使用甲酰-甘氨酸生成酶(fge)对多种硫酸酯酶缺乏症和其它病症进行诊断和治疗的制作方法

专利名称：使用甲酰-甘氨酸生成酶(fge)对多种硫酸酯酶缺乏症和其它病症进行诊断和治疗的制作方法
使用甲酰-甘氨酸生成酶(FGE)对多种硫酸酯酶缺乏症和其它病症进行诊断和治疗
本申请是申请号200480006490. 0，申请日2004年02月10日的同名申请的分案申请。发明领域
此发明涉及诊断和治疗多种硫酸酯酶缺乏症(MSD)以及其它硫酸酯酶缺乏症的方法和组合物。更特异地，本发明涉及被分离的调节硫酸酯酶翻译后修饰的分子。这类修饰为硫酸酯酶的正确功能所必需。
发明背景
硫酸酯酶是高度保守的基因家族的成员，共享广泛的序列同源性(Franco，B. 等，Cell，1995，81:15-25;Parenti, G.等，Curr. Opin. Gen. Dev.，1997，7:386-391)，高度的结构类似性(Bond, C. S.等，Structure, 1997，5:277-289; Lukatela, G.等，Biochemistry, 1998, 37:3654-64)，和独特的为硫酸酯断裂所必需的翻译后修饰(Schmi dt, B.等，Ce 11， 1995，82:271-278; Selmer, T.等，Eur. J. Biochem.，1996，238:341-345)。翻译后修饰包括对保守的半胱氨酸(在真核细胞中)或丝氨酸(在某些原核细胞中)残基在Ce处的氧化，得到L-Ca-甲酰甘氨酸(也叫做FGly，2-氨基-3-氧代丙酸)，其中醛基代替了侧链的硫代甲基基团。醛基是硫酸酯酶催化位点的必需部分，很可能作为醛水合物起作用。成对的羟基之一在硫酸酯断裂时接受硫酸基团，导致共价硫酸化的酶中间物的形成。其它羟基是随后的硫酸基团消去和醛基再生所需要的。此修饰在初生硫酸酯酶多肽输入期间或间隔很短时间之后发生于内质网，并被围绕着将被修饰的半胱氨酸(或丝氨酸)残基的短线性序列所调控。此高度保守序列是六肽L/V-C(S)-X-P-S-R(SEQ ID NO:32)，出现在所有真核细胞硫酸酯酶的N末端区域,并最频繁地在残基X上携带轻基或硫轻基(Dierks, T.等，Proc. Natl. Acad. Sc1. U. S. A.，1997，94:11963-11968)。
迄今为止，已在人体中鉴别出13个硫酸酯酶基因。它们编码具有不同底物专一性和亚细胞定位如溶酶体、高尔基体和内质网定位的酶。这些基因中的四种ARSC，ARSD, ARSEjPARSF (分别编码芳基硫酸酯酶C，D，E和F)，位于相同的染色体区域(Xp22. 3)内。 它们共享显著的序列类似性和几乎相同的基因组组织方式，说明它们来源于在进化中近来才发生的复制事件(Franco B 等，Cell, 1995，81:15-25;Meroni G 等，Hum Mol Genet, 1996,5:423-31)。
由单独硫酸酯酶活性的缺乏所引起的至少八种人单基因疾病的鉴定，强调了硫酸酯酶在人体代谢中的重要性。这些病症中的大部分是溶酶体存贮病，其中，表型结果源于被储存物质的类型和组织分布。在它们中，有五种不同类型的因硫酸酯酶对粘多糖分解代谢作用的缺乏而引起的粘多糖病(MPS类型II, IIIA, HID, IVA和VI) (Neufeld和 Muenzer，2001，The mucopolysaccharidoses,In The Metabolic and Molecular Bases of Inherited Disease，C. R. Scriverj A. L. Beaudetj W. S. Sly, D. Valle, B. Childs, K. W. Kinzler 和 B. Vogelstein 编，New Yor k:Mc Graw-Hi ll，pp. 3421-3452)，和以脑硫脂在中枢和外周神经系统中储存并引起严重和渐进性神经退化为特征的异常染性脑白质营养不良(MLD)。两种另外的人类疾病由非溶酶体硫酸酯酶缺乏引起。这些包括X-连锁的鱼鳞病，因类固醇硫酸酯酶(STS/ARSC)缺乏而引起的皮肤病；和点状软骨发育不全，由芳基硫酸酯酶E(ARSE)缺乏引起的影响骨和软骨的疾病。硫酸酯酶也牵涉到药物诱导的人畸形综合症，例如Warfarin胚胎病，由怀孕期间在宫内暴露于杀鼠灵而抑制ARSE活性所引起。
在引起人兴趣的人类单基因疾病中，多种硫酸酯酶缺乏症(MSD)是所有硫酸酯酶活性同时有缺陷。因此，此严重的多系统性疾病的表型结合了在单独硫酸酯酶缺乏中所观察到的特征。来自多种硫酸酯酶缺乏症患者的细胞即使以编码人硫酸酯酶的cDNAs转染之后也缺乏硫酸酯酶活性，暗示所有硫酸酯酶活性所需要的普遍机制的存在(Rommerskirch 和 von Figura, Proc. Natl. Acad. Sc1.，USA, 1992，89:2561-2565)。硫酸酯酶的翻译后修饰被发现在多种硫酸酯酶缺乏症患者中有缺陷，暗示此疾病由基因的突变所引起，该基因牵涉到半胱氨酸至甲酰甘氨酸的转化机制(Schmidt，B.等，Cell，1995，82:271-278)。尽管存在强烈的生物学和医学兴趣，以鉴别此基因为目标的努力却被多种硫酸酯酶缺乏症患者的稀有性和随之带来的缺乏合适的家族病例而无法完成遗传图谱绘制所妨碍。
发明概述
本发明提供诊断和治疗多种硫酸酯酶缺乏症(MIM 272200)及治疗其它硫酸酯酶缺乏症的方法和组合物。更特异地，已鉴别出编码甲酰甘氨酸生成酶(FGE)的基因，此酶负责发生于硫酸酯酶的独特的翻译后修饰(形成L-Ca-甲酰甘氨酸；也叫做FGly和/或2-氨基-3-氧代丙酸)，该翻译后修饰为硫酸酯酶功能所必需。已发现，出乎意料的是FGE基因中的突变导致受试者中的多种硫酸酯酶缺乏症(MSD)的发展。也发现，出乎意料的是FGE 增强了硫酸酯酶的活性，包括但不限于，艾杜糖醛酸2-硫酸酯酶，硫酸胺酶，N-乙酰半乳糖胺6-硫酸酯酶，N-乙酰葡萄糖胺6-硫酸酯酶，芳基硫酸酯酶A，芳基硫酸酯酶B，芳基硫酸酯酶C，芳基硫酸酯酶D，芳基硫酸酯酶E，芳基硫酸酯酶F，芳基硫酸酯酶G，HSulf-1 ，HSulf-2, HSulf-3, HSulf-4, HSulf-5,和HSulf-6。考虑到这些发现，本发明的分子可用于诊断和治疗多种硫酸酯酶缺乏症以及其它硫酸酯酶缺乏症。
在多种硫酸酯酶缺乏症的诊断中应用本发明的分子的方法被提供。
另外，为调节硫酸酯酶上FGly形成的目的而在体内或体外应用这些分子的方法， 治疗与这种修饰相关的病症的方法，和对制备治疗多种硫酸酯酶缺乏症及其它硫酸酯酶缺乏症的药学制剂有用的组合物，也被提供。
本发明因此在几个方面包括调节硫酸酯酶上FGly形成的多肽，分离的编码那些多肽的核酸，它们的功能修饰物和变体，它们的有用的片段，以及与其相关的治疗、诊断和研究的方法、组合物与工具。
根据本发明的一个方面，选自下列的分离的核酸分子被提供(a)与SEQ ID NO:1 所示的核苷酸序列所组成的分子在严格条件下杂交的核酸分子，该核酸分子编码具有 Ca-甲酰甘氨酸生成活性的甲酰甘氨酸生成酶(FGE) ；(b)与(a)的核酸分子在密码子序列上因遗传密码简并性而有所区别的核酸分子；和(c) (a)或(b)的互补链。在一定的实施方案中，分尚的核酸分子包括SEQ ID NO:1所不的核苷酸序列。在某些实施方案中，分尚的核酸分子由SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列或其片段组成。
本发明的另一方面提供分离的选自下列的核酸分子(a)SEQ ID N0:1所示的核苷酸序列的独特(unique)片段，和(b) (a)的互补链，条件是(a)中的独特片段包括了不与某些序列相同的连续核苷酸序列，所述某些序列选自(I)与SEQ ID NO. 4和/或SEQ ID NO. 4的核苷酸20-1141相同的序列，和(2) (I)中核酸分子的互补链。在任何前述的实施方案中，互补链指全长互补链。
在一个实施方案中，连续核苷酸序列选自(I)至少两个不与序列组完全相同的连续核苷酸，(2)至少三个不与序列组完全相同的连续核苷酸，(3)至少四个不与序列组完全相同的连续核苷酸，(4)至少五个不与序列组完全相同的连续核苷酸，(5)至少六个不与序列组完全相同的连续核苷酸，和(6)至少七个不与序列组完全相同的连续核苷酸。
在另一实施方案中，片段大小选自至少8个核苷酸，10个核苷酸，12个核苷酸，14个核苷酸，16个核苷酸，18个核苷酸，20个核苷酸，22个核苷酸，24个核苷酸，26 个核苷酸，28个核苷酸，30个核苷酸，40个核苷酸，50个核苷酸，75个核苷酸，100个核苷酸，200个核苷酸，1000个核苷酸和其间的每一整数长度。
根据又一方面，本发明提供包含上述核酸分子的表达载体和以该表达载体转化或转染的宿主细胞。
根据又一方面，本发明提供表达内源FGE基因的活化形式的细胞。在一个实施方案中，内源FGE基因的活化通过同源重组发生。
根据本发明又一方面，分离的多肽被提供。分离的多肽被前述的本发明核酸分子所编码。在某些实施方案中，分离的多肽被SEQ ID NO:1的核酸编码，产生出具有SEQ ID N0:2序列和Ca-甲酰甘氨酸生成活性的多肽。在其它的实施方案中，分离的多肽也许是前述的片段或变体，其长度足以代表人基因组中独特序列并且是具有Ca-甲酰甘氨酸生成活性的多肽，条件是该片段包括不与任何被具有SEQ ID NO. 4的核酸序列所编码的序列相同的连续氨基酸的序列。在另一实施方案中，上述多肽分子的免疫源性片段被提供。免疫源性片段也许具有也许不具有Ca-甲酰甘氨酸生成活性。
根据本发明又一方面，分离的结合多肽被提供，其选择性地与前述的本发明核酸分子所编码的多肽结合。优选分离的结合多肽选择性地结合包含SEQ ID N0:2序列的多肽、其片段或属于分离的具有Ca-甲酰甘氨酸生成活性的多肽家族而在本文其它部分所述的多肽。在优选的实施方案中，分离的结合多肽包括抗体和抗体片段(如Fab，F (ab) 2，Fd和包括了与FGE多肽选择性结合的CDR3区域的抗体片段)。在一定的实施方案中，抗体是人抗体。在某些实施方案中，抗体是单克隆抗体。在某一实施方案中，抗体是多克隆抗血清。 在进一步的实施方案中，抗体是人源化的。在更进一步的实施方案中，抗体是嵌合的。
根据本发明又一方面，具有Ca-甲酰甘氨酸生成活性的分离的多肽的家族被提供。每一所述多肽从氨基端到羧基端包含(a)氨基端亚结构域I ;亚结构域2 ;包含35到 45个氨基酸的羧基端亚结构域3，而其中亚结构域3与选自SEQ ID NO. 2，5，46，48，50，52， 54，56，58，60，62，64，66，68，70，72，74，76，和78的多肽的亚结构域3具有至少约75%的同源性和大致相同的长度。在重要的实施方案中，亚结构域2含有120到140个氨基酸。在进一步的重要实施方案中，亚结构域2中至少5%的氨基酸是色氨酸。在某些实施方案中， 亚结构域 2 与选自 SEQ ID NO. 2，5，46，48，50，52，54，56，58，60，62，64 ，66，68，70，72，74，76 ，和78的多肽的结构域2之间具有至少50%的同源性。在一定的实施方案中，每一多肽的亚结构域 3 与选自 SEQ ID NO. 2，5，46，48，50，52，54，56，58，60，62，64，66，68，70，72，74，76，和78的多肽的亚结构域3具有介于约80%和约100%之间的同源性。
根据本发明进一步的方面，用于测定某一受试者中的FGE表达水平的方法被提供。方法包括测量来自某一受试者的测试样本中的FGE表达以确定FGE在受试者中的表达水平。在一定的实施方案中，测得的测试样本中的FGE表达与对照样本(含有已知FGE表达水平)中的FGE表达进行比较。表达被定义成FGE mRNA表达，FGE多肽表达，或如本文其它部分所定义的FGE的Ca-甲酰甘氨酸生成活性。多种方法能用于测量表达。本发明优选的实施方案包括用于测量mRNA表达的PCR和RNA印迹，作为测量FGE多肽表达的试剂的FGE 单克隆抗体或FGE多克隆抗血清，以及测量FGE Ca-甲酰甘氨酸生成活性的方法。
在一定的实施方案中，测试样本例如活检样本和生物液体如血液被用作测试样本。FGE在某一受试者的测试样本中的表达与对照样本中的FGE表达比较。
根据本发明另一方面，用于鉴别在调节分子的Ca-甲酰甘氨酸生成活性中有用的物质的方法被提供。方法包括(a)将具有Ca-甲酰甘氨酸生成活性的分子与候选物质接触，(b)测量该分子的Ca-甲酰甘氨酸生成活性，和(c)将测得的该分子Ca-甲酰甘氨酸生成活性与对照进行比较以确定候选物质是否调节分子的Ca-甲酰甘氨酸生成活性，其中该分子是具有选自 SEQ ID NO:1, 3，4，45，47, 49，51，53，55，57，59，61，63，65，67，69，71，73， 75，77，和80-87的核苷酸序列的核酸分子，或其表达产物(例如，具有选自SEQ ID NO. 2, 5 ，46，48，50, 52，54，56，58，60, 62，64，66，68，70, 72，74，76，和 78 的序列的肽)。在一定的实施方案中，对照是在缺乏候选物质的条件下测得的该分子的Ca-甲酰甘氨酸生成活性。
根据本发明又一方面，在受试者中诊断多种硫酸酯酶缺乏症的方法被提供。方法包括将生物样本与试剂接触，所述生物样本来自被怀疑具有多种硫酸酯酶缺乏症的受试者，所述试剂特异结合选自下面的分子(i)具有SEQ ID NO: 1，3，或4核苷酸序列的FGE 核酸分子，(ii)核酸分子(i)的表达产物，或(iii) ( )的表达产物的片段；以及测量结合的试剂数量并由此确定所述核酸分子或其表达产物的表达是否异常，异常表达表明受试者患有多种硫酸酯酶缺乏症。
根据本发明又一方面，用于对特征为核酸分子或其表达产物的异常表达的病症进行诊断的方法被提供。方法包括将来自受试者的生 物样本与试剂接触，其中所述试剂特异结合所述核酸分子、其表达产物或其表达产物的片段；并测量结合的试剂数量并由此确定所述核酸分子或其表达产物的表达是否异常，异常表达表明具有所述病症，其中所述核酸分子具有SEQ ID NO:1核苷酸序列而所述病症是多种硫酸酯酶缺乏症。
根据本发明又一方面，用于在受试者中测量特征为核酸分子或其表达产物的异常表达的多种硫酸酯酶缺乏症的方法被提供。方法包括对来自患者的样本监测选自下面的参数(i)具有SEQ ID NO:1, 3，4的核苷酸序列的核酸分子或具有来源于FEG基因组位点的序列的核酸分子，(ii)所述核酸分子编码的多肽，(iii)来源于所述多肽的肽，和(iv)选择性结合所述多肽或肽的抗体，将它们作为对受试者中的多种硫酸酯酶缺乏症的测定。在某些实施方案中，样本是如前述实施方案任一项所描述的生物液体或组织。在一定的实施方案中，监测步骤包括将样本与选自下面的可检测的试剂接触(a)在严格条件下与(i)中的核酸分子选择性杂交的分离的核酸分子，(b)选择性结合(ii)中的多肽或(iii)中的肽的抗体，和(c)与(iv)中的抗体结合的多肽或肽。抗体、多肽、肽或核酸能用放射性标记或酶进行标记。在进一步的实施方案中，方法进一步包含检验样品中的肽。
根据本发明又一方面，试剂盒被提供。试剂盒包含包装，包装包含选择性结合前述 FGE的分离的核酸或其表达产物的任一种的试剂，和用于与测量值比较的对照，此测量值为所述试剂与前述FGE的分离的核酸或其表达产物的任一种结合的测量值。在某些实施方案中，对照是用于与测量值比较的预定值。在一定的实施方案中，对照包含前述FGE的分离的核酸的任一种的表达产物的表位。在一种实施方案中，试剂盒进一步包含选择性结合选自下面的多肽的第二试剂艾杜糖醛酸2-硫酸酯酶，硫酸胺酶(sulfamidase)，N-乙酰半乳糖胺6-硫酸酯酶，N-乙酰葡萄糖胺6-硫酸酯酶，芳基硫酸酯酶A，芳基硫酸酯酶B，芳基硫酸酯酶C，芳基硫酸酯酶D，芳基硫酸酯酶E，芳基硫酸酯酶F，芳基硫酸酯酶G，HSulf-1 ，HSulf-2, HSulf-3, HSulf-4, HSulf-5,和HSulf-6，或其肽段，和用于与所述第二试剂结合到所述多肽或其肽段的测量值进行比较的对照。
根据本发明进一步的方面，治疗多种硫酸酯酶缺乏症的方法被提供。方法包括对需要这种治疗的受试者施用调节Ca-甲酰甘氨酸生成活性的试剂，用量为治疗受试者的多种硫酸酯酶缺乏症的有效量。在某些实施方案中，方法进一步包含某一试剂的共施用，所述试剂选自编码艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶，硫酸胺酶，N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶，N-乙酰葡萄糖胺-6-硫酸酯酶，芳基硫酸酯酶A，芳基硫酸酯酶B，芳基硫酸酯酶C， 芳基硫酸酯酶D，芳基硫酸酯酶E，芳基硫酸酯酶F，芳基硫酸酯酶G，HSulf-1, HSulf-2, HS ulf-3, HSulf-4, HSulf-5,或HSulf-6的核酸分子，该核酸分子的表达产物，和该核酸分子的表达产物的片段。在一定的实施方案中，调节Ca-甲酰甘氨酸生成活性的试剂是本发明的分离的核酸分子(例如如权利要求1-8所要求的核酸分子或具有选自SEQ ID NO:1, 3，4 ，45，47，49，51，53，55，57，59，61，63，65，67，69，71，73，75，77，和 80-87 的序列的核酸)。在重要的实施方案中，调节Ca-甲酰甘氨酸生成活性的试剂是本发明的肽(例如，如权利要求 11-15，19，20 所要求的肽，或具有选自 SEQ ID NO. 2，5，46，48，50，52，54，56，58，60，62，64， 66，68，70，72，74，76，和78的序列的肽)。调节Ca-甲酰甘氨酸生成活性的试剂可通过表达内源和/或外源FGE核酸分子的细胞产生。在重要的实施方案中，内源FGE核酸分子可被活化。
根据本发明的一个方面，用于在受试者中增加Ca-甲酰甘氨酸生成活性的方法被提供。方法包括施用本发明的分离的FGE核酸分子(例如，权利要求1-8的核酸分子，或具有选自 SEQ ID NO:1, 3，4，45，47, 49，51，53，55，57，59，61，63，65，67，69，71，73，75，77，和 80-87的序列的核酸)，和/或其表达产物到受试者中，用量为在受试者中增加Ca-甲酰甘氨酸生成活性的有效量。
根据本发明的一个方面，用于治疗患多种硫酸酯酶缺乏症的受试者的方法被提供。方法包括对需要这种治疗的受试者施用调节Ca-甲酰甘氨酸生成活性的试剂，用量为 在受试者中增Wca-甲酰甘氨酸生成活性的有效量。在某些实施方案中，调节Ca-甲酰甘氨酸生成活性的试剂是本发明的有义核酸(例如，权利要求1-8的核酸分子，或具有选自 SEQ ID NO:1, 3，4，45，47, 49，51，53，55，57，59，61，63，65，67，69，71，73，75，77，和 80-87 的序列的核酸)。在一定的实施方案中，调节Ca-甲酰甘氨酸生成活性的试剂是本发明的分离的多肽(例如，权利要求11-15，19，20的多肽或具有选自SEQ ID NO. 2，5，46，48，50，52， 54，56，58，60, 62，64，66，68，70, 72，74，76，和 78 的序列的肽)。
根据本发明又一方面，用于在细胞中增加Ca-甲酰甘氨酸生成活性的方法被提供。方法包括将细胞与本发明的分尚的核酸分子接触(例如，权利要求1_8的核酸分子,或具有选自 SEQ ID NO:1, 3，4，45，47, 49，51，53，55，57，59，61，63，65，67，69，71，73，75，77，和 80-87的序列的核酸)，或其表达产物，用量为在细胞中增加Ca-甲酰甘氨酸生成活性的有效量。在重要的实施方案中，方法包括活化内源FGE基因以在细胞中增加Ca-甲酰甘氨酸生成活性。
根据本发明进一步的方面，药物组合物被提供。组合物包含治疗多种硫酸酯酶缺乏症的药学有效量的某种试剂，该试剂含有本发明的分离的核酸分子(例如，权利要求1-8 中任一项的分离的核酸分子，具有选自SEQ ID NO:1, 3，4，45，47，49，51，53，55，57，59，61，6 3，65，67，69，71，73，75，77，和80-87序列的FGE核酸分子)，或其表达产物，以及药学上可接受的载体。
根据本发明的一个方面，用于鉴别在治疗多种硫酸酯酶缺乏症中有用的候选物质的方法被提供。方法包括测定一套核酸分子在细胞或组织中的表达，条件是缺乏候选物质时，允许该套核酸分子的最初量的表达，其中该套核酸分子包含至少一种选自下面的核酸分子(a)严格条件下与由SEQ ID N0:1所示核苷酸序列组成的分子杂交并编码具有匕-甲酰甘氨酸生成活性(FGE)的多肽的核酸分子，(b)遗传密码简并性引起的在密码子序列中与(a)或(b)中核酸分子不同的核酸分子，(c)具有选自SEQ ID NO: 1，3，4，45，47，49，51 ，53，55，57，59，61，63，65，67，69，71，73，75，77，和 80-87 的序列的核酸分子，和(d) (a)或 (b)或(C)的互补链，将细胞或组织与候选物质接触并探测该套核酸分子表达的测试量，其中在候选物质存在的条件下表达的测试量相对于表达最初量的增加表明候选物质在治疗多种硫酸酯酶缺乏症中有用。
根据本发明进一步的方面，制备在治疗多种硫酸酯酶缺乏症和/或其它硫酸酯酶缺乏症中有用的药剂的方法被提供。
根据本发明又 一方面，固相核酸分子阵列被提供。阵列基本上由固定于固相基质的一套核酸分子、其表达产物或其片段(或是核酸的或是多肽分子的)组成，每一核酸分子编码选自下面的多肽SEQ ID NO. 2，5，46，48，50，52，54，56，58，60，62，64，66，68，70，72，74 ，76，和78，艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶，硫酸胺酶，N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶，N-乙酰葡萄糖胺-6-硫酸酯酶，芳基硫酸酯酶A，芳基硫酸酯酶B，芳基硫酸酯酶C，芳基硫酸酯酶D，芳基硫酸酯酶E，芳基硫酸酯酶F，芳基硫酸酯酶G，HSulf-1, HSulf-2, HSulf-3, HS ulf-4, HSulf-5,和HSulf-6。在某些实施方案中，固相阵列进一步包含至少一种对照核酸分子。在一定的实施方案中，该套核酸分子包含至少一种、至少两种、至少三种、至少四种或甚至至少五种核酸分子，每一种选自 SEQ ID NO. 2，5，46，48，50，52，54，56，58，60，62，64，66 ，68，70，72，74，76，和78，艾杜糖醛酸_2_硫酸酯酶，硫酸胺酶，N-乙酰半乳糖胺_6_硫酸酯酶，N-乙酰葡萄糖胺-6-硫酸酯酶，芳基硫酸酯酶A，芳基硫酸酯酶B，芳基硫酸酯酶 C，芳基硫酸酯酶D，芳基硫酸酯酶E，芳基硫酸酯酶F，芳基硫酸酯酶G，HSulf-l，HSulf-2， HSulf-3, HSulf-4, HSulf-5,和 HSulf-6。
根据本发明进一步的方面，用于在受试者中治疗硫酸酯酶缺乏症的方法被提供。 方法包括对需要这种治疗的受试者施用已根据本发明生产出的硫酸酯酶，用量为在受试者中治疗硫酸酯酶缺乏症的有效量，而此硫酸酯酶缺乏症不是多种硫酸酯酶缺乏症。在重要的实施方案中，通过已与调节Ca-甲酰甘氨酸生成活性的试剂接触的细胞产生硫酸酯酶。在一定的实施方案中，硫酸酯酶缺乏症包括但不限于粘多糖病II (MPS II;Hunter综合症)，粘多糖病IIIA (MPS IIIA; Sanfilippo综合症A)，粘多糖病VIII (MPS VIII)，粘多糖病 IVA(MPS IVA;Morquio 综合症 A),粘多糖病 VI (MPS VI;Maroteaux-Lamy 综合症)，异常染性脑白质营养不良(MLD)，X-连锁的隐性点状软骨发育不全1，或X-连锁的鱼鳞病(类固醇硫酸酯酶缺乏症)。在一定的实施方案中，调节Ca-甲酰甘氨酸生成活性的试剂可以是本发明的核酸分子或肽。在一种实施方案中，硫酸酯酶和调节Ca-甲酰甘氨酸生成活性的试剂在同一细胞中共表达。硫酸酯酶和/或调节Ca-甲酰甘氨酸生成活性的试剂可以是内源性或外源性的来源。如果是内源性来源，它可被活化(例如，通过在本领域中已知的合适的位置插入强启动子和/或其它元件)。如果是外源性的，其表达可被表达载体上的元件所驱动，或它可靶向于细胞基因组中合适的位置以允许其被增强的表达(例如，强启动子下游)。
根据本发明又一方面，药物组合物被提供。组合物包含治疗硫酸酯酶缺乏症的药学有效量的某种试剂，该试剂含有本发明的分离的核酸分子或其表达产物，及药学上可接受的载体。
根据本发明更进一步的方面，用于在细胞中增加硫酸酯酶活性的方法被提供。方法包括将表达硫酸酯酶的细胞与本发明的分离的核酸分子(例如，权利要求1-8中任一项的分离的核酸分子，具有选自 SEQID NO:1, 3，4，45，47，49，51，53，55，57，59，61，63，65， 67，69，71，73，75，77，和80-87的序列的FGE核酸分子)或其表达产物(例如，权利要求 11-15，19，20 的多肽，或具有选自 SEQ ID NO. 2，5，46，48，50，52，54，56，58，60，62，64，66，6 8，70，72，74，76，和78的序列的肽)接触，用量为在细胞中增加硫酸酯酶活性的有效量。细胞可表达内源性和/或外源性的硫酸酯酶。在重要的实施方案中，内源性的硫酸酯酶被活化。在一定的实施方案中，硫酸酯酶是艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶，硫酸胺酶，N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶，N-乙酰葡萄糖胺-6-硫酸酯酶，芳基硫酸酯酶A，芳基硫酸酯酶B，芳基硫酸酯酶C，芳基硫酸酯酶D，芳基硫酸酯酶E，芳基硫酸酯酶F，芳基硫酸酯酶G，HSulf -1, HSulf-2, HSulf-3, HSulf-4, HSulf-5,和 / 或 HSulf-6。在一定的实施方案中，细胞是哺乳动物细胞。
根据本发明又一方面，药物组合物被提供。组合物包含治疗硫酸酯酶缺乏症的药学有效量的被细胞产生的硫酸酯酶，和药学上可接受的载体，其中所述细胞已与包含本发明的分离的核酸分子(例如，权利要求1-8中的，或具有选自SEQ ID NO:1, 3，4，45，47，49， 51，53，55，57，59，61，63，65，67，69，71，73，75，77，和 80-87 的序列的核酸分子)，或其表达产物(例如，选自 SEQ ID NO. 2，5，46，48，50，52，54，56，58，60，62，64，66，68，70，72，74，76， 和78的肽)的试剂接触。
根据本发明又一方面，分离的人FGE基因的变体等位基因(其编码变体FGE多肽) 被提供。分离的变体等位基因包含某一氨基酸序列，该氨基酸序列在SEQ ID NO:2中至少包含一个变异，其中这至少一个变异包含MetlArg;MetlVal; Leu20Phe; Serl55Pro; Alal77 Pro;Cys218Tyr;Arg224Trp;Asn259IIe;Pro266Leu;Ala279Val;Arg327Stop;Cys336Arg;Ar g345Cys; Ala348Pro; Arg349Gln; Arg`349Trp; Arg349Trp; Ser359Stop;或其组合。
根据本发明又一方面，分离的人类变体FGE多肽被提供。分离的人类变体FGE多肽包含某一氨基酸序列，该氨基酸序列在SEQ ID NO: 2中至少含有一个变异，其中这至少一个变异包含:Met IArg; Met IVa ; Leu20Phe; Ser 155Pro; Alal77Pro; Cys218Tyr; Arg224Trp; A sn259Ile;Pro266Leu;Ala279Val;Arg327Stop;Cys336Arg;Arg345Cys;Ala348Pro;Arg349G In; Arg349Trp; Arg349Trp; Ser359Stop;或其组合。
以前述任何人类变体FGE多肽为免疫原的抗体也被提供。这类抗体包括多克隆抗体、单克隆、嵌合的抗体，也可被进行可探测性的标记。可探测性的标记也许包含放射性元素，荧光化学物或酶。
根据本发明又一方面，产生硫酸酯酶的细胞被提供，其中被细胞产生的活性硫酸酯酶对总硫酸酯酶的比率得到增加。细胞包含(i)表达增强的硫酸酯酶，和(ii)表达增强的甲酰甘氨酸生成酶，其中被细胞产生的活性硫酸酯酶对总硫酸酯酶的比率(即，硫酸酯酶的比活性)相对于由缺乏甲酰甘氨酸生成酶的细胞产生的活性硫酸酯酶对总硫酸酯酶的比率至少增加5%。在一定的实施方案中，被细胞产生的活性硫酸酯酶对总硫酸酯酶的比率相对于由缺乏甲酰甘氨酸生成酶的细胞产生的活性硫酸酯酶对总硫酸酯酶的比率，增加 了至少 10%, 15%, 20%, 50%, 100%, 200%, 500%, 1000%。
根据本发明进一步的方面，在受试者中治疗硫酸酯酶缺乏症的改进方法被提供。 方法包括以在受试者中治疗硫酸酯酶缺乏症的有效量对需要这种治疗的受试者施用硫酸酯酶，其中硫酸酯酶与有效增加硫酸酯酶比活性的量的甲酰甘氨酸生成酶接触。在重要的实施方案中，硫酸酯酶选自艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶，硫酸胺酶，N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶，N-乙酰葡萄糖胺-6-硫酸酯酶，芳基硫酸酯酶A，芳基硫酸酯酶B，芳基硫酸酯酶 C，芳基硫酸酯酶D，芳基硫酸酯酶E，芳基硫酸酯酶F，芳基硫酸酯酶G，HSulf-l，HSulf-2， HSulf-3, HSulf-4, HSulf-5,和HSulf-6。在一定的实施方案中，甲酰甘氨酸生成酶被权利要求 1-8 的核酸分子或具有选自 SEQ ID NO:1, 3，4，45，47，49，51，53，55，57，59，61，63，65， 67，69，71，73，75，77，和80-87的序列的核酸所编码。在某些实施方案中，甲酰甘氨酸生成酶是权利要求 11-15，19，20 的肽，或是具有选自 SEQ ID NO. 2，5，46，48，50，52，54，56，58，6 O, 62，64，66，68，70，72，74，76，和 78 的序列的肽。
本发明的这些和其它目标将被进一步结合本发明详细描述进行详述。
序列简述
SEQ ID NO:1是人FGE cDNA的核苷酸序列。
SEQ ID NO: 2是人FGE cDNA(SEQ ID NO:1)的翻译产物的预期氨基酸序列。
SEQ ID NO: 3是编码SEQ ID NO: 2的多肽的人FGE cDNA的核苷酸序列(即，SEQ ID NO:1 的核苷酸 20-1141)。
SEQ ID NO:4 是 G enBank Acc. No. AK075459 的核苷酸序列。
SEQ ID N0:5是SEQ ID N0:4翻译产物的预期氨基酸序列，一未命名的具有 GenBank Acc. No. BACl 1634 的蛋白产物。
SEQ ID NO: 6 是人艾杜糖醛酸 _2_ 硫酸酯酶 cDNA (GenBank Acc. No. M58342)的核苷酸序列。
SEQ ID NO: 7是人艾杜糖醛酸_2_硫酸酯酶cDNA (SEQ ID NO: 6)的翻译产物的预期氨基酸序列。
SEQ ID NO:8 是人硫酸胺酶 cDNA(GenBank Acc. No. U30894)的核苷酸序列。
SEQ ID NO: 9是人硫酸胺酶cDNA (SEQ ID NO: 8)的翻译产物的预期氨基酸序列。
SEQ ID N0:10是人N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶cDNA(GenBank Acc. No. U06088) 的核苷酸序列。SEQ ID吣11是人^乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶00嫩(5￡0 ID N0:10)的翻译产 物的预期氨基酸序列。SEQ ID N0:12是人N-乙酰葡萄糖胺-6-硫酸酯酶cDNA(GenBank Acc. No. Z12173) 的核苷酸序列。SEQ ID吣13是人^乙酰葡萄糖胺-6-硫酸酯酶00嫩(5￡0 ID N0:12)的翻译产 物的预期氨基酸序列。SEQ ID N0:14是人芳基硫酸酯酶A cDNA (GenBank Acc. No. X52151)的核苷酸序 列。SEQ ID而15是人芳基硫酸酯酶AcDNA(SEQ ID N0:14)的翻译产物的预期氨基 酸序列。SEQ ID而16是人芳基硫酸酯酶8 cDNA (GenBank Acc. No. J05225)的核苷酸序 列。SEQ ID而:17是人芳基硫酸酯酶8 cDNA(SEQ ID N0:16)的翻译产物的预期氨基 酸序列。SEQ ID N0:18是人芳基硫酸酯酶C cDNA (GenBank Acc. No. J04964)的核苷酸序 列。SEQ ID而:19是人芳基硫酸酯酶CcDNA(SEQ ID N0:18)的翻译产物的预期氨基 酸序列。SEQ ID而:20是人芳基硫酸酯酶D cDNA (GenBank Acc. No. X83572)的核苷酸序 列。SEQ ID而:21是人芳基硫酸酯酶D cDNA(SEQ ID N0:20)的翻译产物的预期氨基 酸序列。SEQ ID而:22是人芳基硫酸酯酶E cDNA (GenBank Acc. No. X83573)的核苷酸序 列。SEQ ID而:23是人芳基硫酸酯酶E cDNA(SEQ ID N0:22)的翻译产物的预期氨基 酸序列。SEQ ID N0:24是人芳基硫酸酯酶F cDNA (GenBank Acc. No. X97868)的核苷酸序 列。SEQ ID而:25是人芳基硫酸酯酶GcDNA(SEQ ID N0:24)的翻译产物的预期氨基 酸序列。SEQ ID N0ツ6是人芳基硫酸酯酶G cDNA (GenBank Acc.No.BC012375)的核苷酸序 列。SEQ ID而:27是人芳基硫酸酯酶G(5￡0 ID N0:26)的翻译产物的预期氨基酸序 列。SEQ ID N0J8iHSulf-l cDNA(GenBank Acc.No.AY101175)的核苷酸序列。SEQ ID N0:29iHSulf-l cDNA(SEQ ID N0:28)的翻译产物的预期氨基酸序列。SEQ ID N0:30iHSulf-2 cDNA(GenBank Acc.No.AY101176)的核苷酸序列。
SEQIDN0:31是HSulf-2 cDNA(SEQ ID NO:30)的翻译产物的预期氨基酸序列。
SEQIDNO: 32是出现于硫酸酯酶的高度保守的六肽L/V-FGly-X-P-S-R。
SEQIDNO: 33是合成的FGly形成底物；其一级序列是来源于人芳基硫酸酯酶A。
SEQIDNO: 34是混杂寡肽 PVSLPTRSCAALLTGR。
SEQIDNO: 35是 Ser69 寡肽 PVSLSTPSRAALLTGR。
SEQIDNO: 36是人FGE-特异性引物1199nc。
SEQIDNO: 37是人FGE-特异性正向引物lc。
SEQIDNO: 38是人FGE-特异性反向引物1182c。
SEQIDNO: 39是包含EcoRI位点的人5’ -FGE-特异性引物。
SEQIDNO: 40是HA-特异性引物。
SEQIDNO: 41是c-myc-特异性引物。
SEQIDNO: 42是RGS-His6-特异性引物。
SEQIDNO: 43是来自人FGE制备物的胰蛋白酶解寡肽SQNTPDSSASNLGFR。
SEQIDNO: 44是来自人FGE制备物的胰蛋白酶解寡肽MVPIPAGVFTMGTDDPQIK。
SEQIDNO: 45I 是人 FGE2 平行进化同源物(paralog) (GenBank G1:24308053)的核苷酸序列。
SEQIDNO:46是人FGE2平行进化同源物(SEQ ID NO:45)的翻译产物的预期氨基酸序列。
SEQIDNO:47是小鼠FGE平行进化同源物(GenBank 61:26344956)的核苷酸序列。
SEQIDNO:48是小鼠FGE平行进化同源物(SEQ ID NO:47)的翻译产物的预期氨基酸序列。
SEQIDN0:49 是小鼠 FGE 定向进化同源物(ortholog)(GenBank G1:22122361)的核苷酸序列。
SEQIDN0:50是小鼠FGE定向进化同源物(SEQ ID NO:49)的翻译产物的预期氨基酸序列。
SEQIDNO: 51是果蝇FGE定向进化同源物(GenBank 61:20130397)的核苷酸序列。
SEQIDNO:52是果蝇FGE定向进化同源物(SEQ ID N0:51)的翻译产物的预期氨基酸序列。
SEQIDNO:53是蚊子FGE定向进化同源物(GenBank 61:21289310)的核苷酸序列。
SEQIDNO:54是蚊子FGE定向进化同源物(SEQ ID NO:53)的翻译产物的预期氨基酸序列。
SEQIDNO:55是密切相关的S. coelicolor FGE定向进化同源物(GenBank61:21225812)的核苷酸序列。
SEQ ID勵56是5.(^^11。010『FGE定向进化同源物(SEQ ID NO:55)的翻译产物的预期氨基酸序列。
SEQIDNO:57是密切相关的C. efficiens FGE定向进化同源物(GenBankG1:25028125)的核苷酸序列。
SEQ ID NO:58 是 C. efficiens FGE 定向进化同源物(SEQ ID NO:57)的翻译产物的预期氨基酸序列。
SEQ ID NO:59 是 N. aromaticivorans FGE 定向进化同源物(GenBank G1:23108562)的核苷酸序列。
SEQ ID NO:60 是 N. aromaticivorans FGE 定向进化同源物(SEQ ID NO: 59)的翻译产物的预期氨基酸序列。
SEQ ID勵:61是]\110衍FGE定向进化同源物(GenBank 61:13474559)的核苷酸序列。
SEQ ID N0:62是M. loti FGE定向进化同源物(SEQ ID N0:61)的翻译产物的预期氨基酸序列。
SEQ ID N0:63 是 B. fungorum FGE 定向进化同源物(GenBank 61:22988809)的核苷酸序列。
SEQ ID NO:64是B. fungorum FGE定向进化同源物(SEQ ID NO:63)的翻译产物的预期氨基酸序列。
SEQ ID N0:65 是 S.meliloti FGE 定向进化同源物(GenBank G1: 16264068)的核苷酸序列。
SEQ ID N0:66是S.meliloti FGE定向进化同源物(SEQ ID NO:65)的翻译产物的预期氨基酸序列。
SEQ ID N0:67是微颤菌属物种FGE定向进化同源物(GenBank G1: 14518334)的核苷酸序列。
SEQ ID N0:68是微颤菌属物种FGE定向进化同源物(SEQ ID NO:67)的翻译产物的预期氨基酸序列。
SEQ ID NO: 69 是 P. putida KT2440FGE 定向进化同源物(GenBank G1:26990068)的核苷酸序列。
SEQ ID NO: 70 是 P. putida KT2440 FGE 定向进化同源物(SEQ ID NO:69)的翻译产物的预期氨基酸序列。
SEQ ID NO: 71 是 R. metal lidurans FGE 定向进化同源物(GenBank G1:22975289)的核苷酸序列。
SEQ ID NO: 72 是 R. metal lidurans FGE 定向进化同源物(SEQ ID NO: 71)的翻译产物的预期氨基酸序列。
SEQ ID勵:73是卩.11^廳FGE定向进化同源物(GenBank 61:23132010)的核苷酸序列。
SEQ ID勵:74是？.1^1^皿8 FGE定向进化同源物(SEQ ID NO:73)的翻译产物的预期氨基酸序列。
SEQ ID NO:75 是 C. crescentus CB15 FGE 定向进化同源物(GenBank G1:16125425)的核苷酸序列。
SEQ ID NO:76 是 C. crescentus CB15 FGE 定向进化同源物(SEQ ID NO:75)的翻译产物的预期氨基酸序列。
SEQ ID NO:77 是 M. tuberculosis Ht37Rv FGE 定向进化同源物(GenBank G1:15607852)的核苷酸序列。
SEQ ID NO: 78 是 M. tuberculosis Ht37Rv FGE 定向进化同源物(SEQ ID NO: 77)的翻译产物的预期氨基酸序列。
SEQ ID N0:79是出现在FGE定向进化同源物和平行进化同源物的亚结构域3的高度保守六肽。
SEQ ID NO:80 是具有 GenBank Acc. No. :CA379852 的 FGE 定向进化同源物 EST 片段的核苷酸序列。
SEQ ID N0:81 是具有 GenBank Acc. No. :AI721440 的 FGE 定向进化同源物 EST 片段的核苷酸序列。
SEQ ID NO:82 是具有 GenBank Acc. No. :BJ505402 的 FGE 定向进化同源物 EST 片段的核苷酸序列。
SEQ ID NO:83 是具有 GenBank Acc. No. :BJ054666 的 FGE 定向进化同源物 EST 片段的核苷酸序列。
SEQ ID NO:84 是具有 GenBank Acc. No. :AL892419 的 FGE 定向进化同源物 EST 片段的核苷酸序列。
SEQ ID NO:85 是具有 GenBank Acc. No. :CA064079 的 FGE 定向进化同源物 EST 片段的核苷酸序列。
SEQ ID NO:86 是具有 GenBank Acc. No. :BF189614 的 FGE 定向进化同源物 EST 片段的核苷酸序列。
SEQ ID NO:87 是具有 GenBank Acc. No. :AV609121 的 FGE 定向进化同源物 EST 片段的核苷酸序列。
SEQIDNO:88 是 HSulf-3cDNA核苷酸序列.
SEQIDNO:89 是 HSulf-3cDNA(SEQ ID NO :88)的翻译产物的预期氨基酸序列。
SEQIDNO:90 是 HSulf-4cDNA核苷酸序列.
SEQIDNO:91 是 HSulf-4cDNA(SEQ ID NO :90)的翻译产物的预期氨基酸序列。
SEQIDNO:92 是 HSulf-5cDNA核苷酸序列.
SEQIDNO:93 是 HSulf-5cDNA(SEQ ID NO :92)的翻译产物的预期氨基酸序列。
SEQIDNO:94 是 HSulf-6cDNA核苷酸序列.
SEQIDN0:95 是 HSulf-6c DNA(SEQ ID NO:94)的翻译产物的预期氨基酸序列。
附图简述


图1:在缺乏(A)或存在(B)来自牛睾丸微粒体的可溶性抽提物的条件下培育后的P23的MALD1-T0F质谱图示。
图2:来源于人FGE和PFAM-DU F323种子的21种蛋白的排列的系统发生树。
图3:人和鼠FGE基因位点的组织。外显子显示为以盒子和亮盒子(鼠的位点) 表示。内含子线上的数字指出了以kb表示的内含子大小。
图4:显示FGE表达质粒pXM G.1. 3结构图的图表。
图5:柱状图描述以FGE表达质粒瞬时转染的36F细胞中的N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶活性。
图6:柱状图描述以FGE表达质粒瞬时转染的36F细胞中的N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶比活性。
图7:柱状图描述以FGE表达质粒瞬时转染的36F细胞中的N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶生产。
图8:描述以FGE表达质粒瞬时转染的30C6细胞中的艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶活性。
图9:描述了囊括本发明的特征的试剂盒。
发明详述
本发明包括对编码甲酰甘氨酸生成酶(FGE)的基因的发现，此酶负责发生在硫酸酯酶上的对硫酸酯酶功能必需的独特翻译后修饰形成L-Ca-甲酰甘氨酸(a. k. a. FGly和 /或2-氨基-3-氧代丙酸)。已发现，出人意料地，FGE基因中的突变引起受试者中的多种硫酸酯酶缺乏症(MSD)的发展。也已发现，出人意料地，FGE增强硫酸酯酶的活性，包括但不限于，艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶，硫酸胺酶，N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶，N-乙酰葡萄糖胺-6-硫酸酯酶，芳基硫酸酯酶A，芳基硫酸酯酶B，芳基硫酸酯酶C，芳基硫酸酯酶 D,芳基硫酸酯酶E，芳基硫酸酯酶F，芳基硫酸酯酶G，HSulf-1, HSulf-2, HSulf-3, HSulf-4 ,HSulf-5,和 HSulf-6,及在申请号为 20030073118, 20030147875, 20030148920, 20030162 279和20030166283的U. S.临时申请中所述的硫酸酯酶(其内容被清楚地整合在本文中)。 考虑到这些发现，本发明的分子可用于诊断和/或治疗多种硫酸酯酶缺乏症，以及其它硫酸酯酶缺乏症的治疗。
在诊断多种硫酸酯酶缺乏·症中应用本发明的分子的方法被提供。
此外，为了对硫酸酯酶上FGly的形成进行调节的目的而在体内或体外应用这些分子的方法，治疗与这种修饰相关的病症的方法，及在制备用于治疗多种硫酸酯酶缺乏症及其它硫酸酯酶缺乏症的治疗性制剂中有用的组合物也被提供。
本发明因此在几个方面中包括调节硫酸酯酶上的FGly的形成的多肽，编码这些多肽的分离的核酸，前述的功能性修饰物和变体，前述的有用片段，以及治疗、诊断和研究的方法、组合物和与其相关的工具。
“Ca-甲酰甘氨酸生成活性”指分子在底物上形成FGly或增强FGly形成的能力。底物也许是如本文其它部分所述的硫酸酯酶，或合成的寡肽(参见，例如SEQ ID NO: 33，和实施例)。底物优选包含SEQ ID NO: 32的保守六肽[L/V-C (S) -X-P-S-R]。 分析FGly形成的方法如本领域中(参见，例如Dierks, T.等，Proc. Natl. Acad. Sc1. U. S. A. , 1997,94:11963-11968),和本文其它部分(参见，例如实施例)所描述。在本文中所用的“分子”包含“核酸”和“多肽”。FGE分子能在体内和体外形成FGly，或增强/增加 FGly的形成。
在本文中所用的“增强(或“增加”)”Ca_甲酰甘氨酸生成活性，典型地指增加FGE 和/或它编码的多肽表达。增加的表达指增加(即，到可探测的程度)本发明任意核酸 (如本文其它部分所描述的FGE核酸)的复制、转录和/或翻译，既然上调任何这些过程将导致基因(核酸)所编码多肽的浓度/数量的增加。增强(或增加)Ca-甲酰甘氨酸生成活性也指防止或抑制FGE的降解(例如通过增加的泛素化作用)、下调等，所述降解和下调导致例如相对于对照被增加的或稳定的FGE分子t1/2 (半衰期)。下调或减少的表达指基因和/或它编码的多肽减少的表达。通过使用本领域已知的任何适合的方法例如核酸杂交或抗体探测方法，分别探测基因(例如FGE)mRNA水平或基因所编码的多肽的蛋白表达水平相对于对照的增加或是减少，可直接测定基因表达的上调或下调。FGE基因表达的上调或下调也能通过探测Ca-甲酰甘氨酸生成活性的变化而间接测定。
在本文中所用的“表达”指核酸和/或多肽表达，以及多肽分子的活性(例如分子的匕-甲酰甘氨酸生成活性)。
本发明的一个方面包括对编码FGE的cDNA的克隆。根据本发明的FGE是包含SEQ ID NO:1的核酸分子的分尚的核酸分子,并编码具有Ca-甲酰甘氨酸生成活性的多肽。人 FGE cDNA的序列以SEQ ID NO:1而出现，此cDNA编码的蛋白产物的预期氨基酸序列以SEQ ID NO:2 出现。
在本文中所用的受试者是哺乳动物或非人类的哺乳动物。在所有实施方案中，人 FGE和人受:试者都是优选。
本发明因此在一个方面包括分离的FGE多肽，编码此多肽的cDNA，前述的功能性修饰物和变体，前述的有用片段，以及与其相关的诊断和治疗。
在本文中所用的关于核酸的术语“分离的”表示(i)在体外通过例如聚合酶链式反应(PCR)所扩增的；(ii)通过克隆所重组性地产生的；(iii)如通过切断和凝胶分离所纯化的；或(iv)通过例如化学合成所合成。分离的核酸是容易通过本领域众所周知的重组DNA技术操作的类型。因此，包含在一定载体中的核苷酸序列被认为是分离的，其中所述载体的5’和3’限制性位点已知或者其聚合酶链式反应(PCR)引物序列已被公开，但在其天然宿主中以其天然状态存在的核酸不是分离的。分离的核酸可被充分纯化，但不必这样。 例如，在克隆或表达载体内的分离的核酸不纯，这在于它在其寄生的细胞中也许只包含很少百分比的物质。然而，这种核酸是分离的，如本文中所用的术语一样，因为它容易通过本领域中一般技术人员所知道的标准技术被操作。
在本文中所用的关于多肽的术语“分离的”表示从其天然环境中被以充分纯的形式分开以至于它可被操作于或用于本发明的任一目的。因此，“分离的”表示纯度足以a) 用于生产和/或分离抗体，(ii)用作分析中的试剂，(iii)用于测序，(iv)用作治疗等。
根据本发明，编码具有Ca-甲酰甘氨酸生成活性的FGE多肽的分离的核酸分子包括(a)核酸分子,其在严格条件下与SEQ ID NO:1的核酸所组成的分子杂交并编码具有(。_甲酰甘氨酸生成活性的FGE多肽，(b) (a)的删除、添加和置换物，其编码各自的具有 Ca-甲酰甘氨酸生成活性的FGE多肽，(c)因为遗传密码简并性而与(a)或(b)的核酸分子在密码子序列中不同的核酸分子，和(d) (a), (b)或(C)的互补链。在本文中所用的“互补链”包括“(a)，(b)或(C)的全长互补链或100%的互补链”。
也具有Ca-甲酰甘氨酸生成活性的本发明的FGE核酸的同源物和等位基因也被本发明所包含。本文所述的同源物，包括本文其它部分所鉴别的分子(参见例如SEQ ID NOs:4, 5，45-78，和80-87)即定向进化同源物和平行进化同源物。进一步的，同源物能依照本发明的指导以及传统技术所鉴别。既然本文所述的FGE同源物全都具有(。_甲酰甘氨酸生成活性，它们能与人FGE分子在本发明的所有方面中互换性使用。
因此，本发明的一个方面是那些编码FGE多肽并在严格条件下与SEQ ID NO:1的编码区所组成的核酸分子杂交的核酸序列。在重要的实施方案中，如在此所用的术语“严格条件”指本领域所熟悉的参数。对核酸，被称为严格的杂交条件典型的是在低离子强度和恰好低于DNA杂交复合物熔点(Tm)(典型地，低于杂交物Tm约3° C)的温度下。更高的严格性限定了探针序列和靶之间更专一的相关性。核酸杂交中所用的严格条件在本领域中众所周知，可在汇编这类方法的参考文献中找到，例如Molecular Cloning A Laboratory Manual, J. Sambrook等编，Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York,1989,或 Current Protocols in Molecular Biology, F. M. Ausubel 等编，John Wiley & Sons, Inc. , New York. “严格条件”的实例是在6xSSC中于65° C下杂交。另一严格条件的实例是在杂交缓冲液中于65° C下杂交， 杂交缓冲液由3. 5xSSC, O. 02%Ficoll, O. 02%聚乙烯吡咯烷酮，O. 02%牛血清白蛋白，2. 5mM NaH2PO4 [pH7]，O. 5%SDS, 2mM EDTA 组成(SSC 是 0. 15M 氯化钠 /0. 15M 柠檬酸钠，pH7; SDS 是十二烷基硫酸钠；而EDTA是乙二胺四乙酸)。杂交之后，转上DNA的膜在2xSSC中于室温下清洗，然后在最高68°C的温度下于O. lxSSC/0.1xSDS中清洗。在进一步的实施例中，杂交水溶液的使用的替代是杂交甲酰胺溶液的使用。应用例如50%甲酰胺溶液和42° C，严格的杂交条件能因此被实现。有其它能被应用的条件、试剂等，并将导致类似的严格程度。技术人员将熟悉这类条件，因此它们不在这里给出。然而，需要被理解的是，技术人员将能以允许清晰鉴别本发明FGE核酸的同源物和等位基因的方式操控条件。技术人员也将熟悉对于细胞和之后将被常规分离的这类分子的表达库进行筛选，然后再分离相关的核酸分子和序列的方法。
一般地，同源物和等位基因典型地将分别与SEQ ID NO:1和SEQ ID NO: 2具有至少40%核苷酸同一性和/或至少50%氨基酸同一性,在某些情况下将具有至少50%核苷酸同一'I"生和/或至少65%氨基酸同一'丨生,而在其它情况下将具有至少60%核苷酸同一'丨生和/ 或至少75%氨基酸同一性。在进一步的情形中，同源物和等位基因典型地将分别与SEQ ID NO:1和SEQ ID NO: 2具有至少90%, 95%或甚至99%的核苷酸同一性和/或至少95%, 98% 或甚至99%的氨基酸同一'丨生。同一'丨生可应用多种由NCBI (Bethesda, Maryland)开发的公开可得的软件工具计算得到。示例的工具包括Altschul SF等的启发式算法(J M ol Biol, 1990, 215:403-410),也称为 BLAST。Pairwise 和 ClustalW 比对(BL0SUM30 矩阵设置)以及Kyte-Doolittle水疗分析可应用公开(EMBL, Heidelberg, Germany)和商业(例如来自 Oxford Molecular Group/Genetics Computer Group, Madison, WI 的 MacVector 序列分析软件)的类型而获得。前述核酸的Watson-Crick互补链也被本发明所包括。
在对FGE相关基因如FGE的同源物和等位基因的筛选中，Southern印迹可应用前述条件以放射性探针来完成。对DNA最终转移上去的膜进行清洗之后，此膜可放置到X-射线胶片或磷成像平板(phosphoimager plate)以探测放射性信号。
在此给定关于全长人FGE cDNA克隆的指导，则对应于人FGE基因的其它哺乳动物序列如小鼠cDNA克隆可应用标准菌落杂交技术从cDNA库中分离。
本发明也包括含有天然物质中出现的那些密码子的替代物的简并核酸。例如，丝氨酸残基被密码子TCA，AGT, TCC, TCG, TCT和AGC编码。因此，本领域一般技术人员将很明白，任何丝氨酸编码核苷酸三联体可被用于在体内或体外指导蛋白质合成装置，以将丝氨酸残基整合进入正在延伸的FGE多肽。类似地，编码其它氨基酸残基的核苷酸序列三联体包括但不限于CCA，CCC, CCG和CCT (脯氨酸密码子);CGA, CGC, CGG, CGT, AGA和AGG (精氨酸密码子)；ACA, ACC, ACG和ACT (苏氨酸密码子)；AAC和AAT (天冬酰胺密码子)；及ATA，ATC 和ATT(异亮氨酸密码子)。其它氨基酸残基可类似地被若干核苷酸序列编码。因此，本发明包括与生物学上分离的核酸在密码子序列中因遗传密码简并性而有所不同的简并核酸。
本发明也提供分离的SEQ ID NO:1或SEQ ID NO: 3或其互补链的独特片段。独特片段是这样的类型，它是更大的核酸的“标志”。例如，独特片段长度足以确保其精确序列无法在人基因组中位于上述FGE核酸(及人的等位基因)之外的分子中找到。那些本领域中的一般技术人员可不必应用常规之外的程序来测定片段是否在人基因组中是独特的。然而， 独特片段排除完全由选自SEQ ID N0:4和/或其它如本申请的申请日以前发表过的序列的核苷酸序列所组成的片段。
完全由前述GenBank保藏库描述的序列所组成的片段不包括任何对于本发明序列而言独特的核苷酸。因此，根据本发明的独特片段必须包含除那些GenBank保藏库中的确切序列或其片段之外的核苷酸序列。区别可以是相对于GenBank序列的添加、删除或置换，或可以是完全不同于GenBank序列的序列。
独特片段能在Southern和Northern印迹分析中用作探针以鉴别这类核酸,或能用于如那些采用PCR的扩增分析。如本领域技术人员已知的，大探针如200，250，300或更多的核苷酸优选用于一定的应用如Southern和Northern印迹,而更小的片段将优选用于例如PCR。独特片段也能被用于产生融合蛋白，以产生抗体或测定如实施例中证明的多肽片段的结合或产生免疫分析组分。同样地，独特片段可被用于产生例如在抗体制备、免疫分析或治疗应用中有用的FGE多肽非融合片段。独特片段进一步地可被用作反义分子以抑制 FGE核酸和多肽各自的表达。
如将被本领域技术人员所认识到的一样，独特片段的大小将依赖于其遗传密码中的保守性。因此，SEQ ID NO:1或SEQ ID NO: 3的部分区域和互补链将需要更长的节段来实现独特，而其它的只需要短节段，典型的是长12和32个核苷酸之间(例如12，13，14，15，16 ，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31 和 32 碱基)或更长，长到公开序列的全长。如上述所提及的，此公开内容倾向于包含每一序列的每一片段，起点在第一核苷酸、 第二核苷酸等等，直到离末端剩下8个核苷酸，而终点在从第8、9、10核苷酸等等开始直到恰好最后一个核苷酸的任何位置(前提为序列是如上述的独特片段)。事实上SEQ ID NO:1 区域的以核苷酸I开始而在核苷酸1180终止或SEQ ID NO 3区域的以核苷酸I开始而在核苷酸1122终止的任何节段或其互补链，长度为20或更多核苷酸都将是独特的。本领域技术人员对选择这类序列的方法(一般是基于独特片段选择性区分目的序列与人类基因组中其它序列的能力)很精通，虽然可以进行体外的证实性的杂交和序列分析。
如上述所提及的，本发明包含选择性结合编码FGE多肽的核酸分子以减少FGE活性的反义寡核苷酸。
在本文中所用的术语“反义寡核苷酸”或“反义”描述一定的寡核苷酸，该寡核苷酸是在生理条件下与包含特定基因的DNA或该基因的mRNA转录产物杂交，而因此抑制该基因的转录和/或该mRNA的翻译的寡核糖核苷酸，寡脱氧核糖核苷酸，修饰后的寡核糖核苷酸，或 修饰后的寡脱氧核糖核苷酸。反义分子被设计成与靶基因或转录物杂交以干扰靶基因的转录或翻译。本领域技术人员将认识到反义寡核苷酸的确切长度和它与其目标互补的程度将依赖于所选的特异靶，包括靶的序列和构成那一序列的特定碱基。优选反义寡核苷酸被构建和安排成在生理条件下选择性地与靶结合，即相对于靶细胞中的任何其它序列在生理条件下更充分地与靶序列杂交。基于SEQ ID NO:1或基于等位基因或同源基因组和/或cDNA序列，本领域中的技术人员能容易地挑选和合成出大量合适的反义分子中的任何类型以根据本发明而应用。为了具有充分的选择性和充分有能力进行抑制，这类反义寡核苷酸应包含与靶互补的至少10个和更多连续碱基，优选至少15个，虽然在某些情形中长度短至7个碱基的修饰后的寡核苷酸被成功用作反义寡核苷酸(Wagner 等，Nat. Med, 1995，1(11) : 1116-1118; Nat. Biotech.，1996，14:840-844)。最优选的是，反义寡核苷酸包含20 - 30个碱基的互补序列。虽然对基因或mRNA转录物任何区段反义的寡核苷酸可被选出，在优选实施方案中，反义寡核苷酸对应于N端或5’上游位点例如翻译起点、转录起点或启动子位点。此外，3’ -非翻译区可被反义寡核苷酸所祀向。对mRNA拼接位点的靶向也在本领域中应用，但如果替代性的mRNA拼接发生，则可能不是那么被优选。此外，反义物优选祀向于不希望出现mRNA 二级结构(参见,例如Sainio等，Cell Mol. Neurobiol. 14(5) :439-457, 1994)和不希望出现蛋白结合的位点。最后，虽然SEQ ID No:1 公开了 cDNA序列，本领域中的一般技术人员可容易地得到对应于此序列的基因组DNA。因此，本发明也提供与对应于SEQ ID NO:1的基因组DNA互补的反义寡核苷酸。类似地，等位基因或同源FGE cDNAs和基因组DNAs的反义物也能应用，而不需要过度的实验。
在一组实施方案中，本发明的反义寡核苷酸可由“天然”脱氧核糖核苷酸，核糖核苷酸，或它们的任意组合所组成。也就是，一种天然核苷酸的5’末端和另一天然核苷酸的 3’末端可通过核苷间的磷酸二酯键共价连接，如在天然系统中的一样。这些寡核苷酸可通过领域内认可的方法制备，所述方法可人工或通过自动合成仪而实施。它们也可通过载体被重组性地产生。
然而，在优选的实施方案中，本发明的反义寡核苷酸也可包括“修饰后的”寡核苷酸。也就是，寡核苷酸可通过许多不会阻止它们杂交至其目标但增强它们的稳定性或靶向性或者增强它们的治疗效力的方式被修饰。
在本文中所用的术语“修饰后的寡核苷酸”描述这样的寡核苷酸，其中⑴其核苷酸中的至少两个通过合成性的核苷间连接而共价连接(即，一个核苷酸5’末端和另一核苷酸3’末端之间除磷酸二酯键之外的连接)和/或(2)通常不与核酸连接的化学基团已被共价附着到寡核苷酸。优选的合成性核苷间连接是硫代磷酸酯，烷基膦酸酯，二硫代磷酸酯，磷酸酯，烧基硫代硫酸酯(alkylphosphonothioates),氨基磷酸酯，氨基甲酸酯， 碳酸酯，磷酸三酯，acetamidates,羧甲基酯和肽。
术语“修饰后的寡核苷酸”也包括具有被共价修饰的碱基和/或糖的寡核苷酸。例如，修饰后的寡核苷酸包括具有已在除3’位置羟基和5’位 置磷酸基之外的位置共价附着到低分子量有机基团的糖骨架的寡核苷酸。因此修饰后的寡核苷酸可包括2’-O-烷基化核糖基团。此外，修饰后的寡核苷酸可包括糖，例如代替核糖的阿拉伯糖。本发明因此涉及含有修饰后的反义分子与药学上可接受的载体的药物制剂，所述反义分子与编码FGE多肽的核酸互补并在生理条件下杂交。反义寡核苷酸可作为药物组合物的一部分被施用。这类药物组合物可包括与任何本领域中已知的生理性和/或药学上可接受的标准载体组合的反义寡核苷酸。组合物应是消毒过的，并以适合对患者施用的单位重量或体积而含有药学有效量的反义寡核苷酸。术语“药学上可接受的”表示不干扰活性成分的生物活性的效力的非毒性物质。术语“生理上可接受的”指与生物系统如细胞、细胞培养物、组织或器官相容的非毒性物质。载体的特征将依赖于施用途经。生理上和药学上可接受的载体包括本领域众所周知的稀释剂、填充物、盐、缓冲剂、稳定物、增溶剂和其它物质。
本发明也包括在细胞中增加Ca-甲酰甘氨酸生成活性的方法。在重要的实施方案中，这通过应用载体(“表达载体”和/或“靶向载体”)而完成。
在本文中所用的“载体”可以是多种某类核酸中的任何类型，所需序列可通过限制和连接而插入所述核酸以在不同遗传环境间运输或在宿主细胞中表达。载体典型地由DNA 组成，虽然RNA载体也可用。载体包括但不限于质粒、噬菌粒和病毒基因组。克隆载体是能在宿主细胞中复制，并进一步以一个或更多核酸内切酶限制性位点为特征的类型，载体能以可测方式在所述核酸内切酶限制性位点处被切断，所需DNA序列可连接进入所述位点处而使得新重组载体保持其在宿主细胞中复制的能力。在质粒的情形中，所需序列的复制可因为质粒在宿主菌内增加拷贝数目而发生很多次，或在宿主通过有丝分裂而复制之前在每一宿主中恰好单独一次。在噬菌体的情形中，复制可在裂解期期间主动发生或在溶原期被动发生。“表达载体”是这样的类型，所需DNA序列(例如SEQ ID NO: 3的FGE cDNA)通过限制和连接插入其中而使得所需DNA序列被可操作性地连接于调节序列并可表达为RNA转录物。载体可进一步包含一个或更多适合用于鉴别细胞已被或未被载体转化或转染的标记序列。标记包括，例如增加或减少对抗生素或其它化合物的抗性或敏感性的蛋白的编码基因，其活性通过本领域中已知的标准分析可测的酶(例如β-半乳糖苷酶或碱性磷酸酶) 的编码基因，及可视性地影响转化或转染细胞、宿主、菌落或菌斑的表型(如绿色荧光蛋白) 的基因。
“靶向载体”是典型地含有一定靶向性结构/序列的类型，所述靶向性结构/序列用于例如在内源性基因中(例如，在外显子和/或内含子序列内)，内源性基因启动子序列中，或内源性基因启动子序列上游插入调节序列。在另一实施例中，靶向载体可包含目的基因(例如SEQ ID NO:1的cDNA所编码的)和对基因靶向于基因组中优选位置所需的其它序列(例如，转录活跃位置如无关基因的内源启动子下游)。靶向性构建体和载体的构建在 U. S. Patents 5，641，670和6，270, 989中详细描述，其被清楚地整合在本文中作为参考。
事实上，任何能被异源性DNA或RNA转化并能在培养基中生长或保存的细胞(原核或真核)，可被用在本发明的实践中。实施例包括细菌细胞如大肠杆菌，昆虫细胞，和哺乳动物如人、小鼠、仓鼠、猪、山羊、灵长类等的细胞。它们可以是原代或次级细胞株(其在培养中显示有限数目的平均群体倍增而不是永久的)和永久的细胞系(其在培养中显示明显的无限寿命)。原代和次级细胞包括，例如，成纤维细胞，角质化细胞，上皮细胞 (例如乳腺上皮细胞，肠上皮细胞)，内皮细胞，神经胶质细胞，神经细胞，血液的组成成分(例如淋巴细胞，骨髓细胞)，肌肉细胞和这些体细胞类型的前体包括胚胎干细胞。 在细胞将被在基因治疗中应用时，原代细胞优选从施予操作后的细胞的个体中获得。然而，原代细胞能从相同物种的供体(而不是受体)获得。可与本发明的DNA构建物和方法一起应用的永久的人细胞系实例包括但不限于HT-1080细胞(ATCC CCL 121) ,HeLa细胞和 HeLa 细胞衍生物(ATCC CCL 2，2.1 和 2. 2)，MCF-7 乳腺癌细胞(ATCC BTH 22)，K-562 白血`病细胞(ATCC CCL 243)，KB 癌细胞(ATCC CCL 17)，2780AD 卵巢癌细胞(Van der Blick, A. Μ.等，Cancer Res, 48:5927-5932 (1988)，Raji 细胞(ATCC CCL 86)，WiDr 结肠腺癌细胞(ATCC CCL 218)，SW620 结肠腺癌细胞(ATCC CCL 227)，Jurkat 细胞(ATCC TIB 152) ,Namalwa 细胞(ATCC CRL1432)，HL-60 细胞(ATCC CCL 240) ,Daudi 细胞(ATCC CCL 213), RPMI 8226 细胞(ATCC CCL 155)，U_937 细胞(ATCC CRL 1593)，Bowes 黑色素瘤细胞 (ATCC CRL 9607)，W1-38VA13 亚系 2R4 细胞(ATCC CLL 75.1),和 M0LT-4 细胞(ATCC CRL 1582)，CHO细胞，和COS细胞，以及通过人细胞和另一物种细胞融合而产生的异杂交瘤细胞。次级人成纤维细胞株，如W1-38(ATCC CCL 75)和MRC-5 (ATCC CCL 171)也可被应用。 对可在实践本发明的方法中应用的细胞类型的进一步讨论，在U. S. Patents 5，641，670和 6，270，989中被描述。无细胞的转录系统也可代替细胞。
本发明的细胞被保存在本领域已知的条件下，这将引起FGE蛋白或其功能性片段的表达。应用所述方法，表达的蛋白可从细胞裂解物或细胞上清中纯化。根据此方法制得的蛋白质能被制成药学上有用的配剂，并通过本领域中已知的传统药学途径而递送至人或非人的动物(例如口服，静脉内，肌肉内，鼻内，气管内或皮下)。如本文其它部分所描述的，重组细胞可以是永生化的、原代的或次级的细胞，优选人的细胞。来自其它物种的细胞的应用可在一定的情形中是合意的，所述情形为非人细胞有利于在所产生的非人FGE在药学上有用的情况下的蛋白产生的目的。
在本文中所用的编码序列和调控序列，当它们以将编码序列的表达或转录置于调控序列的影响或控制之下的方式而共价连接时，被表述成“可操作性地”连接。如果期望编码序列被翻译成功能性蛋白质，而假如5’调控序列中的启动子的诱导导致编码序列的转录，并且两个DNA序列间的连接(I)不会导致移码突变的引入，(2)不会干扰启动子区域指导编码序列转录的能力，或(3)不会干扰相应的RNA转录物被翻译成为蛋白的能力，则两个 DNA序列被表述成“可操作性地”连接。因此，如果启动子区域能影响那一 DNA序列的转录从而所得的转录物可被翻译成所期望的蛋白或多肽，则启动子区域将可操作性地连接编码序列。
基因表达所需的调控序列的精确本质可在物种或细胞类型间变动，但将一般性地包括，如所必需的，于转录和翻译各自启动有关的5’非转录和5’非翻译序列，如TATA盒， 加帽序列，CAAT序列和类似物。尤其是，这类5’非转录调控序列将包括包含对可操控性连接的基因进行转录控制的启动子序列的启动子区域。调控序列也可包括所期望的增强子序列或上游激动子序列。本发明的载体可随意包括5’前导或信号序列。对合适载体的选择和设计是在本领域一般技术人员的能力和指导之内。
包含所有表达必需的元件的表达载体可商业性地获得，并为本领域技术人员所知。参见，例如 Sambrook 等，Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989。细胞通过编码 FGE 多妝或其片段或变体的异源性DNA (RNA)被引入而基因工程化。那一 DNA (RNA)被置于转录元件的可操作性控制之下，以允许异源DNA在 宿主细胞中的表达。
用于在哺乳动物细胞中表达mRNA的优选系统例如包含选择标记如给予G418 抗性的基因(其促进对稳定性转染的细胞系的选择)和人细胞巨化病毒(CMV)增强子-启动子序列的pRc/CMV(可从Invitrogen, Carlsbad, CA得到)。此外，适合在灵长类和犬类细胞系中进行表达的类型有pCEP4载体(Invitrogen, Carlsbad, CA),其包含促进质粒作为多拷贝的染色体外元件而保存的EB病毒(EBV)复制起点。另一表达载体是包含多肽延伸因子Ia的启动子的PEF-BOS质粒，其有效刺激了体外的转录。质粒被 Mishizuma 和 Nagata(Nuc. Acids Res. 18:5322, 1990)描述，而其在转染实验中的应用已得到公开，例如，Demoulin(Mol. Cell. Biol. 16:4710-4716，1996)。又一优选的表达载体是Stratford-Perricaudet所述的腺病毒，其El和E3蛋白有缺陷(J. Clin.1nvest. 90:626-630, 1992)。腺病毒作为Adeno. PlA重组体的应用被Warnier等所公开，用于在小鼠皮内注射以得到抗PlA的免疫化(Int. J. Cancer, 67:303-310, 1996)。
本发明也包括所谓的表达试剂盒，其允许技术人员制备所期望的表达载体或载体。这类表达试剂盒至少包括每一前面讨论的编码序列的单独部分。其它成分可按需要添加，只要前面提到的所需的序列被包括在内。
也应认识到，本发明包含上述的包含表达FGE cDNA序列的载体转染宿主细胞和细胞系的应用，这些细胞是原核(例如大肠杆菌)或真核性(例如CHO细胞，COS细胞，酵母表达系统和在昆虫细胞中表达的杆状病毒)的。尤其有用的是哺乳动物细胞如人，小鼠， 仓鼠，猪，山羊，灵长动物等的细胞。它们可以是多种组织类型，包括如本文其它部分所描述的原代细胞和永生化的细胞系。具体实例包括HT-1080细胞，CHO细胞，树状细胞，U293 细胞，外周血白细胞，骨髓干细胞，胚胎干细胞，和昆虫细胞。本发明也允许细胞和动物中的FGE基因“敲除”的构建，为研究FGE活性的某些方面提供材料。
本发明也提供被前述FGE核酸编码的分离的多肽(包括完整蛋白和部分蛋白)，也包括SEQ ID N0:2的多肽和其独特片段。这类多肽可用于，例如，单独或作为融合蛋白的部分去产生作为免疫分析成分的抗体。多肽可以是从生物样本包括组织或细胞匀浆中分离的，也可是在多种原核或真核表达系统中重组性表达的，所述重组性表达通过构建适合于表达系统的表达载体，将表达载体引入表达系统，及分离重组性表达的蛋白而完成。短多肽，包括抗原性肽(如被MHC分子呈递在细胞表面以进行免疫识别的)也能应用已良好建立的肽合成方法化学合成。
一般而言，FGE多肽的独特片段具有如上述讨论的与核酸相关的独特片段的特征和特性。如本领域技术人员将认识到的，独特片段的大小将依赖于一定的因素，例如片段是否组成了保守蛋白结构域的一部分。因此，SEQ ID N0:2的部分区域将需要更长的片段以保证独特，而其它的只需要短片段，典型的是在5和12个氨基酸之间(例如5，6，7,8,9, 10，11 和12氨基酸长或者更多，包括每一整数直到全长，287个氨基酸长)。
多肽的独特片段优选保持明显的多肽功能能力的那些片段。可被保持在多肽的独特片段中的功能能力包括与抗体的相互作用、与其它多肽或其片段的相互作用，与其它分子的相互作用等。一种重要的活性是作为鉴别多肽的标签而起作用的能力。本领域技术人员很精通于选择独特氨基酸序列的方法，典型的是基于独特片段从非家族成员中选择性识别出目的序列的能力。片段的序列与那些数据库中已知序列进行比较即是所需的。
本发明包括上述FGE多肽的变体。在本文中所用的FGE多肽的“变体”是包含一种或更多对FGE多肽一级氨基酸序列的修饰的多肽。创造FGE多肽变体的修饰，典型的 是被施加给编码FGE多肽的核酸，可包括删除、点突变、截断、氨基酸置换和氨基酸或非氨基酸部分的添加，以1)减少或消除FGE多肽的活性；2)增强FGE多肽的性质，如表达系统中的蛋白稳定性或蛋白-配体结合的稳定性；3)对FGE多肽提供新活性或性质，如抗原性表位的添加或可探测部分的添加；或4)提供与FGE多肽受体或其它分子的相等或更好的结合。替代性地，修饰可直接施加给多肽，如通过切断，连接分子的添加，可探测部分如生物素的添加，脂肪酸的添加和类似的方式。修饰也包括包含全部或部分FGE氨基酸序列的融合蛋白。本领域技术人员将会熟悉预测蛋白序列变化对蛋白构象的影响的方法，并能因此根据已知方法而“设计” FGE多肽的变体。这种方法的一个实例被Dahiyat和Mayo在 Science278:82-87，1997中描述，其中蛋白质可被重新设计。此方法能被应用于已知的蛋白，以仅改变多肽序列的一部分。通过应用Dahiyat和Mayo的计算方法，具体的FGE多肽的变体可得到提议和被测试以测定变体是否保持了所期望的构象。
变体可包括被专一修饰的FGE多肽，所述修饰是为了改变多肽的与其生理活性无关的特征。例如，半胱氨酸残基能被置换或删除以防止不必要的二硫键连接。类似地，一定的氨基酸可被改变以通过消除表达系统中由蛋白酶作用的蛋白水解而增强FGE多肽的表达(例如存在KEX2蛋白酶活性的酵母表达系统中的双碱性氨基酸残基)。
编码FGE多肽的核酸的突变优选保存编码序列的氨基酸阅读框，并优选不在核酸中创造出很可能杂交以形成二级结构的区域，二级结构例如发卡或环结构能对变体多肽的表达有害。
突变可通过选择氨基酸置换或多肽编码核酸中选定位置的随机突变而发生。变体多肽随后得到表达，并进行对一种或更多活性的检测，以测定哪个突变为变体多肽提供了期望的性质。进一步的对多肽的氨基酸序列而言沉默的突变可提供给变体(或非变体的 FGE多肽)，但其提供在特定宿主中优选的翻译密码子，或改变mRNA的结构以，例如，增强稳定性和/或表达。优选的在例如大肠杆菌、哺乳动物细胞等中的核酸翻译密码子，对本领域中的一般技术人员而言众所周知。其它突变也可提供给FGE基因或cDNA克隆的非编码序列以增强多肽的表达。
技术人员将意识到保 守氨基酸置换可发生在FGE多肽中以提供功能等同的前述多肽的变体，即，变体保持FGE多肽的功能能力。在本文中所用的“保守氨基酸置换”指不显著改变三级结构和/或多肽活性的氨基酸置换。变体可根据本领域一般技术人员已知的改变多肽序列的方法而制备，并包括那些在汇编这类方法的参考文献中找到的类型，例如 Molecular Cloning A Laboratory Manual, J. Sambrook 等编，Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989,或 Current Protocols in Molecular Biology, F. M. Ausubel 等编，John Wiley & Sons, Inc. , New York。示例性的FGE多肽的功能等同性变体包括对SEQ ID NO:2的保守氨基酸置换。保守氨基酸置换包括发生在下列组群内部氨基酸中间的置换(a)M，I，L，V; (b)F, Y,ff; (c) K, R,H; (d)A,G; (e)S,T; (f)Q,N;和(g)E，D.
因此FGE多肽的功能等同的变体，即，保持天然FGE多肽功能的FGE多肽的变体被本发明所涉及。FGE多肽氨基酸序列中产生功能等同性变体的保守氨基酸置换，典型地是通过编码FGE多肽的核酸(SEQ ID NOs:1, 3)的改变所提供。这类置换可通过多种本领域一般技术人员已知的方法而得到。例如，氨基酸置换可通过PCR导向突变，根据Kunkel的方法(KunkeI, Proc. Nat. Acad. Sc1. U. S. A. 82:488-492，1985)的定点突变，或编码 FGE 多肽的基因的化学合成而得到。FGE多肽的功能等同片段的活性能通过将编码改变后的FGE多肽的基因克隆进细菌或哺乳动物表达载体，将载体引入合适的宿主细胞，表达改变后的FGE 多肽，和测试在本文中公开的FGE多肽的功能能力(例如Ca-甲酰甘氨酸生成活性等)，而得到测试。
在本文中所述的发明具有许多应用，其中的一部分在本文其它部分被描述。首先， 本发明允许对FGE多肽的分离。技术从业人员众所周知的多种方法能被用于得到分离的 FGE分子。多肽可从天然产生多肽的细胞中通过层析方式或免疫识别而纯化。替代性地，表达载体可被引入细胞以引起多肽的产生。在另一方法中，mRNA转录物可被微注射或另外地被引入细胞以引起被编码的多肽的产生。FGE mRNA在无细胞抽提物如网织红细胞降解系统中的翻译也可被用于产生FGE多肽。本领域技术人员也可容易地遵循已知的分离FGE多肽的方法。这些包括但不限于免疫层析，HPLC，大小排阻层析，离子交换层析和免疫亲和层析。
在一定的实施方案中，本发明也提供来源于FGE多肽的“显性失活”多肽。显性失活多肽是蛋白质的失活变体，其通过与细胞机制相互作用而从活性蛋白与细胞机制的相互作用中取代了活性蛋白，或与活性蛋白竞争，而减小了活性蛋白的效应。例如，与配体结合但不会转导响应于配体结合的信号的显性失活受体能减小配体表达的生物学效应。同样地，与靶蛋白正常相互作用但不磷酸化靶蛋白的显性失活催化惰性激酶，能减少靶蛋白响应于细胞信号的磷酸化。类似地，结合到基因调控区域的启动子位置但不增加基因转录的显性失活转录因子能通过占据启动子结合位置而不增加转录来减小正常转录因子的效应。
显性失活多肽在细胞中表达的最终结果是活性蛋白质的功能的减少。本领域一般技术人员能评估显性失活蛋白变体的潜力，并用标准突变技术创造一种或更多显性失活变体蛋白。参见，例如 U. S. Patent No. 5，580，723 和 Sambrook 等，Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989。技术人员随后能测试经诱变的蛋白群体的选定活性的减少和/或对这种活性的保持力。其它类似的用于创造和测试蛋白的显性失活变体的方法对本领域一般技术人员将是很显然的。
FGE cDNA的分离也使技术人员可能诊断以FGE异常表达为特征的疾病。这些方法包括测定FGE基因和/或源于其的FGE多肽的表达。在前者的情形下，这类测定能通过任何标准的核酸测定分析而进行，包括聚合酶链式反应，或如下面作为例子的采用标记性杂交探针的分析。在后者的情形下，这类测定能通过任何标准的(应用例如结合到分泌出的 FGE蛋白的抗体的)免疫分析而进行。优选的可根据本发明诊断的疾病是多种硫酸酯酶缺乏症。
本发明也包括分离的肽结合试剂，所述试剂，例如，可以是具有选择性结合到FGE 多肽的能力的抗体或抗体片段(“结合性多肽”)。抗体包括根据传统方法制备的多克隆和单克隆抗体。在一定的实施方案中，本发明排除了与SEQ ID N0:4的核酸所编码的多肽 结合的结合性试剂(例如抗体)。
值得注意的是，如本领域中众所周知的，只有抗体分子的一小部分，即抗原互补位，涉及抗体与其表位的结合(参见，一般地，Clark, ff. R. (1986)The Experimental Foundations of Modern Tmmunologv Wiley & Sons, Inc. , New York;Roitt,1. (1991) Essential Tmmunol ogv. 7th Ed. , Blackwell Scientific Publications, Oxford)。例如， pFc’和Fe区域是补体级联的效应子但不涉及抗原结合。pFc’区域已被酶切掉的抗体或产生时不含pFc’区域的抗体，它们被称为F(ab’)2片段，保持了完整抗体的两个抗原结合位点。类似地，Fe区域已被酶切掉的抗体或产生时不含Fe区域的抗体，它们被称为Fab片段，保持了完整抗体分子的一个抗原结合位点。进一步地，Fab片段由共价结合的抗体轻链和被表示为Fd的抗体重链的一部分所组成。Fd片段是抗体专一性的主要决定因素(单一 Fd片段可与多达10条的不同轻链相连而不改变抗体专一性)，并且Fd片段在分离后保持表位一结合能力。
如本领域中众所周知的，在抗体的抗原结合部分内部有直接与抗原表位相互作用的互补性决定区域(CDRs)，也有保持抗体结合部位三级结构的构架区域(FRs)(参见，一般地，Clark, 1986;Roitt, 1991)。在IgG免疫球蛋白重链Fd片段和轻链中，有通过三个互补决定区域(⑶Rl到⑶R3)分别分开的四个构架区域(FRl到FR4)。⑶Rs尤其是⑶R3区域，更尤其是重链CDR3，很大程度上对抗体专一性负责。
现在在本领域中已很好地认识到，哺乳动物抗体的非CDR区域可被同种或异种特异性抗体的类似区域所替代，而保持原始抗体的表位专一性。这在制备和应用“人源化”抗体中表现得最清晰，其中非-人⑶Rs共价连接到人FR和/或Fc/pFc’区域以产生功能抗体。参见，例如 U. S. patents 4，816，567，5，225，539，5，585，089，5，693，762 和 5，859，205。 因此，例如，PCT国际公开号WO 92/04381教授了人源化的鼠类RSV抗体的生产和应用，其中至少鼠FR区域的一部分被人源性的FR区域所取代。这类抗体，包括具有抗原结合能力的完整抗体的片段，经常被表示成“嵌合的”抗体。
因此，正如对本领域一般技术人员而言是很明白的，本发明也提供 F(ab，)2，Fab, Fv和Fd片段；其中Fe和/或FR和/或CDRl和/或CDR2和/或轻链CDR3 区域已被同源的人或非-人序列所取代的嵌合的抗体；其中FR和/或CDRl和/或CDR2和 /或轻链CDR3区域已经被同源的人或非序列所取代的嵌合F(ab’ )2片段抗体；其中FR和 /或CDRl和/或CDR2和/或轻链CDR3区域已被同源的人或非-人序列所取代的嵌合的 Fab片段抗体；以及其中FR和/或CDRl和/或CDR2区域已被同源的人或非-人序列所取代的嵌合的Fd片段抗体。本发明也包括所谓的单链抗体。
因此，本发明包括与FGE多肽专一结合的多种大小和类型的多肽，及FGE多肽与其结合伴侣的复合物。这些多肽也可由抗体技术之外的其它来源得来。例如，这类多肽结合试剂能由简并肽库而提供，所述简并肽库可很容易以溶液、以固定的形式作为细菌鞭毛肽展示库或噬菌体展示库而制备。也可制备含有一个或更多氨基酸的肽组合文库。文库能进一步由肽和非肽的合成部分合成。
噬菌体展示能在鉴别根据本发明而有用的结合肽中特别有效。简而言之，可应用传统程序制备显示4到约80个氨基酸残基插入物的噬菌体库(应用例如ml3，fd，或λ噬菌体)。插入物可代表，例如，完全的降解物或有偏差的阵列。然后可挑选噬菌体承载性插入物，其结合到FGE多肽或FGE和结合伴侣的复合物。此过程可通过复选结合到FGE多肽或复合物的噬菌体的几个循环而重复。重复的循环导致承载特定序列的噬菌体的富集。DNA 序列分析可以进行，以鉴别所表达多肽的序列。结合FGE多肽或复合物的序列的最小线性部分可被测定。应用含有插入物的偏差性的库，可重复这些程序，所述插入物包含最小线性部分的一部分或 全部外加一个或更多附加的其上游或下游的简并残基。酵母双杂交筛选方法也可用于鉴别结合到FGE多肽的多肽。因此，本发明的FGE多肽或其片段或FGE与结合伴侣的复合物能被用于筛选肽库，包括噬菌体展示库，以鉴别和选择本发明FGE多肽的肽结合伴侣。这类分子能用于，如所述的，筛选分析，纯化方案，对FGE功能的直接干扰，及其它对本领域一般技术人员而言很显然的目的。
FGE多肽或其片段也能用于分离它们的天然结合伴侣。对结合伴侣的分离可根据众所周知的方法完成。例如，分离的FGE多肽能被附着于某一基质，然后被怀疑含有FGE结合伴侣的溶液可应用到基质上。如果FGE多肽的结合伴侣在溶液中存在，那么它将结合到基质固着的FGE多肽。之后结合伴侣可被分离出。充当FGE结合伴侣的其它蛋白质可通过类似方法分离出，而不需要过度的实验。优选的结合伴侣是硫酸酯酶。
本发明也提供测量FGE在受试者中表达水平的方法。这可通过首先得到来自受试者的测试样本而完成。测试样本可以是组织或生物液体。组织包括脑，心脏，血清，乳房，结肠，膀胱，子宫，前列腺，胃，睾丸，卵巢，胰，垂体腺，肾上腺，甲状腺，唾液腺，乳腺，肾，肝，肠，脾，胸腺，血管，骨髓，气管，和肺。在一定的实施方案中，测试样本源自心脏和血管组织,生物液体包括血液，唾液和尿。创伤性和非创伤性技术都能用于获得这类样本，并在本领域中被很好地记载。在分子水平上，应用本发明在此所述的产物和可在汇编这类方法的参考文献中找到的本领域众所周知的方案,PCR和Northern印迹都能用于测定FGE mRNA的水平。在蛋白质水平上，应用多克隆或单克隆抗FGE血清结合标准免疫分析，FGE表达可被测定。优选的方法将会把测得的测试样本的FGE表达水平与对照进行比较。对照可包括已知量的核酸探针、FGE表位(如FGE表达产物)，或来自具有对照或“正常”水平FGE表达的受试者的类似测试样本。
FGE多肽优选重组性产生，虽然这类蛋白可从生物抽提物中分离出。重组性产生的FGE多肽包括含有FGE蛋白与另一多肽的融合物的嵌合的蛋白质，所述多肽例如能提供或增强蛋白一蛋白结合、序列专一性核酸结合(如GAL4)，增强FGE多肽在分析条件下的稳定性，或提供可探测性的部分例如绿色荧光蛋白。融合到FGE多肽或片段的多肽也可提供易于探测融合蛋白的手段，例如通过免疫识别或通过荧光标记。
本发明也在产生非人的转基因动物中有用。在本文中所用的“非人的转基因动物” 包括具有整合在生殖系细胞和/或体细胞中的一种或更多的外生性核酸分子的非人的动物。因此转基因动物包括通过同源重组而具有纯合或杂合基因断裂的“敲除的”动物，具有游离或染色体整合的表达载体的动物等。敲除动物能通过应用本领域众所周知的胚胎干细胞的同源重组而制得。重组可应用例如本领域一般技术人员已知的cre/lox系统或其它重组酶系统而促进。在一定的实施方案中，重组酶系统本身是条件性地表达，例如在一定组织或细胞类型中，在一定胚胎或胚胎后发育阶段，因增加或减弱表达的化合物或类似物质的加入而被诱导。一般地，在这类系统中应用的条件表达载体应用多种可赋予所期望的基因表达模式(例如时间或空间性的)的启动子。条件启动子也能可操纵性地连接到FGE核酸分子以受调节或条件性的方式增加FGE的表达。FGE活性或表达的反式-作用负调节子也能可操纵性地连接到上述的条件启动子。这类反式-作用调节子包括反义FGE核酸分子，编码显性失活FGE分子的核酸分子，对FGE核酸专一的核酶分子，和类似物。非人的转基因动物在用于对诊断或治疗方法的生化或生理效应进行测试的实验中有用，所述诊断或治疗方法针对以增加或减少FGE表达为 特征的病症。其它应用对本领域一般技术人员而言是很显然的。
本发明也涉及基因治疗。完成离体基因治疗的程序在U. S. Patent5, 399，346中概述，也显示于该专利审查中所提交的文件，其所有内容都是公开可得的文件。一般地，它包括在体外将基因的功能拷贝引入到包含基因缺陷性拷贝的受试者的细胞中，将基因工程化的细胞回置到受试者中。基因的功能拷贝是处于允许基因在基因工程化细胞中表达的调控元件的可操作性控制下。许多转染和转导技术以及适当的表达载体为本领域一般技术人员所熟知，其中的一部分在PCT申请W095/00654中被描述。应用例如腺病毒，逆转录病毒， 疱疹病毒，和靶向的脂质体之类载体的体内基因治疗也根据本发明而涉及。
本发明进一步提供鉴别试剂或引导化合物以得到在FGE或FGE片段依赖性细胞功能的水平上有活性的试剂的有效方法。这类功能尤其包括与其它多肽或片段的相互作用。 一般地，筛选方法包括对干扰FGE活性(如Ca-甲酰甘氨酸生成活性)的化合物的分析，虽然增强FGE Ca-甲酰甘氨酸生成活性的化合物也能应用该筛选方法而被分析。这类方法能被适应于自动化的高产出的化合物筛选。靶指标包括被FGE调节的细胞过程如Ca-甲酰甘氨酸生成活性。
多种对备选(药理上的)试剂的分析被提供，包括标记的体外蛋白质一配体结合分析，电泳迁移改变分析，免疫分析，基于细胞的分析例如双杂交或三杂交筛选，表达分析等。 转染的核酸能编码例如，组合肽库或cDNA库。便于这类分析的试剂例如GAL4融合蛋白在本领域中众所周知。可作为范例的基于细胞的分析包括，以编码融合到GAL4 DNA结合结构域的FGE多肽的核酸和编码可操作性地连接到基因表达调节区(如一个或更多GAL4结合位点)的报告基因的核酸而转染细胞。报告基因转录的活化发生在FGE和报告融合多肽结合以例如激·活报告基因的转录时。之后，调节FGE多肽介导的细胞功能的试剂通过报告基因表达的变化而被探测。测定报告基因表达变化的方法在本领域中众所周知。
方法中所用的FGE片段当不是由转染的核酸所产生时，作为分离的多肽加入到分析混合物中。FGE多肽优选重组产生，虽然此多肽可从生物抽提物中分离。重组产生的FGE 多肽包括包含FGE蛋白与另一多肽的融合体的嵌合蛋白质，另一多肽例如能提供或增强蛋白质一蛋白质结合、序列专一性核酸结合(如GAL4)、增强FGE多肽在分析条件下的稳定性或提供可探测部分例如绿色荧光蛋白或Flag表位。
分析混合物包含能与FGE相互作用的天然的细胞内FGE结合祀。当天然FGE结合靶可用时，常常优选应用FGE结合靶的局部(例如肽-参见例如SEQ ID NO: 33的肽-或核酸片段)或类似物(即，为分析目的而模拟天然结合靶的FGE结合性质的试剂)，只要局部或类似物提供分析中可测量的对FGE片段的结合亲合性和强烈结合倾向。
分析混合物也包含候选物质。典型地，多个分析混合物以不同试剂浓度平行进行， 以得到对多种浓度的不同反应。典型地，这些浓度中的某一个用作负对照，即，试剂的零浓度或在分析的探测极限之下的试剂浓度。候选物质包括许多化学种类，虽然它们典型的是有机化合物。优选地，候选物质是小分子有机化合物，即那些具有大于50然而小于约2500 的分子量的类型，优选小于约1000，而更优选小于约500。候选物质包含与多肽和/或核酸的结构性相互作用所必需的功能化学基团，并典型地包括至少一个氨基、羰基、羟基或羧基基团，优选至少两个功能化学基团，而更优选至少三个功能化学基团。候选物质可包含被一种或更多上述确定的功能基团所取代的环碳或杂环结构和/或芳香或聚芳香结构。候选物质也可是生物分子例如肽，糖，脂肪酸，固醇，类异戊二烯，嘌呤，嘧啶，上述物质的衍生物或结构类似物，或者其组合，以及类似物质。试剂是核酸的情形中，试剂典型地是DNA 或RNA分子，虽然在此所定义的修饰后的核酸也被涉及。
候选物质从多种来源包括合成或天然化合物的库得到。例如，对于多种有机化合物和生物分子的随机和定向合成，有许多方式可用，包括随机寡核苷酸的表达、合成性的有机组合库、随机肽段的噬菌体展示库和类似方式。替代性地，细菌、真菌、植物和动物抽提物形式的天然化合物的库唾手可得或易于产生。此外，天然和合成性产生的库和化合物能通过传统化学、物理和生化方式被修饰。进一步地，已知的(药理学上)试剂可进行定向或随机化学修饰例如酰化，烧基化，酯化，amidification,等，以产生试剂的结构类似物。
多种其它试剂也能被包括在混合物中。这些包括试剂例如盐，缓冲剂，中性蛋白质(例如白蛋白)，去污剂，等，其可被用于促进最佳的蛋白质一蛋白质和/或蛋白质一核酸结合。这样的试剂也可减少反应成分的非专一性的或背景性的相互作用。其它改善分析效率的试剂如蛋白酶，抑制剂，核酸酶抑制剂，抗微生物剂和类似物也可被应用。
前述分析材料的混合物在由此确定的条件下培育，但对于候选物质存在的情形中，FGE多肽特异性地与细胞结合靶、其部分或其类似物结合。组分加入的顺序，培育温度， 培育时间和分析的其它参数可容易地确定。这类实验只包括分析参数的最优化，而不涉及分析的基本组成。培育温度典型地是在4°C和40°C之间。培育时间优选最小化以促进快速、 高产出的筛选，而典型的是在O.1和10小时之间。
培育之后，FGE多肽与一种或更多结合靶的专一性结合的存在与否通过使用者可用的任何方便的方法而探测。对于非细胞结合类型分析，分离步骤常被用于从未结合的组分中分离结合的组分。分离步骤可以多种方式完成。方便的是，组分中的至少一种在固相基质上被固定，未结合组分可容易地从其中分离。固相基质可由多种材料制成多种形式，例如微量滴定平板，微珠，计量棒(dipstick)，树脂颗粒，等。优选基质被选择成最大的信噪比，主要是最小化背景结合，以及使分离程序和成本简化。
分离可被多种因素影响，例如从库中除去珠子或计量棒，清空或稀释库如微量滴定平板孔，以清洗溶液或溶剂清洗珠子，颗粒，层析柱或过滤器。分离步骤优选包括多次漂洗或清洗。例如，当固相基质是微量滴定平板时，孔可典型地被包括培育混合物的那些不参与特异性结合的组分的清洗溶液清洗数次，所述组分如盐，缓冲剂，去污剂，非专一性蛋白质等。在固相基质是磁珠的情形中，珠子可用清洗溶液清洗一次或更多，并用磁体而分罔出。
探测可以任何方便的方式被影响，以进行基于细胞的分析例如双杂交或三杂交筛选。与靶分子相互作用的FGE多肽的报告基因转录分析所得到的转录物典型地编码直接或间接可测的产物，例如半乳糖苷酶活性，荧光素酶活性，和类似物。对于非细胞结合分析，组分的一种通常包含或被偶连到可探测的标记。多种标记都能用，例如那些提供直接探测的类型(例如放射性，发光，视觉或电子密度等)，或提供间接探测的类型(例如，表位标签如FLAG表位、酶标签如辣根过氧化物酶等)。标记可被固着于FGE结合伴侣，或整合进结合伴侣的结构中。
多种方法可被用于探测标记，这取决于标记的天性和其它的分析组分。例如，当固着到固相基质时或从固相基质分离之后，标记可被探测。标记可通过视觉或电子密度，放射性辐射，非放射性能量转移等直接探测，或以抗体缀合物、链霉抗生物素-生物素缀合物等间接探测。探测标记的方法在本领域中众所周知。
本发明提供FGE专一`结合试剂，鉴别和生产这类试剂的方法，及它们在诊断、治疗和药物开发中的应用。例如，FGE专一性药理试剂在多种诊断和治疗性应用中有用，尤其是在疾病或疾病预后与改变的FGE结合特征相关的情形例如多种硫酸酯酶缺乏症中。新的 FGE专一结合试剂包括FGE专一抗体，细胞表面受体，被例如双杂交筛选的分析法所鉴别的其它天然细胞内和细胞外结合试剂，及被对化学库的筛选所鉴别的非天然细胞内和细胞外结合试剂，和类似物。
一般而言，FGE结合到特异分子的专一性通过结合平衡常数被测定。能选择性结合FGE多肽的靶优选具有至少约IO7M4的结合常数，更优选至少约IO8M'而最优选至少约 IO9M'多种基于细胞的和非细胞的分析可被用于证明FGE专一结合。基于细胞的分析包括单、双和三杂交筛选，其中FGE介导的转录得到抑制或增加等的分析。非细胞分析包括FGE 蛋白结合分析、免疫分析等。其它对筛选结合FGE多肽的试剂有用的分析包括荧光共振能量转移(FRET)和电泳迁移改变分析(EMSA)。
根据本方面的另一方面，鉴别在调节本发明的分子的Ca-甲酰甘氨酸生成活性中有用的试剂的方法被提供。方法包括(a)将具有Ca-甲酰甘氨酸生成活性的分子与候选物质相接触，(b)测量该分子的Ca-甲酰甘氨酸生成活性，和(c)将测得的分子的Ca-甲酰甘氨酸生成活性与对照比较以确定是否候选物质调节分子的Ca-甲酰甘氨酸生成活性，其中分子是本发明的FGE核酸分子或其表达产物。“接触”指具有Ca-甲酰甘氨酸生成活性的分子与候选物质的直接和间接的接触。“间接”接触表示候选物质通过第三者试剂(例如信使分子，受体等)对分子的匕-甲酰甘氨酸生成活性施加了其影响。在一定实施方案中，对照是在缺乏候选物质时测得的分子Ca-甲酰甘氨酸生成活性。分析方法和候选物质如前述有关FGE的实施方案中所述。
根据本发明的另一方面，诊断以核酸分子、其表达产物或其表达产物片段的异常表达为特征的疾病的方法被提供。方法包括将从受试者中分离的生物样本与专一结合到核酸分子、其表达产物或其表达产物片段的试剂接触，并测定作为疾病判定依据的试剂和核酸分子或表达产物之间的相互作用，其中核酸分子是根据本发明的FGE分子。疾病是多种硫酸酯酶缺乏症。导致FGE分子异常表达的FGE基因中的突变引起下面的SEQ ID N0:2上的氨基酸改变MetlArg; MetlVal; Leu20Phe; Ser 155Pro; Alal77Pro; Cys218Tyr; Arg224Trp ;Asn259IIe;Pro266Leu;Ala279Val;Arg327Stop;Cys336Arg;Arg345Cys;Ala348Pro;Arg34 9Gln; Arg349Trp; Arg349Trp; Ser359Stop;或其组合。
在分子是核酸分子的情形中，这类测定能通过任何标准的核酸测定分析进行，包括聚合酶链式反应或在本文中作为例子的以标记性杂交探针进行的分析。在分子是核酸分子表达产物或核酸分子表达产物片段的情形中，这类测定能通过应用例如结合到任何多肽表达产物的抗体的任何标准的免疫分析而进行。
“异常表达”指FGE分子(核酸和/或多肽)相对于对照(即，相同分子在健康或 “正常”受试者中的表达)的减少的表达(表达不足)或增加的表达(过表达)。在本文中所用的“健康受试者”，指根据标准的医学标准没有出现多种硫酸酯酶缺乏症或具有发展多种硫酸酯酶缺乏症的风险的受试者。健康受试者也没有另外显现出病症。换句话说，如果被医学专业人员检查，这类受试者将被表征 为健康和不带多种硫酸酯酶缺乏症的症状。这些包括异常染性脑白质营养不良和粘多糖病的特征，例如在几种组织中的酸性粘多糖的量增加，轻微‘脂肪软骨营养不良’，快速神经性衰退，尿中的脑硫脂和粘多糖的过量存在，增加的脑脊液蛋白和外周神经中的髓磷脂的异染性退化。
本发明也提供新的试剂盒，其将被用于测量本发明的核酸和本发明的表达产物的水平。
在某一实施方案中，试剂盒包含包装，该包装包含下列物质选择性结合任何前述 FGE的分离的核酸或其表达产物的试剂，及用于与所述试剂和任何前述FGE的分离的核酸或其表达产物结合的测得值进行比较的对照。在某些实施方案中，对照是用于与测得值比较的预先测定值。在一定实施方案中，对照包含任何前述FGE的分离的核酸的表达产物的表位。在某一实施方案中，试剂盒进一步包含选择性结合选自下列的多肽的第二试剂艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶，硫酸胺酶，N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶，N-乙酰葡萄糖胺-6-硫酸酯酶，芳基硫酸酯酶A，芳基硫酸酯酶B，芳基硫酸酯酶C，芳基硫酸酯酶D，芳基硫酸酯酶 E，芳基硫酸酯酶 F，芳基硫酸酯酶 G，HSulf-1，HSulf-2，HSulf-3，HSulf-4，HSulf-5，和 HSulf-6,或其肽段，和用于与所述第二试剂和所述多肽或其肽段的结合的测得值进行比较的对照。
在核酸探测的情形中，用于扩增本发明的核酸分子的引物对可被包括进去。优选的试剂盒将包括对照，例如已知量的核酸探针、表位(例如艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶，硫酸胺酶，N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶，N-乙酰葡萄糖胺-6-硫酸酯酶，芳基硫酸酯酶A， 芳基硫酸酯酶B，芳基硫酸酯酶C，芳基硫酸酯酶D，芳基硫酸酯酶E，芳基硫酸酯酶F，芳基硫酸酯酶 G, HSulf-1, HSulf-2, HSulf-3, HSulf-4, HSulf-5,和 HSulf-6，表达产物)或抗表位的抗体，以及指南或其它复印材料。在一定的实施方案中，复印材料能基于分析结果而表征发展硫酸酯酶缺乏状态的风险。试剂可按预先测定的量被包在容器中和/或被涂在小孔上，而试剂盒可包括标准物质，例如标记好的免疫试剂(如标记好的抗-1gG抗体)和类似物。一种试剂盒是包好的用FGE蛋白涂层的聚苯乙烯微量滴定平板和含有标记好的抗人 IgG抗体的容器。平板的小孔与例如生物液体接触，清洗，然后与抗-1gG抗体接触。之后探测标记。体现本发明特征的试剂盒，通常以数字11指定，在图25中显示。试剂盒11包含下列主要元件包装15，本发明的试剂17，对照试剂19和指南21。包装15是用于盛含有本发明的试剂17的一个小瓶(或多个小瓶)，含有对照试剂19的一个小瓶(或多个小瓶)和指南21的类似盒子的结构。本领域技术人员可易于修饰包装15以适合个体的需要。
本发明也包含在受试者中治疗多种硫酸酯酶缺乏症的方法。方法包括对有这类治疗需要的受试者施用调节Ca-甲酰甘氨酸生成活性的试剂，用量为在受试者中有效增加 Ca-甲酰甘氨酸生成活性的量。在某些实施方案中，方法进一步包含一定试剂的共施用，所述试剂选自编码下列蛋白的核酸分子艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶，硫酸胺酶，N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶，N-乙酰葡萄糖胺-6-硫酸酯酶，芳基硫酸酯酶A，芳基硫酸酯酶B，芳基硫酸酯酶C，芳基硫酸酯酶D，芳基硫酸酯酶E，芳基硫酸酯酶F，芳基硫酸酯酶G，HSulf -1, HSulf-2, HSulf-3, HSulf-4, HSulf-5,和HSulf-6 ;核酸分子的表达产物，和/或核酸分子的表达产物的片段。
在本文中所用的“调节核酸或多肽的表达的试剂”在本领域中已知，指有义和反义核酸，显性失活核酸，多肽的抗体和类似物。调节分子表达(和如本文中所述的，调节其活性)的任何试剂根据本发明有用。在一定实施方案中，调节Ca-甲酰甘氨酸生成活性的试剂是本发明的分离的核酸分子(例如SEQ ID NO. 3的核酸)。在重要的实施方案中，调节Ca-甲酰甘氨酸生成活性的试剂是本发明的肽(例如SEQ ID NO. 2的肽)。在某些实施方案中，调节Ca-甲酰甘氨酸生成活性的试剂是本发明的有义核酸。
根据本发明的一个方面，在受试者中增加Ca-甲酰甘氨酸生成活性的方法被提供。方法包括对受试者施用本发明的分离的核酸分子和/或其表达产物，用量为在受试者中增加Ca-甲酰甘氨酸生成活性的有效量。
根据本发明的另一方面，增加细胞中的Ca-甲酰甘氨酸生成活性的方法被提供。 方法包括将细胞与本发明的分离的核酸分子(例如SEQ ID NO.1的核酸)，或其表达产物 (例如SEQ ID NO. 2的肽)接触，用量为在细胞中有效增加Ca-甲酰甘氨酸生成活性的量。 在重要的实施方案中，方法包括激活内源性的FGE基因以增加细胞中的Ca-甲酰甘氨酸生成活性。
在任何的前述实施方案中，核酸可被操作性地偶联到指导真核细胞例如HT-1080 细胞内的核酸分子表达的基因表达序列。“基因表达序列”是任何调节性的核苷酸序列，例如启动子序列或启动子一增强子组合，其促进它所可操作性地连接的核酸的有效转录和翻译。基因表达序列可以是，例如，哺乳动物或病毒的启动子如组成型或可诱导型的启动子。 组成型的哺乳动物启动子包括但不限于下列基因的启动子次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶 (HPTR),腺苷脱氨酶，丙酮酸激酶，a-肌动蛋白启动子和其它组成型启动子。可作为范例的在真核细胞中组成性地发挥功能的病毒启动子包括，例如，来自猿猴病毒，乳头状瘤病毒，腺病毒，人免疫缺陷病毒(HIV)，劳斯肉瘤病毒，细胞巨化病毒，莫洛尼氏白血病毒的长末端重复序列(LTR)和其它逆转录病毒的启动子，和单纯疱疹病毒的胸苷激酶启动子。其它组成型启动子为本领域一般技术人员所知。作为本发明的基因表达序列而有用的启动子也包括可诱导的启动子。可诱导的启动子在诱导剂存在时被活化。例如，金属硫蛋白启动子在一定的金属离子存在时被激活而增加转录和翻译。其它可诱导的启动子为本领域一般技术人员所知。
一般而言，基因表达序列将包括(如果必要)分别涉及转录和翻译起始的5’非转录和5’非翻译序列，例如TATA盒，加帽序列，CAAT序列和类似物。尤其是，这类5’非转录序列将包括启动子区域，所述启动子区域包括用于对可操作性连接的核酸进行转录控制的启动子序列。基因表达序列可选性地包括所期望的增强子序列或上游激活子序列。
优选任何本发明的FGE核酸分子连接到允许核酸分子在特定细胞系的细胞如神经细胞中表达的基因表达序列。允许核酸分子在细胞如神经细胞中表达的序列，是在这类细胞类型中选择性地有活性从而引起核酸分子在这些细胞中表达的类型。例如，突触蛋白-1启动子能被用于在神经细胞中表达任何前述的本发明的核酸分子；而例如von Willebrand因子基因启动子能被用于在血管内皮细胞中表达核酸分子。本领域中一般技术人员将能易于鉴别能在本发明的任何优选细胞中表达核酸分子的替代性的启动子。
当它们以将核酸编码序列(例如，在FGE的情形中，SEQ ID NO. 3)的转录和/或翻译置于基因表达序列的影响或控制下这样的方式而被共价连接时，核酸序列和基因表达序列被表述为“可操作性地连接”。如果期望核酸序列被翻译成为功能性蛋白，并且如果在 5’基因表达序列中的启动子的诱导导致核酸序列的转录，且如果在两个DNA序列之间的连接的本性不会(2)导致移码突变的引入，(2)干扰启动子区域指导核酸序列转录的能力，和 /或(3)干扰对应的RNA转录产物翻译成为蛋白质的能力时，两个DNA序列被表述成可操作性地连接。因此，如果基因表达序列能影响核酸序列的转录以至于得到的转录产物可被翻译成为所期望的蛋白质或多肽，则基因表达序列将被认为可操作性地连接到核酸序列。
本发明的分子能单独的或与载体(也见对于载体的更早的讨论)一起被运送到本发明优选细胞类型。按其最广泛的含义(且与本文中其它部分对表达和靶向载体的描述一致)，“载体”是能促进(1)分子到靶细胞的运送，和/或⑵分子被靶细胞的吸取，的任何载体。优选运送载体以有所减少的降解运输分子到靶细胞中，所述有所减少的降解相对于载体缺乏时所产生的降解的程度而言。可选地，“靶向配体”能被附着于载体以选择性地将载体运送到其表面表达靶向配体的相关受体的细胞。以这种方式，载体(含有核酸或蛋白质) 能被选择性地运送到神经细胞。祀向的方法包括缀合，例如那些在Priest的U. S. Patent 5，391，723中所述的。另一众所周知的靶向载体的实例是脂质体。脂质体从Gibco BRL可商业性地获得。生产靶向脂质体的多种方法被发表。
一般而言，在本发明中有用的载体包括但不限于质粒，噬菌粒，病毒，源于病毒或细菌来源的其它载体，所述其它载体已通过本发明核酸序列和能被附着到本发明的核酸序列的另外的核酸片段(例如增强子、启动子)的插入或整合而被操作。病毒载体是载体的优选类型，包括但不限于来自下列病毒的核酸序列腺病毒；腺伴随病毒；逆转录病毒，例如鼠莫洛尼白血病毒；鼠哈维肉瘤病毒；鼠乳腺肿瘤病毒；劳斯肉瘤病毒；SV40-型病毒； 多瘤病毒；EB病毒；乳头状瘤病毒；疱疫病毒；牛痘病毒；脊髓灰质炎病毒；和RNA病毒例如逆转录病毒。也能容易地采用没有指出但在本领域中已知的其它载体。
对某些应用特别优选的病毒是腺伴随病毒，一种双链DNA病毒。腺伴随病毒能感染广泛的细胞类型和物种，且能被工程化为复制缺陷型。它进一步地具有优点例如热和脂溶剂稳定性、在多种株系细胞包括造血细胞中的高转导频率，和缺乏超感染抑制因此而允许多重系列的转导。经报道，腺伴随病毒能以位点特异的方式整合进人细胞DNA，从而将插入性基因突变的可能性和插入基因的表达的可变性最小化。此外，野生型腺伴随病毒感染已在组织培养物中于缺乏选择压力的条件下存在超过100代，意味着腺伴随病毒基因组整合是相对稳定的事件。腺伴随病毒也能以染色体外方式发挥功能。
一般而言，其它优选的病毒载体基于非细胞病变性真核病毒，在这些病毒中非必需基因已被目的基因所替代。非细胞病变性病毒包括逆转录病毒，其生命周期包括基因组病毒RNA到DNA的逆转录及随后的前病毒整合到宿主细胞DNA中。腺病毒和逆转录病毒已被许可用于人基因治疗的试验。一般而言，逆转录病毒是复制缺陷型(即，能指导所需蛋白的合成，但不能制造出感染性的颗粒)。这类基因改变的逆转录病毒表达载体具有对基因在体内的高效转导的一般性用途。产生复制缺陷型逆转录病毒的标准流程(包括步骤外源性遗传物质整合进质粒，质粒对包装细胞系的转染，重组性逆转录病毒通过包装细胞系的产生，从组织培 养基中收集病毒颗粒和病毒颗粒对靶细胞的感染)在Kriegler，M.，“Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, , W. H. Freeman C. 0. , New York (1990)和 Murry, E. J. EcL “Methods in Molecular Biology, ”卷7，Humana Press Inc. , Cliffton, New Jersey(1991)中被提供。
另一优选的逆转录病毒载体是源自鼠莫洛尼白血病毒的载体，如在Nabel，E. G.等，Science，1990，249:1285-1288中所述的。这些载体据报道对基因运送到动脉壁的所有三层(包括中间层)都有效。其它优选载体在Flugelman等，Circulation,1992,85:1110-1117中公开。另外的对运送本发明的分子有用的载体在U. S. Patent No. 5，674，722 中被 Mulligan 等描述。
除前述载体外，其它传送方法可被用于传送本发明的分子到细胞例如神经细胞， 肝，成纤维细胞，和/或血管内皮细胞，并促进在那里的吸收。
本发明的优选的这类运送方法是胶态分散体系统。胶态分散体系统包括基于脂质的系统，包括水包油乳液，微囊，混合微囊，和脂质体。本发明优选的胶态系统是脂质体。脂质体是人造膜容器，其作为体内或体外的运送载体而有用。已有显示，大小范围在O. 2-4. Oym的单层容器(LUV)能包裹进大的大分子。RNA，DNA和完整病毒粒子能被封装在含水内部，并以生物活性形式运送到细胞中(Fraley等，Trends Biochem. Sc1.，1981,6:77)。为了脂质体是有效的基因转运载体，一种或更多的下列特征应具备(I) 目的基因高效被封装，而保持生活活性；(2)相对于非靶细胞的与靶细胞的优选和牢固的结合；(3)囊泡的水内容物到靶细胞细胞质的高效运送；和(4)遗传信息的准确和有效表达。
脂质体可通过脂质体到特异配体例如单克隆抗体，糖，糖脂，或蛋白质的偶联， 而靶向于特定组织，例如心肌或血管细胞壁。可对靶向脂质体于血管壁有用的配体包括但不限于，仙台病毒的病毒衣壳蛋白。此外，载体可偶联到核靶向性肽上，其将定向核酸到宿主细胞核。
脂质体可从Gibco BRL商业性地获得，例如由阳离子脂质如N-[l-(2，3双油氧基)_丙基]-N，N，N-三甲基氯化铵(DOTMA)和二甲基双十八烷基溴化铵(DDAB)形成的 LIP0FECTIN 和LIP0FECTACE 。生产脂质体的方法在本领域中众所周知，也在许多出版物中被描述。脂质体也已被 Gregoriadis, G.在 Trends in Biotechnology,卷 3，235-241 页 (1985)中所回顾。用于大分子包括核酸的细胞内运送的新的脂质体也在PCT国际申请PCT/ US96/07572 (公开号 W096/40060,名称为“ Int racellular Delivery of Macromolecules”) 中被描述。
在一个特定的实施方案中，优选的载体是适合植入哺乳动物受体的生物相容性的微颗粒或植入物。作为范例的根据此方法而有用的生物侵蚀性植入物在PCT国际申请PCT/ US/03307(公开号 W095/24929,名称为“Polymeric Gene Delivery System”，其要求 1994 年3月15日提交的美国专利申请系列号213，668的优先权)中被描述。PCT/US/0307描述了用于包含(受适当的启动子调控的)外源性基因的生物相容性的聚合性基质，优选生物降解性的聚合性基质。聚合性基质被用于实现外源性基因在患者中的持续性释放。根据本发明，在此所述的核酸在PCT/US/03307中所公开的生物相容性优选生物降解性的聚合性基质中被封装或分散。聚合性基质优选微颗粒形式例如微球体(其中核酸被分散到整个固体聚合性基质中)或微囊(其中核酸被储存在聚合性壳的核心中)。包含本发明的核酸的聚合性基质的其它形式包括膜，涂层，胶，植入物和支架。聚合性基质装置的大小和组成被选作引起基质装置被植入的组织中的良好的释放动力学。进一步设计的聚合性基质的大小根据将被应用的运送方法而选择，所述运送方法典型地是组织注射或悬浮液通过雾化施用到鼻部和/或肺部区域。聚合性基质组合物能被选成同时具有良好的降解速率，及由生物粘附性物质形成，以在设计物被施用到血管表面时进一步增加转运的有效性。基质组合物也能被选成不降解，但更适合通过持续相当一段时间的扩散而释放。
非生物降解性和生物降解性的聚合性基质都能被用作将本发明的核酸运送到受试者。优选生物降解性基质。这类聚合物可以是自然或合成性的聚合物。优选合成性聚合物。根据释放所需要的时间长度而选择聚合物，一般是几个小时到一年或更长时间的级别。 典型地，范围从几个小时到三至十二个月的时间长度的释放最合意。聚合物可选性地是能吸收高到其重量的约90%的水的水凝胶的形式，而进一步地，可选性地与多价离子或其它聚合物交联。
一般而言，本发明的核酸应用生物侵蚀性植入物以扩散方式而被运送，或更优选地，通过聚合性基质的降解。作为范例的能被用于形成生物降解性运送系统的合成性聚合物包括聚酰胺，聚碳酸酯，聚亚烷基，聚亚烷基二醇，聚环氧烷，聚亚烷基对苯二酸酯， 聚乙烯醇，聚乙烯醚，聚乙烯酯，聚-乙烯卤化物，聚乙烯吡咯烷酮，聚乙交酯，聚硅氧烷，聚氨基甲酸乙酯和其共聚物，烷基纤维素，羟基烷基纤维素，纤维素醚，纤维素酯， 硝基纤维素，丙烯酸酯和甲基丙烯酸酯的聚合物，甲基纤维素，乙基纤维素，羟丙基纤维素，羟丙基甲基纤维素，羟丁基甲基纤维素，醋酸纤维素，丙酸纤维素，纤维素醋酸丁酸酯，纤维素醋酸邻苯二甲酸酯，羧乙基纤维素，三醋酸纤维素，纤维素硫酸钠盐，聚(甲基异丁烯酸酯)，聚(乙基异丁烯酸酯)，聚(丁基异丁烯酸酯)，聚(异丁基异丁烯酸酯)，聚(己基异丁烯酸酯)，聚(异癸基异丁烯酸酯)，聚(十二烷基异丁烯酸酯)，聚(苯基异丁烯酸酯)，聚 (甲基丙烯酸酯)，聚(异丙基丙烯酸酯)，聚(异丁基丙烯酸酯)，聚(十八烷基丙烯酸酯)，聚乙烯，聚丙烯，聚(乙二醇)，聚(环氧乙烷)，聚(对苯二甲酸乙二酯)，聚(乙烯醇)，聚乙烯醋酸，聚氯乙烯，聚苯乙烯和聚乙烯吡咯烷酮.
非生物降解性聚合物的实例包括亚乙基乙烯醋酸，聚(甲)丙烯酸，聚酰胺，其共聚物和混合物。
生物降解性聚合物的实例包括合成性聚合物例如乳酸和乙二酸的聚合物，聚酸酐，聚(原)酸酯，聚氨基甲酸乙酯，聚(丁酸)，聚(戊酸)，聚(丙交酯-共己内酯)，天然聚合物例如藻酸和其它多糖包括葡聚糖和纤维素，胶原，其化学衍生物(化学基团例如，烷基， 亚烷基，羟化，氧化的取代和增加，和其它由本领域技术人员常规进行的修饰)，白蛋白和其它亲水蛋白质，玉米醇溶蛋白和其它醇溶谷蛋白及疏水蛋白质，其共聚物和混合物。一般而言，这些物质或者通过酶水解或者在体内暴露于水时通过表面或整体侵蚀而降解。
特别受关注的生物粘附性聚合物包括H. S. Sawhney, C. P. Pathak和J. A. Hubell在 Macromolecules, 1993，26，581-587中所述的生物侵蚀性水凝胶，其教导在此被整合，聚透明质酸，酪蛋白，明胶，谷胶酪蛋白，聚酸酐，聚丙烯酸，藻酸，脱乙酰壳多糖，聚(甲基异丁烯酸酯)，聚(乙基异丁烯酸酯)，聚(丁基异丁烯酸酯)，聚(异丁基异丁烯酸酯)，聚(己基异丁烯酸酯)，聚(异癸基异丁烯酸酯)，聚(十二烷基异丁烯酸酯)，聚(苯基异丁烯酸酯)，聚 (甲基丙烯酸酯)，聚(异丙基丙烯酸酯)，聚(异丁基丙烯酸酯)，和聚(十八烷基丙烯酸酯)。 因此，本发明提供用作药物的本发明的上述分子的组合物，制备此药物的方法和在体内用于持续释放药物的方法。
压缩试剂也能与本发明的载体结合应用。在本文中所用的“压缩试剂”指试剂例如组蛋白，它中和核酸上的负电荷从而允许核酸压缩成细颗粒。核酸的压缩促进了核酸被靶细胞的吸收。压缩试剂能单独使用，即以被细胞更有效地吸收的形式运送分离的本发明的核酸或，更优选地，与一种或更多上述载体组合。
其它作为范例的能被用于促进靶细胞对本发明的核酸的吸收的组合物包括磷酸钙及细胞内运输、微注射组合物和电穿孔的其它化学调节物。本发明包含在细胞中增加硫酸酯酶活性的方法。这类方法包括以有效地在细胞中增加硫酸酯酶活性的量将分离的本发明的核酸分子(例如如权利要求1-8中任一项所要求的分离的核酸分子，具有选自 SEQ ID NO: 1，3，4，45，47，49，51，53，55，57，59，61，63，65，67，69，71，73，75，77，和80-87的序列的FGE核酸分子)或其表达产物(例如如权利要求11-15，19，20 中所要求的多肽或具有选自 SEQ ID NO. 2，5，46，48，50，52，54，56，58，60，62，64，66，68，70，72，74，76，和78的序列的肽)与表达硫酸酯酶的细胞接触。在本文中所用的“增加”硫酸酯酶活性，指增加的对硫酸酯酶的特异性底物的亲合性和/或对其的转化，典型地导致硫酸酯酶分子上的FGly的形成的增加。在某一实施方案中，细胞以比野生型细胞更高的水平表达硫酸酯酶。“在细胞中增加硫酸酯酶活性”也指增加细胞所分泌的硫酸酯酶的活性。细胞可表达内源性和/或外源性的硫酸酯酶。与FGE分子的所述接触也指激活细胞的内源性FGE基因。在重要的实施方案中，内源性硫酸酯酶被活化。在一定实施方案中，硫酸酯酶是艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶，硫酸胺酶，N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶，N-乙酰葡萄糖胺-6-硫酸酯酶，芳基硫酸酯酶A，芳基硫酸酯酶B，芳基硫酸酯酶C，芳基硫酸酯酶D，芳基硫酸酯酶E，芳基硫酸酯酶F，芳基硫酸酯酶G，HSulf-l，HSulf-2，HSulf-3，HSulf-4, HSulf-5,和/或HSulf-6。在一定的实施方案中，细胞是哺乳动物细胞。根据本方面的另一方面，药物组合物被提供。组合物以药学上有效治疗硫酸酯酶缺乏症的量包含细胞产生的硫酸酯酶，也包含药学上可接受的载体，其中所述细胞已与包含分离的本发明的核酸分子(例如如权利要求1-8所要求的分离的核酸分子或具有选自SEQ ID NO:1, 3，4，45，47, 49，51，53，55，57，59，61，63，65，67，69，71，73，75，77，和 80-87 的序列的核酸分子)或其表达产物(例如选自SEQ ID NO. 2，5，46，48，50，52，54，56，58，60，62，64，66，68，70，72，74，7 6，和78的肽)的试剂接触。在重要的实施方案中，硫酸酯酶以高于正常/对照细胞的水平表达。本发明也包含产生硫酸酯酶的细胞，其中细胞所产生的活性硫酸酯酶对总硫酸酯酶的比率增加。细胞包含(i)相对于对照具有增加的活性的硫酸酯酶，和(ii)相对于对照具有增加的活性的甲酰甘氨酸生成酶，其中相对于甲酰甘氨酸生成酶缺乏的细胞所产生的活性硫酸酯酶对总硫酸酯酶的比率，细胞所产生的活性硫酸酯酶对总硫酸酯酶的比率增加至少5%。在本领域中已知,硫酸酯酶的过表达能减少内源性硫酸酯酶的活性(Anson等，Biochem. J.，1993，294:657-662)。此外，仅有重组硫酸酯酶的一部分有活性。出乎意料地，我们发现在具有硫酸酯酶的增加的表达/活性的细胞中，FGE增加的表达/活性导致更有活性的硫酸酯酶的产生。既然FGly在硫酸酯酶分子上的存在与硫酸酯酶活性相关，则“有活性的硫酸酯酶”就能通过应用MALD1-T0F质谱(如本文中其它部分所描述的)对FGly在硫酸酯酶细胞产物上的存在的测定而定量。然后对总硫酸酯酶的比率能很容易测定。本发明也提供用于硫酸酯酶缺乏症的诊断和治疗的方法。这类疾病包括但不限于，多种硫酸酯酶缺乏症，粘多糖病II(MPS II;Hunter综合症)，粘多糖病IIIA (MPSIIIA; Sanfilippo 综合症 A),粘多糖病 VIII(MPS VIII),粘多糖病 IVA (MPS IVA; Morquio综合症A)，粘多糖病VI (MPS VI; Maroteaux-Lamy综合症)，异常染性脑白质营养不良(MLD)，X-连锁的隐性点状软骨发育不全1，和X-连锁的鱼鳞病(类固醇硫酸酯酶缺乏症)。
本发明的方法在对任何前述病症的急性或预防性治疗中都有用。在此所用的急性治疗指对具有特定病症的受试者的治疗。预防性治疗指对可能具有此病症但现在并没有或并未经历此病症的症状的受试者的治疗。就其最广泛的意义而言，术语“治疗”表示急性和预防性治疗两者。如果需要治疗的受试者正经历病症(或具有或正具有特定病症)，那么治疗病症指改善、减弱或消除病症或来自病症的一种或更多的症状。在某些优选的实施方案中，治疗此病症指改善、减弱或消除与病症相关的特异的症状或特异亚型的症状。如果需要治疗的受试者是可能具有此病症的受试者，那么对受试者治疗指减小受试者产生此病症的风险。本发明的治疗剂的施用模式和剂量将随着被治疗的病症的特定阶段、被治疗的受试者的年龄和生理状态、同时进行的治疗(如果有)的本性、施用的特定途径和在医学实践者的知识和专业技术范围内的类似因素而变化。如本文中所述的，本发明的试剂以治疗任何前述硫酸酯酶缺乏症的有效量而被施用。一般而言，有效量是能引起受试者的所期望的组织中的有益变化的任何量。有效量优选在特定病症中足以弓I起良好表型变化例如症状或病症的整体性减轻、缓和或消除的量。—般而言，有效量是药学制剂单独或与进一步的药剂一起产生出所期望的反应那样的量。这可包括只短暂减慢病症的进程，虽然更优选它包括长期性地阻止病症进程，或延缓病症的发作，或防止病症发生。这可通过常规方法监测。一般地，活性化合物的剂量将从约0. 01mg/kg每天到1000mg/kg每天。期望范围在50 u g-500mg/kg的剂量将是适合,优选口服和每天施用一次或几次。当然，这类量将取决于被治疗的特定病症，病症的严重程度，患者个体的参数包括年龄、生理状况、身材尺寸和体重，治疗的持续时间，同时进行的治疗(如果有)的本性，施用的特异途径和在医学实践者的知识和专业技术范围内的类似因素。低剂量将源自施用的一定形式，例如静脉内施用。在应用初始剂量时受试者中的反应不充分的情形中，更高的剂量(或通过不同的更局部化的运送途径的有效更高剂量)可应用到患者耐受力所允许的程度。每天多重剂量被预期能 实现化合物的合适的系统水平。一般地，优选应用最大剂量，也就是，根据合理的医学判断的最高安全剂量。然而将被本领域中一般技术人员所理解的是，患者可出于医学原因、心理原因或事实上的其它任何原因而坚持较低剂量或可耐受性剂量。本发明的试剂可选性地与药学上可接受的载体组合以形成药学制剂。在本文中所用的术语“药学上可接受的载体”表示适合对人施用的一种或更多相容性的固体或液体填充物、稀释剂或封装物质。术语“载体”表示天然或合成性的有机或无机成分，活性成分与其组合以促进应用。药学组合物的成分也能被与本发明的分子共混合，及彼此混合，其方式是确保没有实质性破坏所期望的药学效力的相互作用存在。在某些方面，药学制剂以有效治疗疾病的量包含本发明的试剂。药学制剂可包含合适的缓冲剂，包括盐形式的醋酸、盐形式的柠檬酸、盐形式的硼酸或盐形式的磷酸。药学组合物可选性地，也可包含合适的防腐剂例如苯扎氯；氯代丁醇；对轻基苯甲酸酯或乙基萊硫代水杨酸钠(thimerosal)。多种施药途径可用。当然，选出的特定模式将取决于选定的特定药物，被治疗的病症的严重程度和治疗效力所需的剂量。本发明的方法，一般而言，可应用医学上可接受的任何施用模式，即产生活性化合物的有效水平而不引起临床上无法接受的不利效应的有意义的任何模式而实行。施用的这类模式包括口服，直肠，局部，鼻，皮内，经皮，或非肠道途径。术语“非肠道的”包括皮下，静脉内，intraomental，肌肉内，或输注。静脉内或肌肉内途径不是特别适合长期性治疗和预防。作为实例，用于对具有偏头痛的受试者的急性治疗的药学组合物可配制成多种不同的方式和多种施用模式，包括片剂，胶囊，粉末，栓齐U，注射液和鼻喷雾剂。药学制剂可方便地以单位剂型存在，也可通过任何制药领域中众所周知的方法制备。所有方法包括将活性试剂与载体相连的步骤，所述载体组成了一种或更多附属成分。一般而言，组合物通过统一地和密切地将活性化合物与液体载体、很好地分隔的固体载体或同时二者相连而制备，然后如果需要，将产物定形。适合口服施用的组合物可作为离散性单位存在，例如胶囊，片剂，锭剂，每一个都包含预定量的活性化合物。其它组合物包括水性或非水性的悬浮液例如糖浆，酏剂或乳剂。适合非肠道施用的组合物方便地包含消毒过的本发明试剂的水制剂，其优选与接受者的血液等渗。此水制剂可根据已知方法应用合适的分散或润湿剂和悬浮试剂进行配制。无菌的可注射性制剂也可是非毒性的注射用可接受的稀释剂或溶剂中的无菌的注射溶液或悬浮液，例如在1，3- 丁二醇中的溶液。可接受的可用载体和溶剂有水、Ringer’ s溶液和等渗氯化钠溶液。此外，无菌的固定油传统上被用作溶剂或悬浮介质。为了这一目的，任何温和的固定油可被应用，包括合成性的甘油单酯或双酯。此外，脂肪酸例如油酸可在可注射的制剂中应用。适合口服，皮下，静脉内，月几肉内等施用的配方能在Remington’ sPharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. , Easton, PA 中找至丨J。根据本发明的一个发明，用于在细胞中增加Ca-甲酰甘氨酸生成活性的方法被提供。方法包括将分离的本发明的核酸分子(例如SEQ ID NO.1的核酸)或其表达产物(例如SEQ ID NO. 2的肽)以在细胞中增加(。-甲酰甘氨酸生成活性的有效量与细胞接触。在重要的实施方案中，方法包括激活`内源性FGE基因以在细胞中增加Ca-甲酰甘氨酸生成活性。在某些实施方案中，接触在允许本发明的分子进入细胞的条件下进行。根据本发明的术语“允许分子进入”细胞具有下面基于分子本性的含义。对分离的核酸，它用于描述核酸通过细胞膜而进入细胞核，在其基础上“核酸转基因”能利用细胞机制产生核酸所编码的功能多肽。“核酸转基因”用于描述所有的有或没有相连载体的本发明的核酸。对于多肽，它用于描述多肽通过细胞膜进入细胞质，及如果需要，对细胞的细胞质机制的利用以功能性地修饰多肽(例如修饰成活性形式)。多种技术可被用于将本发明的核酸引入细胞，其依赖于核酸是在体外还是体内而被引入宿主。这类技术包括核酸-CaPO4沉淀的转染，与DEAE相连的核酸的转染，包括目的核酸的逆转录病毒的转染，脂质体介导的转染和类似方法。对于一定的应用，优选将核酸靶向于特定细胞。在这类例子中，用于将本发明的核酸运送进细胞的载体(例如逆转录病毒或其它病毒；脂质体)可以具有附着于其上的靶向分子。例如，分子例如对靶细胞上的表面膜蛋白专一的抗体或靶细胞上的受体的配体能被固定到核酸运送载体上或整合在其中。例如，脂质体被用于运送本发明的核酸的情形中，结合到与内吞作用相关的表面膜蛋白的蛋白质可被整合进用于靶向和/或促进吸收的脂质体的配剂。这类蛋白质包括对特定细胞类型有亲和力的衣壳蛋白或其片段，针对循环中经历内化的蛋白质的抗体，靶向细胞内定位和增强细胞内半衰期的蛋白质，和类似物。聚合性运送系统也已被成功用于运送核酸进入细胞，如本领域技术人员所已知的。这类系统甚至允许核酸的口服运送。其它运送系统能包括定时释放性、延迟释放性或持续释放性运送系统。这类系统能避免本发明的试剂的重复施用，增加对受试者和医生的方便性。多种类型的释放运送系统可用，且为本领域一般技术人员所已知。它们包括以聚合物为基础的系统例如聚(丙交酯-乙交酯)，共聚草酸，聚己内酯，聚酯酰胺，聚原酸酯，聚羟基丁酸和聚酸酐。包含药物的前述聚合物的微囊在例如U. S. Patent 5，075，109中被描述。运送系统也包括非聚合物系统脂类，包括固醇例如胆固醇，胆固醇酯和脂肪酸或中性脂肪例如单-二-和三-甘油酯；水凝胶释放系统；SylaStic系统；以肽为基础的系统；蜡涂层；应用传统粘合剂和赋形剂的压制成的药片；部分融合的植入物；和类似物。具体的实例包括但不限于(a)本发明的试剂以某一形式被包含在基质内的侵蚀性系统例如U. S. PatentNos. 4，452，775，4，675，189和5，736，152中所描述的那些类型，和(b)活性成分以受控的速率从聚合物中渗出的扩散系统例如U. S. Patent Nos. 3，854，480，5，133，974和5，407，686中所述的。此外，以泵为基础的硬件运送系统能被应用，其中部分适于植入。长期持续释放性植入物的应用可以是合乎期望。在本文中所用的长期释放，表示植入物被构建和计划成至少30天运送治疗水平的活性成分，优选60天。长期持续释放性植入物是本领域中一般技术人员众所周知的，包括部分上述的释放系统。具体的实例包括但不限于，在U. S. Patent No. 4，748，024和加拿大No. 1330939中所述的长期持续释放性植入物。

本发明也包括本发明的FGE分子之外的试剂的施用，和在某些实施方案中的共施用，所述试剂当以有效剂量施用时可与本发明的分子合作性地、加成性地或协同性地起作用，以(i)调节Ca-甲酰甘氨酸生成活性，和(ii)治疗涉及本发明分子的(。-甲酰甘氨酸生成活性的任何病症(例如硫酸酯酶缺乏症包括多种硫酸酯酶缺乏症)。本发明的分子之外的试剂包括艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶，硫酸胺酶，N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶，N-乙酰葡萄糖胺-6-硫酸酯酶，芳基硫酸酯酶A，芳基硫酸酯酶B，芳基硫酸酯酶C，芳基硫酸酯酶D，芳基硫酸酯酶E，芳基硫酸酯酶F，芳基硫酸酯酶G，HSulf-1, HSulf-2, HSulf-3, HSulf-4, HSulf-5,或HSulf-6，(核酸和多肽，和/或其片段)，和/或其组合。在本文中所用的“共施用”指同时施用两种或更多的本发明的化合物(例如已知在对例如硫酸酯酶缺乏症的治疗中有益的FGE核酸和/或多肽和试剂，——例如治疗MPSII中的艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶)，其作为单一组合物中的混合物，或以足够的时间间隔顺序施用以至于化合物可发挥出相加性或甚至协同性的效力。本发明也包含固相核酸分子阵列。阵列基本上由固定于固体基质的一套核酸分子、其表达产物或其(或者核酸或者多肽分子的)片段组成，每一核酸分子选自FGE，艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶，硫酸胺酶，N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶，N-乙酰葡萄糖胺-6-硫酸酯酶，芳基硫酸酯酶A，芳基硫酸酯酶B，芳基硫酸酯酶C，芳基硫酸酯酶D，芳基硫酸酯酶 E，芳基硫酸酯酶 F，芳基硫酸酯酶 G，HSulf-1，HSulf-2，HSulf-3，HSulf-4，HSulf-5，和HSulf-6。在某些实施方案中，固相阵列进一步包含至少一种对照核酸分子。在一定实施方案中，这套核酸分子包含至少一种，至少两种，至少三种，至少四种或甚至至少五种核酸分子，每一种选自FGE，艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶，硫酸胺酶，N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶，N-乙酰葡萄糖胺-6-硫酸酯酶，芳基硫酸酯酶A，芳基硫酸酯酶B，芳基硫酸酯酶C，芳基硫酸酯酶D，芳基硫酸酯酶E，芳基硫酸酯酶F，芳基硫酸酯酶G，HSulf-l，HSulf-2，HSulf-3, HSulf-4, HSulf-5,和HSulf-6。在优选的实施方案中，这套核酸分子包含最多100种不同核酸分子。在重要的实施方案中，这套核酸分子包含最多10种不同核酸分子。根据此发明，标准的微阵列技术的杂交技术被用于评估核酸表达的模式和鉴别核酸表达。微阵列技术，其也称为其它名字，包括DNA芯片技术，基因芯片技术和固相核酸阵列技术，为本领域一般技术人员已知，并基于但不限于，获得在固定的基质上的已鉴别出的核酸探针的阵列(例如在本文中其它部分所述如FGE，艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶，硫酸胺酶，N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶，N-乙酰葡萄糖胺-6-硫酸酯酶，芳基硫酸酯酶A，芳基硫酸酯酶B，芳基硫酸酯酶C，芳基硫酸酯酶D，芳基硫酸酯酶E，芳基硫酸酯酶F，芳基硫酸酯酶 G, HSulf-1, HSulf-2, HSulf-3, HSulf-4, HSulf-5,和 / 或 HSulf-6 的分子)，以报告分子(例如放射性的，化学发光的，或荧光性的标记例如荧光素，Cye3-dUTP或Cye5-dUTP)标记靶分子，将靶核酸与探针杂交，和评估靶一探针的杂交。一般而言，具有与靶序列完全匹配的核酸序列的探针，将比不完全匹配的探针检测到更强的报告分子信号。在核酸微阵列技术中应用的多种成分和技术在The Chipping Forecast,Nature Genetics,卷21，Jan1999中呈现，其全部内容在本文中被整合作为参考。根据本发明，微阵列基质可包括但不限于玻璃，硅土，铝硅酸盐，硼硅酸盐，金属氧化物例如氧化铝和氧化镍，多种粘土，硝基纤维素或尼龙。在所有实施方案中，优选玻璃基质。根据本发明，探针选自核酸，其包括但不限于DNA，基因组DNA，cDNA和寡核苷酸；且可以是天然的或合成的。寡核苷酸探针优选20到25聚体寡核苷酸，而DNA/cDNA探针优选长度为500到5000个碱基，虽然其它长度也可被应用。合适的探针长度可被本领域一般技术人员通过本领域内已知的程序而测定。在某一实施方案中，优选的探针是以SEQID NOs:1, 3, 4, 6, 8, 10,和/或12给出的核酸分子中的两种或更多的组合。探针可应用本领域一般技术人员已知的标准方法例如凝胶过滤或沉淀纯化，以除去污染物。

在某一实施方案中，微阵列基质可用化合物涂层以增强探针在基质上的合成。这类化合物包括但不限于，寡聚乙二醇。在另一实施方案中，基质上的偶联试剂或基团能被用于共价连接第一核苷酸或寡核苷酸到基质。这些试剂或基团可包括但不限于氨基，羟基，溴基和羧基。这些活性基团优选通过烃基例如亚烷基或亚苯基二价基团附着于基质，一个化合价位置被链连接占据而余下的一个附着到活性基团。这些烃基基团可包含多至约10个碳原子，优选多至约6个碳原子。亚烷基通常优选在主链中包含2到4个碳原子。本方法的这些和另外的细节在例如U. S. Patent 4，458，066中被公开，其全部内容被整合作为参考。在某一实施方案中，应用方法例如光导向的化学合成、光化学去保护或核苷酸前体到基质的运送及随后的探针产生，探针以预先确定的栅格模式直接在基质上被合成。在另一实施方案中，基质可用化合物涂层以增强探针与基质的结合。这类化合物包括但不限于聚赖氨酸，氨基娃烧，氨基-反应性娃烧(Chipping Forecast, 1999)或铬(Gwynne和Page，2000)。在此实施方案中，预合成的探针以精确的、预先确定体积的和栅格的模式被应用于基质，利用了计算机控制的机器人将探针以接触打印方式或非接触方式例如喷墨或压电运送而应用于基质。以包括但不限于UV照射的方法，探针可共价连接到基质。在另一实施方案中，探针热连接到基质。靶标是选自包括但不限于下列的核酸DNA，基因组DNA, cDNA, RNA, mRNA,且可以是天然的或合成性的。在所有实施方案中，优选来自被怀疑为发展或具有硫酸酯酶缺乏症的受试者的核酸分子。在本发明的一定的实施方案中，一种或更多对照核酸分子被附着于基质。优选地，对照核酸分子允许了对包括但不限于下列的因素的测定核酸质量和结合特征；试剂质量和有效性；杂交成功性；和分析阈值和成功性。对照核酸可包括但不限于，基因如管家基因的表达产物或其片段。为选择一套硫酸酯酶缺乏疾病的标记物，优选分析由例如基因表达的微阵列分析产生的表达数据，以确定在不同患者类别(每一患者类别是一种不同的硫酸酯酶缺乏疾病)中的哪个基因是显著差异性地表达。基因表达的显著性可应用Permax计算机软件被测定，虽然任何能区分表达的显著差异的标准统计包也可被使用。Permax实现了对数据的大规模阵列的排列双样本t-检验。对于观察中的高维度载体，Permax软件计算了对每一属性的t-统计，并应用全部属性的最大值与最小值的排列分布评估了显著性。主要应用是确定两组之间差异最大的属性(基因)(例如对照的健康受试者和具有特定硫酸酯酶缺乏症的受试者)，应用t-统计的值测量“最大差异”和它们的显著性水平。硫酸酯酶缺乏疾病相关性核酸分子的表达也能应用蛋白测量方法测定，以测定SEQ ID NOs: 2的表达，例如通过测定SEQ ID NOs:1和/或3编码的多肽的表达。特异和定量测量蛋白质的优选方法包括但不限于基于质谱的方法例如表面增强的激光解吸电离(SELDI;例如Ciphergen蛋白质芯片系统)，非基于质谱的方法，和基于免疫组织化学的方法例如二维凝胶电泳。通过本领域一般技术人员已知的程序，SELDI方法可被用于蒸发显微量的蛋白，和创造个体蛋白质的“指纹”，从而 允许对在单一样本中的多种蛋白质的含量的同时测量。优选地，基于SELDI的分析可被用于鉴别多种硫酸酯酶缺乏症的特征，以及这类病症的阶段。这类分析优选包括，但不限于下列实例。RNA微阵列所发现的基因产物可通过被专一(抗体介导的)捕获到SELDI蛋白质盘(例如选择性SELDI)而被选择性地测量。蛋白筛选(例如以2维凝胶)所发现的基因产物可通过最优化的“总蛋白SELDI”解析以可视化那些来自SEQ ID NOs:1, 6, 8, 10，12，14，16，18，20，22，24，26，和 / 或 28 中的特定的目的标记。来自SEQ ID NOs:1, 6，8，10，12，14，16，18，20，22，24，26，和 / 或 28 中的多种标记物的 SELDI 测量的特定硫酸酯酶缺乏症的预测模型可被用于SELDI策略。任何前述微阵列方法在测定硫酸酯酶缺乏疾病相关核酸的蛋白中的应用，能以本领域一般技术人员已知的常规方法完成，而通过蛋白质测量方法测定的表达可与标记物的预测定水平相关，用作对硫酸酯酶缺乏疾病患者治疗策略进行选择的预测性方法。本发明也包含硫酸酯酶产生性细胞，其中细胞产生的活性硫酸酯酶对总硫酸酯酶的比率(即比活性)被增加。细胞包含(i)具有增强的表达的硫酸酯酶，和(ii)具有增强的表达的甲酰甘氨酸生成酶，其中细胞产生的活性硫酸酯酶对总硫酸酯酶的比率，相对于甲酰甘氨酸生成酶缺乏时细胞所产生的活性硫酸酯酶对总硫酸酯酶的比率，增加至少5%。在本文中所用的“具有增强的表达的硫酸酯酶”典型地指硫酸酯酶和/或其编码的多肽相对于对照的增加的表达。增加的表达指增加(即到可探测的程度)任何硫酸酯酶核酸(如本文中其它部分所描述的本发明的硫酸酯酶核酸)的复制、转录和/或翻译，因为任何这些过程的上调会导致基因(核酸)所编码的多肽的浓度/数量的增加。这能应用大量本领域中已知也在本文中其它部分描述的方法而完成，例如以硫酸酯酶cDNA和/或包含硫酸酯酶位点的基因组DNA对细胞的转染，通过应用同源重组将例如强启动子元件置于内源性硫酸酯酶基因的基因组位点上游而激活内源性硫酸酯酶基因(参见，例如U. S. PatentsNos. 5，733，761,6, 270，989和6，565，844中详细描述的基因激活技术，所有这些被整合在本文中作为参考)等。典型的对照将是载体质粒所转染的同样的细胞。增强(或增加)硫酸酯酶活性也指防止或抑制硫酸酯酶的降解(例如通过增强的泛素化)，下调等，其导致例如相对于对照的增加的或稳定的硫酸酯酶分子t1/2(半衰期)。下调或降低的表达指基因和/或其编码的多肽的降低的表达。基因表达的上调或下调能通过一定方式直接测定，所述方式为应用任何本领域已知的适合的方式例如核酸杂交或抗体探测方法分别探测基因(例如，硫酸酯酶)的mRNA水平或基因所编码多肽的蛋白质表达水平的增加或降低，并与对照比较。硫酸酯酶基因表达的上调或下调也能通过探测硫酸酯酶活性的变化而间接测定。类似地，在本文中所用的“具有增强的表达的甲酰甘氨酸生成酶”，典型地指本发明的FGE核酸和/或其编码的多肽相对于对照的增加的表达。增加的表达指增加(即到可探测的程度)任何本发明的FGE核酸(如本文中其它部分所描述的)的复制、转录和/或翻译，因为任何这些过程的上调会导致基因(核酸)所编码的多肽的浓度/数量的增加。这能应用上述的(对硫酸酯酶)和在本文中其它部分描述的方法而完成，在一定实施方案中，相对于甲酰甘氨酸生成酶缺乏的细胞所产生的活性硫酸酯酶对总硫酸酯酶的比率，细胞所产生的活性硫酸酯酶对总硫酸酯酶的比率增加至少10%，15%,20%, 50%, 100%, 200%, 500%, 1000%。本发明进一步包 含在受试者中治疗硫酸酯酶缺乏症的改进的方法。方法包括对需要这类治疗的受试者以有效剂量施用硫酸酯酶以治疗受试者中的硫酸酯酶缺乏症，其中硫酸酯酶与一定量的甲酰甘氨酸生成酶接触，所述量是增加硫酸酯酶比活性的有效量。如本文中其它部分所描述的，“比活性”指所产生的活性硫酸酯酶对总硫酸酯酶的比率。在此所用的“接触”指如本文中其它部分所描述的FGE翻译后修饰硫酸酯酶。将对一般技术人员显然的是，如果编码FGE和硫酸酯酶的核酸在细胞中共表达，或甚至如果分离的FGE多肽与分离的硫酸酯酶多肽在体内或体外接触，则FGE能接触硫酸酯酶并对它进行修饰。即使分离的FGE多肽能与分离的硫酸酯酶多肽共施用于受试者，以治疗受试者中的硫酸酯酶缺乏症，在FGE和硫酸酯酶之间的接触也优选在硫酸酯酶施用于受试者之前在体外发生。既然更低量的硫酸酯酶需要被施用，和/或以更低频率施用(因为硫酸酯酶具有更高的比活性)，此改进的治疗方法对受试者有益。参考下面的实施例，本发明将被更充分地理解。然而，这些实施例只倾向于举例说明本发明的实施方案，而不应被解释为限制本发明的范围。
实施例实施例1 多种硫酸酯酶缺乏症由编码人(。_甲酰甘氨酸生成酶(FGE)的基因中的突变所引起。实骀稈序材料和方法FGE的体外分析为监测FGE的活性，N-乙酰化和C-酰胺化的23聚肽P23 (MTDFYVPVSLCTPSRAALLTGRS)(SEQ ID NO: 33)被用作底物。位点11的半胱氨酸残基向FGly的转化通过MALD1-T0F质谱监测。30%乙氰和0. 1%三氯乙酸(TFA)中的6 ii M的P23原液被制备。在标准条件下，6pmol的P23与高至10 u I的酶一起在最终体积为30 ii I的50mM Tris/HCl (pH9. 0,含有67mM NaCl, 15 u MCaCl2, 2mM DTT,和0. 33mg/ml牛血清白蛋白)中于37°C培育。为停止酶反应，加入1. 5 y I10%TFA。然后P23被固着于ZipTip C18 (Millipore)，以0. 1%TFA清洗，并在3 y I的50%乙氰和
0.1%TFA中洗脱。0.5U I的洗脱液与0. 5ii I的基质溶液(50%乙氰和0. 1%TFA中的5mg/ml a-氰基-4-轻基-肉桂酸(Bruker Daltonics, Billerica, MA))在不镑钢的祀上混合。MALD1-TOF质谱应用反射模式和刚好高于解吸/电离阈值的激光能量以Reflex III (Bruker Daltonics)完成。所有谱线是来自靶标上几个点的200-300次射击(shot)的平均值。质量轴应用分子质量范围在1000到3000Da的肽作为外部标准而校准。P23的单同位素MlT是2526. 28，而包含FGly产物的是2508. 29。活性(pmol产物/小时)根据产物的峰值高度除以P23和产物的峰值高度总和而计算。来自牛睾丸的FGE的纯化牛睾丸得自当地屠宰场，冰上保存最多20小时。实质(Parenchyme)从结缔组织中释放，并在韦林氏搅切器中和通过三轮次的马达陶制(motor pottering)而勻衆。通过所得到的勻衆的细胞分级分离，粗微粒体(RM)的制备按(Meyer等，J. Biol.Chem.，2000，275:14550-14557)所述并进行下面的修正而完成。三次差异离心步骤，每次4°C下 20 分钟，在 500g(JA10 转子)，3000g(JA10)和 IOOOOg(JA20)下完成。RM 膜从最后一次的上清液中沉淀(125000g，Ti45转子，45分钟，4°C )，通过马达陶制匀浆并在蔗糖垫层上分层(50mMHepes, pH7. 6, 50mM KAc, 6mM MgAc2, ImM EDTA,1. 3M鹿糖，5mM P _疏基乙醇)。在Ti45转子中以45000rpm4°C下离心210分钟后，RM从沉淀中回收。通常100000-150000等价的 RM,如 Walter 和 Blobel (Methods Enzymol. , 1983, 96:84-93)所定义，从 Ikg 睾丸组织中得到。reticuloplasm,即RM的腔内容物通过低浓度脱氧Big Chap下的分级抽提而得到，如 Fey 等，J. Biol. Chem.，2001，276:47021-47028 所述。对 FGE 的纯化，95ml 的reticuloplasm4°C 下对 20mM Tris/HCl, pH8. 0, 2. 5mM DTT 透析 20 小时，而通过 125000g下离心I小时澄清。32ml澄清reticuloplasm等份物室温下被装在MonoQ HR10/10柱(Amersham Biosciences, Piscataway, NJ)上，清洗和用线性梯度的 80ml Tris 缓冲液中的0到0. 75M NaCl以2ml/min洗脱。三轮洗脱的包含FGE活性的级分(50_165mM NaCl洗脱)被收集(42ml),与2ml的伴刀ii球蛋白A-Sepharose (Amersham Biosciences,已用含有
0.5M KCl, ImM MgCl2, ImM MnCl2, ImM CaCl2,和 2. 5mM DTT 的 50mM Hepes 缓冲液，pH7. 4 清洗过)混合。4°C下培育16小时后,伴刀豆球蛋白A-Sepharose在柱中被收集,并用6ml相同的H印es缓冲液清洗。固着的物质通过柱在室温下与6ml 0. 5M a-甲基甘露糖苷在50mMHepes, pH7. 4,2. 5mM中培育I小时而洗脱。洗脱用4ml的相同洗脱剂重复。来自伴刀豆球蛋白A-Sepharose的合并的洗脱液(IOml)以0. 5MTris/HCl (pH9. 0)调至pH8. 0,并与用IOmg 混杂肽(PVSLPTRSCAALLTGR) (SEQ ID NO: 34)衍生化的 2ml 的 Aff igel 10 (Bio-RadLaboratories, Hercules, CA)混合，以缓冲液 A(50mM Hepes, pH8. 0,含有 0. 15M 乙酸钾，0. 125M蔗糖，ImM MgCl2,和2. 5mM DTT)清洗。4°C下培育3小时后，亲和基质在柱中被收集。收集经过的液体(flow through)和用4ml缓冲液A清洗的组分,合并,并与已用IOmg的 Ser69肽(PVSLSTPSRAALLTGR) (SEQ ID N0:35)取代的 2ml Affigel 10 混合，用缓冲液A清洗。4°C下培育过夜，亲和基质在柱中被收集，用6ml的缓冲液B (含有2M NaCl和20种组成蛋白质的氨基酸(每一浓度为50mg/ml)的混合物的缓冲液A)清洗3次。通过将Affigel与含有25mM Ser69肽的6ml缓冲液B培育两次，每次90min，而将固着的物质从亲和基质洗脱。洗脱液的等分组分以lmg/ml牛血清白蛋白取代，对缓冲液A透析，并分析活性。活性的保留部分(11.8ml)在 Vivaspin500 浓缩器(Vivascience AG, Hannover, Germany)中浓缩，并在95°C下溶于Laemmli SDS样品缓冲液。起始物质和层析步骤后得到的制剂的多肽组成以SDS - PAGE (15%丙烯酰胺，0. 16%双丙烯酰胺)监测，和以SYPRO Ruby (Bio-RadLaborator·ies)染色。通过质谱对FGE的鉴定对于肽质量指纹分析，纯化的多肽用胰蛋白酶在凝胶内被消化(Shevchenko等，Anal. Chem.，1996，68:850-855)，在C18 ZipTip上脱盐，并应用二氢苯甲酸作为基质和两种来自胰蛋白酶的自降解肽(m/z 842. 51和2211. 10)作为内标准而以MALD1-T0F质谱进行分析。对串联质谱分析，选出的肽通过MALD1-T0F post-source decay质谱而被分析。它们对应的带双电荷的离子被分离出，并被offline nano-ESI离子讲质谱(EsquireLC, Bruker Daltonics)所片段化。质谱数据通过Mascot检索算法用于NCBInr蛋白质数据库中和NCBI EST核苷酸数据库中的蛋白质鉴定。生物信息学信号肽和切断的位置根据在EMBOSS (Rice 等，Trends in Genetics, 2000, 16:276-277)中实行的 von Heijne (von Hei jne, Nucleic Acids Res., 1986, 14:4683-90)的方法被描述。N-糖基化位点应用 Brunak 的算法(Gupta 和 Brunak, Pac. Symp. Biocomput., 2002, 310-22)被预测。功能结构域通过搜索 PFAM-Hidden-Markov-Models (version 7. 8) (Sonnhammer 等，Nucleic AcidsRes.，1998，26:320-322)而被探测至Li。为搜索FGE 同源物,National Center for BiotechnologyInformation 的数据库(Wheeler 等，Nucleic Acids Res., 2002, 20:13-16)用 BLAST (Altschul等，Nucleic Acids Res.，1997，25:3389-3402)查询。序列类似度应用来自EMBOSS的标准工具而计算。基因组位点组织和同线性应用NCBI的人和小鼠基因组资源及也来自NCBI，BetheSda，MD的人类-小鼠同源性图谱而确定。人FGEcDNA 的克隆从人成纤维细胞应用RNEASY Mini试剂盒(Qiagen，Inc.，Valencia, CA)制备的总 RNA，应用 OMNISCRIPT RT 试剂盒(Qiagen, Inc.，Valencia, CA)以及寡(dT)引物或者FGE 专一的引物 1199nc(CCAATGTAGGTCAGACACG) (SEQ ID NO:36)而被反转录。cDNA 的第一链通过应用正向引物lc(ACATGGCCCGCGGGAC) (SEQ ID NO:37)和作为反向引物的1199nc或 1182nc(CGACTGCTCCTTGGACTGG) (SEQ ID NO:38)的 PCR 而扩增。PCR 产物被直接克隆进pCR4-T0P0 载体(Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA)。通过对克隆 PCR 产物(其从不同的个体和独立的RT - PCR反应得到)的多种测序，FGE cDNA的编码序列被确定(SEQ IDNOs:1 和 3)。突变探测，基因组测序，定点诱变和RNA印迹分析此研究中采用的标准流程本质上如LU bke等(Nat. Gen. ,2001,28:73-76)和Hansske 等(J. Clin.1nvest. , 2002, 109:725-733)所述。Northern 点与覆盖整个编码区cDNA探针杂交，并与P -肌动蛋白cDNA探针杂交而作为RNA负载的对照。细胞系和细胞培养来自多种硫酸酯酶缺乏症患者1~6的成纤维细胞分别从E. Christenson (RigshospitaletCopenhagen) , M. Bec k (Universititskinderkliaik Mainz) , A.Kohlschtitter (Uni veiS i tstskrankenhaus Eppendorf, Hamburg), E. Zammarchi (MeyerHospital, University of Florence), K. Harzer(Institut filr Himforschung, Ulli VGTS i tiitTiibingen),和 A. Fensom(Guy’s Hospital, London)得到。人皮肤成纤维细胞，HT-1080, BHK21 和 CHO细胞被以37°C和5%C02下保存在含有10%胎牛血清的Dulbecco的修饰后的Eagle培养基中。转染，间接免疫荧光，Western印迹分析和FGE活性的探测通过add-on PCR(其应用了 Pfu 聚合酶(Stratagene, La Jolla, CA)和下列引物GGAATTCGGGACAACATGGCTGCG(EcoRI)(SEQ ID NO:39), CCCAAGCTTATGCGTAGTCAGGCACATCATACGGATAGTCCATGGTGGGCAGGC(HA)(SEQ ID NO:40), CCCAAGCTTACAGGTCTTCTTCAGAAATCAGCTTTTGTTCGTCCATGGTGGGCAGGC(c-Myc)(SEQ ID NO:41), CCCAAGCTTAGTGATGGTGATGGTGATGCGATCCTCTGTCCATGGTGGGCAGGC (RGS-His6) (SEQ ID NO:42) ), FGE cDNA 被装上 5’EcoR1-位点以及3’ HA-, c-Myc或者RG S-His6-标记序列，及其后的终止密码子和HindIII位点。得到的PCR产物作为 EcoRI/Hindlll 片段被克隆进 pMPSVEH(Artelt 等，Gene, 1988，68:213-219)。应用EFFECTENE (Qiagen)作为转染试剂，得到的质粒被瞬时转染进生长在盖玻片上的HT-1080，BHK21和CHO细胞。转染48小时后，细胞通过如前面所述的间接免疫荧光(Lubke 等,Nat.Gen.,2001, 28:73-76;Hansske 等,J.Clin.1nvest. , 2002, 109:725-733)，应用抗HA的单克隆IgGl抗体(Berkeley抗体Company, Richmond, CA),抗c_Myc的单克隆 IgGl 抗体(Santa Cruz Biotechnology, Inc. , Santa Cruz, CA)或抗 RGS-His 的单克隆IgGl抗体(Qiagen)作为第一抗体而被分析。内质网标记蛋白即蛋白二硫键异构酶(PDI)被用不同亚型的单克隆抗体(IgG2A, Stressgen Biotech. , Victoria BC, Canada)所探测。第一抗体被用分别偶联到CY2或CY3的同型-专一性的山羊第二抗体(MolecularProbes, Inc. ,Eugene, OR)所探测。免疫荧光图像在Leica TCS Sp2 AOBS激光扫描显微镜上得到。对Western印迹分析,应用相同的单克隆抗体,HRP-缀合的抗-小鼠IgG被用作第二抗体。对FGE活性的测定，胰蛋白酶化的细胞用含有2. 5mM DTT、蛋白酶抑制剂和l%TritonX-100的IOmM Tris (pH8. 0)所溶解的磷酸缓冲盐溶液清洗，其含有蛋白酶抑制剂的混合物(208 u M 4-(2-氨基乙基)盐酸苯磺酰基氟，0. 16 ii M抑酶肽，4.2 ii M亮抑酶肽，7.2 ii M苯丁抑制素，3 ii M抑胃酶肽A，2. 8 ii ME-64)，并通过在125，OOOg离心I小时而澄清。上清液在MonoQ PCl. 6/5柱上应用上述条件进行层析。在50_200mM NaCl中洗脱的组分被收集，冷冻干燥，并重构成原始体积的十分之一，随后用肽P23测定FGE活性。逆转录病毒转导目的cDNAs被克隆进基于莫洛尼鼠白血病病毒的载体pLPCX和pLNCX2 (BDBiosciences Clontech, Palo Alto, CA) 嗜亲性的 FNX-Eco 细胞(ATCC, Manassas, VA)的转染，及兼嗜性RETR0PACK PT67细胞(BD Biosciences Clontech)和人成纤维细胞的转导按 Lubke 等，Nat. Gen.，2001，28:73-76; Thiel 等，Biochem. J.，2002，376，195-201 所述完成。对部分实验，在测定硫酸酯酶活性前，用嘌呤霉素选择PLPCX转导的PT67细胞硫酸酯酶分析ASA, STS 和 GalNAc6S 的活性按 Rommerskirch 和 von Figura, Proc. Natl. Acad.Sc1.，USA, 1992，89:2561-2565; GloSSl和 Kresse, Clin. Chim. Acta, 1978，88:111-119 中所述被测定。MS对FGE活性的基于肽的快速分析我们已发展出应用体外合成的[35S]ASA片段作为底物而用于在微粒体抽提物中测定FGE活性的分析法。片段被加入分析混合物而作为核糖体相连的初生链复合物。对产物的定量包括胰蛋白酶消化、肽通过RP-HPLC的分离，及通过化学衍生为腙、RP-HPLC分离和液闪计数的组合而对含有[35S]-标记的FGly的胰蛋白酶降解肽的鉴别和定量(Fey等，J. Biol. Chem.，2001, 276:47021-47028)。为监测纯化过程中的酶活性，此麻烦的程序需要被修正。对应于ASA残基65-80和含有FGly形成所需的序列基序的合成性的16聚肽在体外分析中抑制了 FGE活性。这暗示了肽例如ASA65-80可作为FGE的底物而起作用。我们合成了 23聚肽P23(SEQ ID NO: 33)，其对应于ASA残基60-80并附加了 N-乙酰化的甲硫氨酸和C-酰胺化的丝氨酸残基以分别保护N-和C-末端。含有半胱氨酸和FGly的P23形式能通过基质辅助的激光解析/电离飞行时间(MALD1-T0F)质谱鉴别和定量。FGly残基在P23位点11的存在通过MALD1-T0F post source decay质谱证实(参见Peng等，J. MassSpec.，2003，38:80-86)。P23和来自牛胰或牛睾丸微粒体的抽提物的培育将高至95%的肽转化成为含有FGly的衍生物(图1)。在标准条件下，反应与酶的数量和培育的时间成正比例，只要少于50%的底物被消耗和培育时间不超过24小时。P23的km是13nM。减少的和氧化的谷胱甘肽、Ca2+和 pH的效应与在应用核糖体相连初生链复合物作为底物的分析中所见到的那些相当(Fey 等，J. Biol. Chem.，2001，276:47021-47028)。FGE的纯化对FGE的纯化,牛睾丸微粒体的可溶性的级分(reticuloplasm)作为起始物质。FGE的比活性比那些来自牛胰微粒体的reticuloplasm中的类型高10-20倍(Fey等，J.Biol. Chem.，2001, 276:47021-47028)。FGE的纯化通过四个层析步骤的组合而完成。前两个步骤是在MonoQ阴离子交换柱和伴刀豆球蛋白A-Sepharose柱上的层析。在pH8,FGE活性物被固着到MonoQ，并在50-165mM NaCl被洗脱，而具有60-90%的回收率。当此级分与伴刀豆球蛋白A-S印harose混合时，FGE被固着。起始活性的30-40%能用0. 5M a-甲基甘露糖苷洗脱。后面两个纯化步骤是以16聚肽衍生的亲和基质上的层析。第一亲和基质是ASA65-80肽的变体所取代的Affigel 10，其中对FGly形成很关键的残基Cys69，Pro71和Arg73被搅乱(混杂肽PVSLPTRSCAALLTGR-SEQ ID NO:34)。当以IOmM浓度加入体外的分析中时，此肽不会抑制FGE活性，且当固定到Affigel 10时不会保持FGE活性。在混杂肽亲和基质上的层析除去了肽结合性蛋白，包括内质网的伴侣。第二亲和基质是ASA65-80肽的变体所取代的Affigel 10，其中Cys69被丝氨酸取代(Ser69肽PVSLSTPSRAALLTGR-SEQ IDNO: 35)。Ser69肽亲和基质有效结合FGE。FGE活性物能用2M KSCN或者25mM Ser69肽洗脱，而具有20-40%的回收率。在活性测定之前，KSCN或Ser69肽必须通过透析除去。Cys69被丝氨酸的取代对活性FGE的洗脱至关重要。被野生型ASA65-80肽所取代的Affigel 10有效结合FGE。然而，几乎没有活性能在用离液盐(KSCN，MgCl2)，肽(ASA65-80或Ser69肽)，或者低或高pH值缓冲液洗脱的洗脱液中回收。在图2中显示了起始物质和在经历了典型纯化过程的四个层析步骤之后得到的活性组分的多肽模式。在最终级分中，5%的起始FGE活性和0. 0006%的起始蛋白被回收(8333-倍纯化)。纯化的39. 5和41. 5kDa多肽被单个基因编码在纯化的FGE制剂中的39. 5和41. 5kDa多肽被进行肽质量指纹分析。通过MALD1-T0F质谱得到的两个多肽的胰蛋白酶肽的质谱很大程度地重叠，暗示着两个蛋白质源自相同基因。在两个多肽的胰蛋白酶肽中，两个富含肽(MH+1580. 73, SQNTPDSSASNLGFR(SEQ ID NO:43)和 MH+ 2049. 91, MVPIPAGVFTMGTDDPQIK-SEQ IDNO: 44外加两处甲硫氨酸氧化)被发现，其与具有GenBank Acc. No. AK075459 (SEQ ID NO: 4)的cDNA所编码的蛋白质吻合。这两个肽的氨基酸序列被MALD1-TOF post source decay谱和应用 offline nano-electrospray ionisation (ESI)离子讲质谱的 MS/MS 分析所确认。人cDNA的牛定向进化同源物的EST序列，其覆盖FGE的C端部分并与两个肽的序列都吻合，提供了牛FGE的另外的序列信息。FGE的进化保守和结构域结构人FGE基因被SEQ ID NOs:1和/或3的cDNA编码，并位于染色体3p26。它跨度约为105kb，而编码序列分散在9个外显子中。人FGE基因的三个定向进化同源物在小鼠中(87% —致)，黄果蝇(48% —致)，和疟蚊(47% —致)被发现。定向进化同源物的EST序列在更多的8个物种中被发现,包括奶牛，猪，非洲爪蟾，Silurana tropicalis,斑马鱼，鲑鱼和其它鱼物种(对于细节，参见实施例2)。外显子-内含子结构在人与小鼠基因间保守，而在染色体6E2上 的小鼠基因位于与人染色体3p26同线的区域内。S. cerevisiae和C. elegans的基因组缺乏FGE同源物。在原核生物中，12种人FGE的同源物被发现。人FGE的cDNA被预测编码一个374残基的蛋白(图3和SEQ ID NO:2)。此蛋白包含一个33残基的可切断的信号序列，其表明FGE到内质网中的迁移，此蛋白也包含了在Asnl41处的单一 N-糖基化位点。FGE与伴刀豆球蛋白A的结合暗示着此N-糖基化位点被应用。FGE的残基87-367被列在PFAM蛋白质基序数据库中，作为未知功能的结构域(PFAM:DUF323)。人FGE和其在数据库中已鉴定出的真核生物的定向进化同源物的序列比较分析说明此结构域由三个不同的亚结构域组成。在四种已知的真核生物FGE定向进化同源物中，N端亚结构域(人FGE中的残基91-154)具有46%的序列一致性和79%的相似性。在人FGE中，此结构域在Asn 141携带N-糖基化位点，这在其它定向进化同源物中保守。FGE的中间部分(人FGE中的残基179-308)为富含色氨酸的亚结构域(每129残基中12个色氨酸)。真核生物定向进化同源物在此亚结构域内的一致性是57%，相似性是82%。C端亚结构域(人FGE中的残基327-366)是FGE家族内最高度保守的序列。人C端亚结构域与真核生物定向进化同源物(3个全长序列和8个EST)的序列一致性是85%，相似性是97%。在亚结构域3的40个残基内，四个半胱氨酸残基完全保守。三个半胱氨酸也在原核生物FGE定向进化同源物中保守。FGE家族的12个原核生物成员(细节参见实施例2)与真核生物FGE共享亚结构域结构。三个亚结构域之间的边界在原核生物FGE家族中更加明显，因为可变长度的非保守序列将亚结构域彼此分开。人和小鼠基因组编码两个密切相关的FGE同源物(SEQ ID NOs:43和44，GenBankAcc. No. NM_015411，在人中；和 SEQ ID NOs:45 和 46，GenBank Acc. No. AK076022，在小鼠中)。两个平行进化同源物为86%—致。它们的基因位于同线染色体区域(在人中7qll，在小鼠中5G1)。两个平行进化同源物都与FGE定向进化同源物分享亚结构域结构，与人FGE有35% —致性和47%的相似性。在两个同源物中都100%—致的第三亚结构域中，含有半胱氨酸的亚结构域3的i^一体序列缺失。表达，亚细胞定位和分子形式2.1 kb的单一转录子通过来自成纤维细胞的总RNA和来自心脏、脑、胎盘、肺、肝脏、骨骼肌、肾和胰的聚A+RNA的RNA印迹分析可被探测。相对于P -肌动蛋白RNA，含量有一个数量级的变化，而在胰和肾中最高，脑中最低。多种真核生物细胞系，其稳定地或瞬时表达人FGE的cDNA或C端被HA-，Myc-或His6_tag所延长的FGE衍生物的cDNA，被用于对FGE活性和FGE亚细胞定位进行分析。标记或非标记的FGE的瞬时表达增加了1. 6-3. 9倍的FGE活性。FGE在PT67细胞中的稳定表达增加了约100倍的FGE活性。在BHK21，CHO和HT1080细胞中通过间接免疫荧光对带标记的FGE形式的探测显示多种带标记的FGE形式与蛋白质二硫键异构酶(一种内质网的腔蛋白)共定位。来自BHK 21细胞(被编码带标记的FGE形式的cDNA所瞬时转染)的抽提物的Western印迹分析显示单一的免疫活性条带,其表观大小在42到44kDa之间。FGE基因携带多种硫酸酯酶缺乏症中的突变多种硫酸酯酶缺乏症由硫酸酯酶中无法产生FGly残基的缺陷所引起(Schmidt, B.等，Cell, 1995，82:271-278)。FGE基因因此是多种硫酸酯酶缺乏症的候选基因。我们对7位多种硫酸酯酶缺乏症患者的FGE编码性cDNA进行了扩增和测序，发现十个不同的突变，其被基因组DNA测序所确证(表I)。
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表1:MSD患者中的突变
权利要求
1.组合物，其包含由共表达硫酸酯酶和甲酰甘氨酸生成酶(FGE)的哺乳类动物细胞产生的硫酸酯酶，其中相对于由缺乏甲酰甘氨酸生成酶的相同的哺乳类动物细胞所产生的对照硫酸酯酶，所述的硫酸酯酶具有增加百分比的硫酸酯酶活性。
2.权利要求1的组合物，其中相对于缺乏甲酰甘氨酸生成酶的对照硫酸酯酶，所述的硫酸酯酶对总硫酸酯酶的活性百分比增加至少为5%。
3.权利要求1的组合物，其中相对于缺乏甲酰甘氨酸生成酶的对照硫酸酯酶，所述的硫酸酯酶对总硫酸酯酶的活性百分比增加至少为10%。
4.权利要求1的组合物，其中相对于缺乏甲酰甘氨酸生成酶的对照硫酸酯酶，所述的硫酸酯酶对总硫酸酯酶的活性百分比增加至少为20%。
5.前述任一项权利要求的组合物，其中的哺乳动物细胞过表达FGE。
6.权利要求5的组合物，其中通过激活内源性FGE使哺乳动物细胞过表达FGE。
7.权利要求5的组合物，其中通过过表达外源性FGE使哺乳动物细胞过表达FGE。
8.组合物，其包含由相比野生型细胞具有提高的Ca-甲酰甘氨酸生成活性的哺乳动物细胞产生的硫酸酯酶，其中相对于由野生型细胞所产生的对照硫酸酯酶，所述的硫酸酯酶具有增加的甲酰甘氨酸形成活性。
9.权利要求8的组合物，其中所述哺乳动物细胞包含激活的内源性甲酰甘氨酸生成酶 (FGE)0
10.权利要求8的组合物，其中所述哺乳动物细胞包含外源性甲酰甘氨酸生成酶 (FGE)0
11.前述任一项权利要求的组合物，其中的硫酸酯酶选自艾杜糖醛酸2-硫酸酯酶， 硫酸胺酶，N-乙酰半乳糖胺6-硫酸酯酶，N-乙酰葡萄糖胺6-硫酸酯酶，芳基硫酸酯酶A， 芳基硫酸酯酶B，芳基硫酸酯酶C，芳基硫酸酯酶D，芳基硫酸酯酶E，芳基硫酸酯酶F，芳基硫酸酯酶 G, HSulf-1, HSulf-2, HSulf-3, HSulf-4, HSuIf-5 和 HSulf-6。
12.权利要求11的组合物，其中的硫酸酯酶是艾杜糖醛酸2-硫酸酯酶。
13.权利要求12的组合物，其中的艾杜糖醛酸2-硫酸酯酶包含SEQID N0:7。
14.权利要求11的组合物，其中的硫酸酯酶是芳基硫酸酯酶A。
15.前述任一项权利要求的组合物，其中的哺乳类动物细胞是CHO细胞。
16.前述任一项权利要求的组合物，其中的哺乳动物细胞是人细胞。
17.药物组合物在制备用于治疗受试者硫酸酯酶缺乏症的药物中的用途，所述药物组合物包含由共表达硫酸酯酶和甲酰甘氨酸生成酶(FGE)的哺乳动物细胞产生的硫酸酯酶， 其中相对于由缺乏甲酰甘氨酸生成酶的相同的哺乳类动物细胞所产生的对照硫酸酯酶，所述的硫酸酯酶具有增加百分比的硫酸酯酶活性。
18.药物组合物在制备用于治疗受试者硫酸酯酶缺乏症的药物中的用途，所述药物组合物包含由相比野生型细胞具有提高的Ca -甲酰甘氨酸生成活性的哺乳动物细胞产生的硫酸酯酶，其中相对于由野生型细胞所产生的对照硫酸酯酶，所述的硫酸酯酶具有增加的甲酰甘氨酸形成活性。
19.权利要求17或18的用途，其中的硫酸酯酶缺乏症选自粘多糖病II(MPSII; Hunter 综合症)，粘多糖病IIIA(MPS IIIA; Sanfilippo综合症A)，粘多糖病VIII (MPS VIII)，粘多糖病 IVA (MPS IVA; Morquio 综合症 A)，粘多糖病 VI (MPS VI; Maroteaux-Lamy 综合症)，异常染性脑白质营养不良(MLD)，X-连锁的隐性点状软骨发育不全1，和X-连锁的鱼鳞病 (类固醇硫酸酯酶缺乏症)。
20.权利要求19的用途，其中的硫酸酯酶缺乏症是粘多糖病II(MPS II;Hunter综合症)。
21.权利要求19的用途，其中的硫酸酯酶缺乏症是异常染性脑白质营养不良(MLD)。
22.权利要求19的用途，其中的硫酸酯酶缺乏症是粘多糖病IIIA(MPS 11IA; Sanf i I ippo 综合症 A)。
23.权利要求17或18的用途，其中的硫酸酯酶选自艾杜糖醛酸2-硫酸酯酶，硫酸胺酶，N-乙酰半乳糖胺6-硫酸酯酶，N-乙酰葡萄糖胺6-硫酸酯酶，芳基硫酸酯酶A，芳基硫酸酯酶B，芳基硫酸酯酶C，芳基硫酸酯酶D，芳基硫酸酯酶E，芳基硫酸酯酶F，芳基硫酸酯酶 G, HSulf-1, HSulf-2, HSulf-3, HSulf-4, HSuIf-5 和 HSulf-6。
24.权利要求23的用途，其中的硫酸酯酶是艾杜糖醛酸2-硫酸酯酶。
25.权利要求23的用途，其中的硫酸酯酶是芳基硫酸酯酶A。
26.硫酸酯酶生产细胞，所述生产细胞共表达(i)硫酸酯酶，和( )甲酰甘氨酸生成酶(FGE)，其中，相比于野生型细胞所述细胞具有增加的Ca -甲酰甘氨酸生成活性，由此造成所述细胞生产的硫酸酯酶对总硫酸酯的活性百分比增加。
27.权利要求26的硫酸酯酶生产细胞，其中所述细胞包含外源性FGE。
28.权利要求26的硫酸酯酶生产细胞，其中所述细胞包含激活的内源性FGE。
29.权利要求26-28中任一项的硫酸酯酶生产细胞，其中的FGE包含选自下述的氨基酸序列由 SEQ ID NO: 2 的第 34-374 位、SEQ ID NO: 2，5，46，48，50，52，54，56，58，60，62，64， 66，68，70，72，74，76，和78构成的氨基酸序列。
30.权利要求29的硫酸酯酶生产细胞，其中的FGE包含SEQID NO 2的34-374位氨基酸。
31.权利要求29的硫酸酯酶生产细胞，其中的FGE包含SEQID NO 2的氨基酸序列。
32.权利要求26-31中任一项的硫酸酯酶生产细胞，其中所述细胞生产的硫酸酯酶对总硫酸酯酶的活性比率相比于缺乏FGE的该比率增加了至少5%。
33.权利要求26-32中任一项所述的硫酸酯酶生产细胞，其中所述细胞生产的硫酸酯酶对总硫酸酯酶的活性比率相比于缺乏FGE的该比率增加了至少10%。
34.权利要求26-33中任一项所述的硫酸酯酶生产细胞，其中所述细胞生产的硫酸酯酶对总硫酸酯酶的活性比率相比于缺乏FGE的该比率增加了至少20%。
35.权利要求26-34中任一项的硫酸酯酶生产细胞，其中的硫酸酯酶选自艾杜糖醛酸 2-硫酸酯酶，硫酸胺酶，N-乙酰半乳糖胺6-硫酸酯酶，N-乙酰葡萄糖胺6-硫酸酯酶，芳基硫酸酯酶A，芳基硫酸酯酶B，芳基硫酸酯酶C，芳基硫酸酯酶D，芳基硫酸酯酶E，芳基硫酸酯酶 F，芳基硫酸酯酶 G, HSulf-1, HSulf-2, HSulf-3, HSulf-4, HSuIf-5 和 HSulf-6。
36.权利要求26-35中任一项的硫酸酯酶生产细胞，其中的硫酸酯酶是内源性硫酸酯酶。
37.权利要求26-35中任一项的硫酸酯酶生产细胞，其中的硫酸酯酶是外源性硫酸酯酶。
38.权利要求26-37中任一项的硫酸酯酶生产细胞，其中的FGE是激活的内源性FGE。
39.权利要求26-37中任一项的硫酸酯酶生产细胞，其中的FGE是外源性FGE。
40.权利要求26-39中任一项的硫酸酯酶生产细胞，其中所述细胞是哺乳动物细胞。
41.权利要求40的硫酸酯酶生产细胞，其中所述哺乳动物细胞是人细胞。
42.权利要求40的硫酸酯酶生产细胞，其中所述哺乳动物细胞是CHO细胞。
43.由权利要求26-42中任一项的硫酸酯酶生产细胞所产生的硫酸酯酶。
44.包含权利要求43的硫酸酯酶的药物组合物。
45.生产激活的硫酸酯酶的方法，包括培养权利要求26-42中任一项的硫酸酯酶生产细胞。
46.用于制备用来治疗硫酸酯酶缺乏症药物的多肽，其中，所述多肽具有Ca-甲酰甘氨酸生成活性，且a)具有选自由SEQ ID NO. 2，5，46，48，50，52，54，56，58，60，62，64，66，68，70，72，74，76 ，78，或SEQ ID NO. 2的第34-374位氨基酸构成的氨基酸序列；或b)与SEQID No 2具有至少50%的序列一致性；或c)对于a)或b)所述的多肽具有I个或多个保守氨基酸突变；或d)是上述a)所述多肽的片段；e)是上述a)_d)中任一项的融合蛋白。
47.权利要求46的多肽，其中的b)中的序列一致性程度为至少75%。
48.权利要求46的多肽，其中的b)中的序列一致性程度为至少95%。
49.权利要求46-48中的多肽，其中的FGE是具有Ca-甲酰甘氨酸生成活性的多肽，且其具有包含下述中至少一个的亚结构域3 (i)GFR基序(ii)RVXXGG (A) S 基序(iii)含3个精氨酸的七聚物(iv)三甘氨酸残基。
50.编码权利要求46-49中任一项的多肽的核酸或者含有所述核酸的载体。
51.权利要求50的核酸,其中的载体是病毒载体。
52.权利要求51的核酸,其中的病毒载体包含来自腺病毒、腺相关病或逆转录病毒的核酸序列。
53.权利要求50— 52中任一项的核酸,其中的核酸可操作地连接于表达调控序列的基因。
54.权利要求53的核酸，其中基因调控序列是哺乳动物或者病毒的启动子。
55.含有权利要求46- 49中任一项所述的多肽和硫酸酯酶的组合物或试剂盒。
56.含有权利要求50- 54中任一项所述的核酸的组合物或试剂盒。
57.权利要求56的组合物或试剂盒，其中所述组合物或试剂盒进一步包含编码硫酸酯酶的核酸。
58.权利要求55或57的组合物或试剂盒，其中的硫酸酯酶选自艾杜糖醛酸2-硫酸酯酶，硫酸胺酶，N-乙酰半乳糖胺6-硫酸酯酶，N-乙酰葡萄糖胺6-硫酸酯酶，芳基硫酸酯酶A，芳基硫酸酯酶B，芳基硫酸酯酶C，芳基硫酸酯酶D，芳基硫酸酯酶E，芳基硫酸酯酶 F，芳基硫酸酯酶 G, HSulf-1, HSulf-2, HSulf-3, HSulf-4, HSuIf-5 和 HSulf-6。
59.权利要求57或58的组合物或试剂盒，其中所述的核酸编码的硫酸酯酶是由单独分开的载体所编码的。
60.包括使用甲酰甘氨酸生成酶(FGE)以此导入醛基的修饰底物的方法。
61.权利要求60的方法，其中的底物是包含有序列L/V-FGly-X-P-S-R(SEQID NO:32) 的硫酸酯酶。
62.权利要求60或61的方法，其中的醛基替换巯甲基。
63.权利要求61或62的方法，其中的半胱氨酸或丝氨酸是被氧化的。
64.权利要求60-63中任一项的方法，其中的FGE以多肽形式提供，且进一步地其中所述多肽具有Ca-甲酰甘氨酸生成活性，且a)具有选自由SEQ ID NO. 2，5，46，48，50，52，54，56，58，60，62，64，66，68，70，72，74，76 ，78，或者SEQ ID NO. 2的第34-374位氨基酸构成的序列；或b)与SEQID No 2具有至少50%的序列一致性；或c)对于a)或b)所述的多肽具有I个或者多个保守氨基酸突变；或d)是上述a)所述多肽的片段；e)是上述a)_d)中任一项的融合蛋白。
65.权利要求60-63中任一项的方法，其中的FGE以编码权利要求64所述多肽的核酸的形式提供。
66.权利要求60-65中任一项的方法，其中的被修饰的底物与载体组合。
全文摘要
本发明涉及诊断和治疗多种硫酸酯酶缺乏症(MSD)及其它硫酸酯酶缺乏症的方法和组合物。更特异地，本发明涉及被分离的调节硫酸酯酶翻译后修饰的分子。这类修饰为硫酸酯酶的正确功能所必需。
文档编号A61K38/00GK103055306SQ201210302070
公开日2013年4月24日 申请日期2004年2月10日 优先权日2003年2月11日
发明者K·冯菲古拉, B·施密特, T·蒂尔克斯, M·W·希尔特莱恩, A·巴拉比奥, M·P·考斯玛 申请人:夏尔人类遗传性治疗公司