii g/ml猫爪草提取物对人肺腺癌细胞A549细胞凋亡的影响图片；
图7为RPMI1640培养液(阴性对照)对人肺腺癌细胞A549细胞周期的影响图片(横坐标代表DNA含量，纵坐标代表计数细胞数，C代表GcZG1期细胞数量，D代表G2/M期细胞数量，E代表S期细胞数量)；图8为50 ii g/ml猫爪草提取物对人肺腺癌细胞A549细胞周期的影响图片(横坐标代表DNA含量，纵坐标代表计数细胞数，C代表GcZG1期细胞数量，D代表G2/M期细胞数量，E代表S期细胞数量)。
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。水饱和的正丁醇将正丁醇和蒸馏水混合(混合比例为I : 1，体积比)，振摇，混匀，放置过夜(或利用超声，超声时间为lOmin，这样不必过夜)。得到的混合液分层，上层为水饱和的正丁醇，下层为正丁醇的饱和水溶液。实施例I、猫爪草提取物的制备精密称取干燥的猫爪草5000g，粉碎成粗颗粒(粒径200目)，用体积百分浓度为95%こ醇水溶液加热回流提取4次，每次こ醇水溶液的用量为猫爪草重量的8倍量，每次提取2h，滤过，醇提液回收こ醇后得到提取物，提取物加温水至Ig生药/ml，加入石油醚在50°C萃取4次，毎次石油醚的体积与加温水后提取物的体积比为I : 1，每次萃取4小吋，石油醚萃取液回收石油醚，得石油醚提取物。剰余水层用水饱和的正丁醇萃取5次，正丁醇萃取液用0. lmol/L NaOH水溶液萃取2次，正丁醇层浓缩至浸膏，置真空干燥箱干燥至无溶剂残留，得猫爪草提取物。该猫爪草提取物含总皂苷以人參皂苷Rgl计，重量百分含量在80%。实施例2、3H_TdR掺入法观察猫爪草提取物对A549、NCI-H460细胞增殖的影响I、实验材料(I) RPMI1640培养液250ml/瓶，吉诺生物医药技术有限公司生产，批号20110720。(2)0. 25% (质量百分比)胰蛋白酶(Trypsin):含0.02% (质量百分比)こニ胺四こ酸(EDTA)，IOOml/瓶，吉诺生物医药技术有限公司生产，批号11090901。(3)超级新生牛血清(即胎牛血清，FCS) :200ml/瓶，杭州四季青生物工程材料有限公司生产，批号080304。
(4)氚-胸腺嘧啶核苷(3H-TdR):中国科学院上海应用物理研究所生产，浓度lmci/ml,比度 4ci/mM,批号 100430,使用前用 Hank' s 液配成 20 u ci/ml。(5)96孔平底培养板美国Costar公司生产；(6)A549细胞株(人肺腺癌细胞)浙江省肿瘤医院肿瘤研究所提供，液氮保存。NCI-H460细胞株(人大细胞肺癌)浙江省医学科学院药物所提供，液氮保存。2、实验仪器(I) ニ氧化碳培养箱3165型,美国Forma公司生产。(2)液闪仪2050型，PACKARD公司生产。
(3)XS-24细胞收集仪浙江绍兴坡圹医疗器械厂生产。(4)GS_6R 离心机Beckman 公司生产。(5)HR40-II-A2医用净化工作台A2型，30%外排，70循环，青岛海尔特种电器有
限公司生产。(6)BS210S 电子天平Sartorius 公司生产。(7) CK40-F200倒置显微镜日本OLYMPUS公司生产。(8)YXQ-208SD电热蒸汽灭菌器嘉兴市中新医疗仪器有限公司生产。3、实验方法及结果取2种对数生长期人肺癌细胞株(A549、NCI-H460)，按肿瘤药敏试验方法制成5X IO4个细胞/ml浓度单细胞悬液(贴壁细胞株用质量百分比0. 1%胰蛋白酶消化后配置)，取IOOiU分别加至96孔平底培养板中，37°C、5% (体积分数)CO2培养箱培养24h后分别加入不同浓度(6. 25 200 u g/ml)的实施例I中的猫爪草提取物100 yl (溶剂为含10% FCS的RPMI1640培养液)，每ー药物浓度做3个复孔，同时作含10% (质量百分比)FCS (胎牛血清)的培养液对照，37°C、5% CO2培养箱培养48h后分别加入含0. 3 u Ci3H-TdR的培养液50 u 1，继续培养16h，常规收集细胞，測定每个样品毎分钟脉冲数(cpm)，用三孔的平均cpm计算出不同浓度猫爪草提取物对2种人肺癌细胞株的抑制率。按下列公式计算细胞生长抑制率细胞生长抑制率=(I-实验组平均cpm值/对照组平均cpm值)X 100%。结果见表I 表2和图I 图4。表I :猫爪草提取物对A549细胞体外增殖的抑制率)
组另1j浓度((ig/ml)抑制率(％)
6.252.5 ±0.3
12.53.9+ 1.5^ ^^2513.0 ±0.6
猫爪草提取物--
_50__41.9 ±0.8_
10067.5 + 1.0
_[200I:99.3 ±0.3表2 :猫爪草提取物对NCI-H460细胞体外增殖的抑制率)
权利要求
1.一种猫爪草提取物的应用，其特征在于，所述的猫爪草提取物在制备抗肺癌的药物中的应用。
2.根据权利要求I所述的应用，其特征在于，所述的抗肺癌的药物包括用于预防和/或治疗肺癌的药物。
3.根据权利要求I所述的应用，其特征在于，所述的猫爪草提取物中人参皂苷Rgl的重量百分含量为20% 80%。
4.根据权利要求I或3所述的应用，其特征在于，所述的猫爪草提取物的制备方法，包括 将干燥的猫爪草粉碎，用乙醇水溶液加热回流提取，醇提液回收乙醇后用石油醚萃取，水层以水饱和的正丁醇萃取，正丁醇萃取液再用氢氧化钠水溶液萃取，正丁醇层浓缩至浸膏，干燥至无溶剂残留，得猫爪草提取物。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的乙醇水溶液的体积百分浓度为50% 95%。
6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，用乙醇水溶液加热回流提取的次数为至少3次，每次乙醇水溶液的用量为猫爪草重量的4倍量 10倍量，每次提取时间为I小时 4小时。
7.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，石油醚萃取的条件为在50°C 100°C至少萃取3次,每次萃取时间为I小时 4小时。
8.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，以水饱和的正丁醇萃取的次数为4次 8次。
9.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的氢氧化钠水溶液的浓度为O.Imol/L lmol/L0
10.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，用氢氧化钠水溶液萃取的次数为2次 5次。
全文摘要
本发明公开了一种猫爪草提取物在制备抗肺癌的药物中的应用，所述的抗肺癌药物包括用于预防和/或治疗肺癌的药物。本发明证实猫爪草提取物具有较好的抗肺癌作用，能够有效地抑制人肺癌细胞的生长，如人肺腺癌细胞A549、人大细胞肺癌细胞NCI-H460等，对正常细胞毒性低，高效低毒，可用于制备治疗抗肺癌药物的用途。
文档编号A61K36/71GK102805768SQ20121029997
公开日2012年12月5日 申请日期2012年8月22日 优先权日2012年8月22日
发明者童晔玲, 杨锋, 戴关海, 任泽明 申请人:浙江省中医药研究院