专利名称：Dc-cik细胞治疗组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及细胞免疫领域，具体地说是提供了一种DC-CIK细胞治疗组合物，其是从脐带血中分别扩增获得高效的DC和CIK细胞，并共培养得到DC-CIK细胞，最终制备为细胞治疗产品，用于临床治疗乳腺癌等多种恶性肿瘤。
背景技术：
细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokineinduced killer cells, CIK cells)是介导细胞毒活性最强的免疫效应细胞，兼具有T淋巴细胞的高度的杀瘤活性和NK细胞非主要组织相容性复合物(MHC)的限制性杀瘤效应。CIK细胞同时表达CD3和CD56两种膜蛋白分子，具有增殖速度快，杀瘤活性高，杀瘤谱广等优点，被认为是肿瘤过继免疫治疗的新希望。树突状细胞(Dendritic cells, DC)是体内功能最强的抗原递呈细胞(Antigenpresenting cell, APC)，能够刺激初始的T淋巴细胞增殖，启动免疫应答；还能够呈递抗原给MHC-I类限制性CD8+和MHC-II类限制性CD4+T淋巴细胞，诱导特异性免疫反应，被称为“天然免疫佐剂”，因此在诱导免疫应答中具有独特的地位。近年来，以DC为基础的免疫治疗在临床应用中得到越来越广泛的关注，是国内外研究的热点。DC-CIK细胞(或DC/CIK细胞)是指与DC共培养的CIK细胞。将CIK和同源DC细胞共培养后即可获得DC-CIK细胞。共培养既可促进DC的成熟，更能促进ClK细胞的增殖，并加强其抗肿瘤活性。DC是机体免疫应答的始动者，能够诱导持久有力的特异性抗肿瘤免疫反应,CIK细胞可通过非特异性免疫杀伤作用清除肿瘤患者体内微小残余病灶，所以负载肿瘤抗原的DC与CIK细胞的有机结合(即DC-CIK细胞)能产生特异性和非特异性的双重抗 肿瘤效应。Marten实验研究表明DC和CIK细胞共培养可以同时促进DC和CIK细胞的增殖和免疫功能。张嵩等的动物实验研究表明化疗后应用DC-CIK细胞可有效抑制肿瘤细胞生长，甚至使肿瘤完全消失；而且DC-CIK细胞的抗肿瘤效应对集体免疫系统功能不产生危害，在当前对肿瘤特异性抗原了解相对较少的情况下，应用DC-CIK细胞作为肿瘤放化疗和手术后的辅助治疗有重要的临床意义。赵春华等研究表明与DC共培养可使CIK细胞获得更高的增殖速率和更强的体内外抗肿瘤活性，DC-CIK细胞可以作为一种临床有效的抗白血病免疫治疗策略。童春容等临床研究显示=DC-CIK细胞治疗具有明显清除微小残留白血病细胞防止复发的作用，并且静脉输注安全。现有技术中的DC制备方法大多采用病人的外周血单个核细胞，存在细胞数目少，抗原递呈能力差等缺点。现有技术中的CIK细胞制备方法也大多采用病人的外周血单个核细胞，先加入IFN- Y，24小时后再加入其他细胞因子如IL-2、IL-I α继续培养，这种方法制备出的CIK细胞存在繁殖能力差、细胞活性低等问题
发明内容
本发明通过细胞来源的选择、培养方案的优化、肿瘤特异性抗原提取和选择等方面的改进，提供了一种新的DC-CIK细胞治疗组合物及其制备方法，解决了现有DC-CIK细胞治疗组合物中DC细胞数目少、抗原递呈能力差，以及CIK细胞增殖能力差、杀瘤活性低的问题。本发明提供了一种细胞治疗组合物，其包括治疗有效量的树突状细胞(DC)和CIK细胞。其中，所述DC和CIK细胞均来源于脐带血单个核细胞，优选地，它们从同一份脐带血单个核细胞样品贴壁培养后分离的贴壁细胞和悬浮细胞分别培养得到。本发明的细胞治疗组合物使用特殊的方法制备得到，该方法包括如下步骤(I)将脐带血单个核细胞用含有脐带血血浆的培养基贴壁培养过夜后，吸出悬浮细胞，向贴壁细胞中加入含有rhGM-CSF、rhIL-4、SCF和Flt3_L的上述培养基，继续培养； 隔天半量换液，并补加rhGM-CSF和rhIL-4以保持培养基中其浓度不变；于培养的第5天加 入肿瘤特异性抗原刺激，第6天加入rhTNF- α，再继续培养2_3天；(2)向步骤(I)中吸出的悬浮细胞用含有脐带血血浆的培养基悬浮后加入rhIFN- Y，培养24h后，转入细胞培养瓶中，并加入rhIL_2、rhIL-1 α、SCF和Flt3_L，继续培养10天；隔天半量换液，并补加rhIL-2以保持培养基中其浓度不变；(3)将步骤(I)得到的DC与步骤(2)得到的CIK细胞混合，混合后培养条件不变，继续培养3-7天获得成熟的DC-CIK细胞；共培养过程中隔天半量换液，并补加rhIL-2以保持培养基中其浓度不变。其中，培养DC和CIK细胞所用的培养基选自完全RPMI-1640培养基、GT-T551培养基或AM-V培养基，优选GT-T551培养基；培养基中含O. 3-10%脐带血血浆，优选含O. 6%脐带血血浆，最优选地，所述脐带血血浆为自体脐带血血浆。在一个特定的实施方案中，所述肿瘤特异性抗原为乳腺癌细胞系ZR-751提取的抗原蛋白。在另一个特定的实施方案中，加入的细胞因子rhGM-CSF、rhIL_4、SCF, Flt3_L、rhTNF- α、rhIFN-Y、rhIL_2 和 rhIL-1 α 的终浓度分别为 30ng/mL、10ng/mL、5ng/mL、3ng/mL、10ng/mL、50ng/mL、50ng/mL 和 5ng/mL,肿瘤特异性抗原的终浓度为 5μ g/mL。在本发明的第二方面，提供了一种细胞治疗试剂盒，其包含本发明的细胞治疗组合物。在本发明的第三方面，还提供了一种细胞治疗组合物的制备方法，包括如下步骤( I)将脐带血单个核细胞用含有脐带血血浆的培养基贴壁培养2h后，吸出悬浮细胞，向贴壁细胞中加入含有rhGM-CSF、rhIL-4、SCF和Flt3_L的上述培养基，继续培养；隔天半量换液，并补加rhGM-CSF、rhIL-4以保持培养基中其浓度不变；于培养的第5天加入肿瘤特异性抗原刺激，第6天加入rhTNF- α，再继续培养2-3天；(2)向步骤(I)中吸出的悬浮细胞用含有脐带血血浆的培养基悬浮后加入rhIFN- Y，培养24h后，转入细胞培养瓶中，并加入rhIL_2、rhIL-1 α、SCF和Flt3_L，继续培养10天；隔天半量换液，并补加rhIL-2以保持培养基中其浓度不变； (3)将步骤(I)得到的DC与步骤(2)得到的CIK细胞混合，混合后培养条件不变，继续培养3-7天获得成熟的DC-CIK细胞；共培养过程中隔天半量换液，并补加rhIL-2以保持培养基中其浓度不变。其中，培养DC和CIK细胞所用的培养基选自完全RPMI-1640培养基、GT-T551培养基或AM-V培养基，优选GT-T551培养基；培养基中含O. 3-10%脐带血血浆，优选含O. 6%脐带血血浆，最优选地，所述脐带血血浆为自体脐带血血浆。在一个特定的实施方案中，所述肿瘤特异性抗原为乳腺癌细胞系ZR-751提取的抗原蛋白。在另一个特定的实施方案中，加入的细胞因子rhGM-CSF、rhIL_4、SCF, Flt3_L、rhTNF- α、rhIFN-Y、rhIL_2 和 rhIL-1 α 的终浓度分别为 30ng/mL、10ng/mL、5ng/mL、3ng/mL、10ng/mL、50ng/mL、50ng/mL 和 5ng/mL,肿瘤特异性抗原的终浓度为 5 μ g/mL。在一个特别优选的实施方案中，该方法包括下列步骤(I)采用密度梯度离心法，用Ficoll人淋巴细胞分离液分离新鲜人脐带血，得到单个核细胞，加入含O. 6%自体脐带血血浆的GT-T551培养基5mL，贴壁过夜；(2)吸出悬浮细胞，向贴壁细胞中加入含O. 6%自体脐带血血浆的GT-T551培养基5mL，并加入 rhGM-CSF 30ng/mL、rhIL_410ng/mL、SCF 5ng/mL 和 Flt3_L 3ng/mL，置 37°C5% CO2孵箱中继续培养；隔天半量换液，并补加rhGM-CSF和rhIL_4以保持培养基中其浓度不变；(3)于培养的第5天加入乳腺癌细胞系ZR-751提取的抗原蛋白5 μ g/mL刺激，第6天加入rhTNF- a 10ng/mL,再继续培养2-3天得到DC ；(4)将步骤(2)中吸出的悬浮细胞用含有O. 6%自体脐带血血浆和80U/ml庆大霉素的GT-T551培养基调整细胞浓度为I X IO6个/ml接种于6孔板内，每孔2ml，并加入rhIFN-Y50ng/ml，放置 37°C，5% CO2 孵育箱中培养；(5)培养24h后，转入细胞培养瓶中，并加入50ng/mL rhIL_2、5ng/mL rhIL-1 α、5ng/mLSCF和3ng/mL Flt3_L，在37°C、5%C02培养箱中继续培养；隔天半量换液，并补加rhIL-2以保持培养基中其浓度不变；在37°C、5%C02培养箱中总共培养11天得到CIK细胞；(6)将步骤(3)得到的DC与步骤(5)得到的CIK细胞混合，混合后培养条件不变，继续培养3-7天获得成熟的DC-CIK细胞；共培养过程中隔天半量换液，并补加rhIL-2以保持培养基中其浓度不变。采用本方明的方法制备细胞治疗组合物，得到的CIK细胞纯度高，增殖能力强；DC纯度高，抗原递呈能力强，并能有效促进CIK细胞增殖，并增强其杀瘤活性；DC-CIK细胞相比单纯的CIK细胞，⑶3+⑶56+细胞百分比更高，对肿瘤细胞的杀伤活性也显著更高。
图I不同培养时间DC的形态。A C分别为培养第1、7、9天细胞在倒置显微镜下的形态，放大倍率均为20 X。图2不同培养时间DC的流式细胞分析结果。A C分别为培养第1、7、9天的DC。图3不同培养时间DC中⑶I α、HLA-DR、⑶80、⑶83、⑶86阳性细胞的比例。图4Α培养第I天的CIK细胞在倒置显微镜下的形态，放大倍率为20 X。图4Β培养第7天的CIK细胞在倒置显微镜下的形态，放大倍率为10 X。图4C培养第14天的CIK细胞在倒置显微镜下的形态，放大倍率为IOX。
图5A培养第I天的CIK细胞的姬姆萨染色形态，放大倍率为20 X。图5B培养第14天的CIK细胞的姬姆萨染色形态，放大倍率为20 X。图6脐带血来源CIK细胞的生长曲线。第一组采用本发明的方法(实施例4)；第二组在上述培养体系中不添加SCF和Flt3-L ;第三组在上述培养体系中，不添加rhIL-Ι α ;第四组在上述培养体系中，换用添加相应比例的胎牛血清；第五组在上述培养体系中，每天补加rhIL-2。
具体实施例方式实施例I脐带血单个核细胞的分离自体脐带血血浆的制备I.无菌采集足月顺产胎儿断脐后的脐带血一份，枸橼酸抗凝，置离心管内离心15 分钟。2.吸取上清大约30ml，放入离心管内，继续离心15分钟，收集上清血浆。3.将收集到的血浆放入56°C水浴30分钟，灭活补体。4.离心除去管中絮状沉淀物，将上清移至新的离心管中分装冻存备用。脐带血单个核细胞的分离I.将分离完上层血浆的脐带血，混匀按照I: I的比例与生理盐水混匀，再按6:1的比例与6. 0% (w/v)的羟乙基淀粉(HESpan)混匀，室温静置30分钟，待红细胞自然沉降至界限分明，沉降红细胞。2.吸出上清，置50ml离心管中，25°C、1800rpm离心5分钟。3.在15ml的离心管中加入5ml Ficoll人淋巴细胞分离液，再缓缓沿管壁加入5ml细胞悬液，250C、1800rpm离心25分钟，分离出单个核细胞。4.收集界面单个核细胞，用PBS洗涤。5.用PBS悬浮细胞计数，备用。实施例2 DC的制备I.将分离得到的单个核细胞接种到T25细胞培养瓶中，置37°C CO2孵箱中贴壁过夜，分离悬浮细胞并转移至新的T25细胞培养瓶。2.向贴壁的细胞中加入含O. 6%自体脐带血血浆的GT-T551培养基(日本TAKARA原装进口无血清淋巴细胞、树突状细胞培养基，由宝日医生物技术有限公司提供)5mL，并加Λ rhGM-CSF 30ng/mL、rhIL_410ng/mL、5ng/mL SCF 和 3ng/mL Flt3_L，置 37°C 5%(02孵箱中继续培养。3.隔天半量换液，补加含rhGM-CSF和rhIL-4的完全培养基，使细胞因子的浓度保持不变。4.于培养的第5天加入乳腺癌细胞系ZR-751提取的抗原蛋白5 μ g/mL刺激，第6天加入rhTNF- a 10ng/mL,继续培养1-4天。5.分别取培养第1、7、9天的细胞，在倒置显微镜下观察细胞形态，如图I所示。随着培养过程的进行，细胞由典型的球形单个核细胞形态转变为DC形态。实施例3 DC的免疫表型检测分别取培养第1、7、9天的细胞，用无钙镁PBS洗2次后，各取lX105/mL，分别加入相应的FCM管中。加入待检测单克隆抗体包括⑶I α、HLA-DR、⑶80、⑶83、⑶86抗体各5μ 1，4°C避光孵育30分钟，每10分钟摇晃I次，使细胞与抗体充分接触。用PBS洗2次，并重悬在400μ I的PBS中，采用流式细胞仪FASCSCalibur (BD Biosciences)检测，结果见图2、表I、图3。表I不同培养时间DC的免疫表型
权利要求
1.一种细胞治疗组合物，包括治疗有效量的树突状细胞(DC)和CIK细胞。
2.权利要求I所述的细胞治疗组合物，其中所述DC和CIK细胞均来源于脐带血单个核细胞。
3.权利要求2所述的细胞治疗组合物，其中DC和CIK细胞分别从同一份脐带血单个核细胞的贴壁细胞和悬浮细胞培养得到。
4.权利要求I所述的细胞治疗组合物，其通过以下步骤制备得到 (1)将脐带血单个核细胞用含有脐带血血浆的培养基贴壁培养过夜后，吸出悬浮细胞，向贴壁细胞中加入含有rhGM-CSF、rhIL-4、SCF和Flt3_L的上述培养基，继续培养；隔天半量换液，并补加rhGM-CSF和rhIL-4以保持培养基中其浓度不变；于培养的第5天加入肿瘤特异性抗原刺激，第6天加入rhTNF- α，再继续培养2-3天； (2)向步骤(I)中吸出的悬浮细胞用含有脐带血血浆的培养基悬浮后加入rhIFN-Y，培养24h后，转入细胞培养瓶中，并加入rhIL-2、rhIL-1 a、SCF和Flt3_L，继续培养IOd ；隔天半量换液，并补加rhIL-2以保持培养基中其浓度不变； (3 )将步骤(I)得到的DC与步骤(2 )得到的CIK细胞混合，混合后培养条件不变，继续培养3-7天获得成熟的DC-CIK细胞；共培养过程中隔天半量换液，并补加rhIL-2以保持培养基中其浓度不变。
5.权利要求4所述的细胞治疗组合物，其中培养DC和CIK细胞所用的培养基选自完全RPMI-1640培养基、GT-T551培养基或AM-V培养基。
6.权利要求5所述的细胞治疗组合物，其中，培养DC和CIK细胞所用的培养基为GT-T551培养基。
7.权利要求4所述的细胞治疗组合物，其中，培养DC和CIK细胞所用的培养基中含O.3-10%脐带血血浆。
8.权利要求7所述的细胞治疗组合物，其中，所述培养基中含O.6%脐带血血浆。
9.权利要求3-8任一项所述的细胞治疗组合物，其中，所述脐带血血浆为自体脐带血血浆。
10.权利要求4所述的细胞治疗组合物，其中，所述肿瘤特异性抗原为乳腺癌细胞系ZR-751提取的抗原蛋白。
11.权利要求4所述的细胞治疗组合物，其中，加入的细胞因子rhGM-CSF、rhIL-4、SCF、Flt3-L、rhTNF-a、rhIFN-Y、rhIL-2 和 rhIL-1 α 的终浓度分别为 30ng/mL、10ng/mL、5ng/mL、3ng/mL、10ng/mL、50ng/mL、50ng/mL 和 5ng/mL,肿瘤特异性抗原的终浓度为 5 μ g/mL。
12.—种细胞治疗试剂盒，包含权利要求1-11任一项所述细胞治疗组合物。
13.权利要求I所述细胞治疗组合物的制备方法，包括下列步骤 (1)将脐带血单个核细胞用含有脐带血血浆的培养基贴壁培养过夜后，吸出悬浮细胞，向贴壁细胞中加入含有rhGM-CSF、rhIL-4、SCF和Flt3_L的上述培养基，继续培养；隔天半量换液，并补加rhGM-CSF和rhIL-4以保持培养基中其浓度不变；于培养的第5天加入肿瘤特异性抗原刺激，第6天加入rhTNF- α，再继续培养2-3天； (2)将步骤(I)中吸出的悬浮细胞用含有脐带血血浆的培养基悬浮后加入rhIFN-Y，培养24h后，转入细胞培养瓶中，并加入rhIL-2、rhIL-la、SCF和Flt3_L，继续培养10天；隔天半量换液，并补加rhIL-2以保持培养基中其浓度不变；(3 )将步骤(I)得到的DC与步骤(2 )得到的CIK细胞混合，混合后培养条件不变，继续培养3-7天获得成熟的DC-CIK细胞；共培养过程中隔天半量换液，并补加rhIL-2以保持培养基中其浓度不变。
14.权利要求13所述的制备方法，其中培养DC和CIK细胞所用的培养基选自RPMI-1640培养基、GT-T551培养基或AM-V培养基。
15.权利要求14所述的制备方法，其中，培养DC和CIK细胞所用的培养基为GT-T551培养基。
16.权利要求13所述的制备方法，其中，培养DC和CIK细胞所用的培养基中含O.3-10%脐带血血衆。
17.权利要求16所述的制备方法，其中，所述培养基中含O.6%脐带血血浆。
18.权利要求13-17任一项所述的制备方法，其中，所述脐带血血浆为自体脐带血血浆。
19.权利要求13所述的制备方法，其中，所述肿瘤特异性抗原为乳腺癌细胞系ZR-751提取的抗原蛋白。
20.权利要求13所述的制备方法，其中，加入的细胞因子rhGM-CSF、rhIL_4、SCF,Flt3-L、rhTNF-α、rhIFN-Y、rhIL-2 和 rhIL-1 α 的终浓度分别为 30ng/mL、10ng/mL、5ng/mL、3ng/mL、10ng/mL、50ng/mL、50ng/mL 和 5ng/mL,肿瘤特异性抗原的终浓度为 5 μ g/mL。
21.权利要求13所述的制备方法，包括下列步骤 (1)采用密度梯度离心法，用Ficoll人淋巴细胞分离液分离新鲜人脐带血，得到单个核细胞，加入含O. 6%自体脐带血血浆的GT-T551培养基5mL，贴壁过夜； (2)吸出悬浮细胞，向贴壁细胞中加入含O.6%自体脐带血血浆的GT-T551培养基5mL，并加入 rhGM-CSF 30ng/mL、rhIL_4 10ng/mL、SCF 5ng/mL 和 Flt3_L3ng/mL，置 37°C 5% CO2孵箱中继续培养；隔天半量换液，并补加rhGM-CSF和rhIL-4以保持培养基中其浓度不变； (3)于培养的第5天加入乳腺癌细胞系ZR-751提取的抗原蛋白5μ g/mL刺激，第6天加入rhTNF- a 10ng/mL,再继续培养2-3天得到DC ； (4)将步骤(2)中吸出的悬浮细胞用含有O.6%自体脐带血血浆的GT-T551培养基调整细胞密度为I X IO6个/ml接种于6孔板内，每孔2ml，并加入rhIFN- y 50ng/ml，放置37°C，5% CO2孵育箱中培养； (5)培养24h后，转入细胞培养瓶中，并加入50ng/mLrhIL_2、5ng/mL rhIL-1 a、5ng/mL SCF和3ng/mL Flt3_L，在37°C、5%C02培养箱中继续培养；隔天半量换液，并补加rhIL_2以保持培养基中其浓度不变；在37°C、5%C02培养箱中总共培养11天得到CIK细胞； (6)将步骤(3)得到的DC与步骤(5)得到的CIK细胞混合，混合后培养条件不变，继续培养3-7天获得成熟的DC-CIK细胞；共培养过程中隔天半量换液，并补加rhIL-2以保持培养基中其浓度不变。
全文摘要
本发明提供了一种脐带血来源的DC-CIK细胞治疗组合物，其中，DC和CIK细胞来源于同一份脐带血单个核细胞。本发明还提供了DC-CIK细胞治疗组合物的制备方法，采用本方明的方法制备细胞治疗组合物，得到的CIK细胞纯度高，增殖能力强；DC纯度高，抗原递呈能力强，有效促进CIK细胞增殖并增强其杀瘤活性；DC-CIK细胞相比单纯的CIK细胞，CD3+CD56+细胞百分比更高，对肿瘤细胞的杀伤活性也显著更高。
文档编号A61K35/44GK102861107SQ20121034739
公开日2013年1月9日 申请日期2012年9月18日 优先权日2012年9月18日
发明者裴雪涛, 吴明远, 史高娜, 李会, 刘大庆, 南雪, 吉海杰, 李娜, 陈琳, 习佳飞 申请人:中国人民解放军军事医学科学院野战输血研究所, 北京和泽普瑞生物科技有限公司