专利名称：一种斑马鱼高脂血症模型的建立方法及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物模型构建领域，具体涉及一种斑马鱼高脂血症模型的建立方法及其应用。
背景技术：
脂肪代谢或运转异常使血浆一种或多种脂质高于正常的疾病称为高脂血症。高脂血症是一种全身性疾病，指血中胆固醇(TC)和/或甘油三酯(TG)过高或高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)过低，现代医学称之为血脂异常[1]。大量的流行病学调查和研究表明，高脂血症是动脉粥样硬化、冠心病和脑血管病发病的最重要危险因素。高脂血症也是高血压、糖耐量异常、糖尿病的一个重要危险因素。 高脂血症还可导致脂肪肝、肝硬化、胆石症、胰腺炎、眼底出血、失明、周围血管疾病、跛行、高尿酸血症[1]。根据近年卫生部在全国范围内进行的中国居民营养与健康状况调查显示，18岁以上居民总患病率为18.6%，全国患者总人数达1.6亿。降脂药可降低这些疾病的发生率和死亡率，对心脑血管疾病的防治产生积极、深远的影响。目前临床应用和处在研发阶段的降脂药物按其降脂机理和化学结构可分为他汀类，烟酸类，贝特类，胆酸鳌合剂类，多烯类，中药类等；但现有的降脂药物存在着或疗效不佳，或毒副作用较大或费用高等问题，因此开发新的降脂药物显得非常必要[2]。研发新的降脂药物是目前国际国内新药研发的热点和难点，选择理想的高脂血症动物模型是降脂药物研发成功的关键。目前用于高脂血症的体外模型主要是利用参与高脂血症形成的细胞，例如巨噬细胞，在高脂血症并发症动脉粥样硬化发生前，巨噬细胞会聚集在动脉，这个过程是在内皮粘附因子ICVM和ECVM促进下进行的。在低密度脂蛋白(LDL)作用下，巨噬细胞会变为泡沫细胞。可以利用这一过程进行降脂药物的筛选。目前研究表明他汀类药物可以抑制这一过程的发生。除了巨噬细胞外，T淋巴细胞，NK细胞，脂肪细胞，肝细胞，肥大细胞等都可以用来筛选降血脂药物[3]。但细胞培养体系的建立耗时较长，方法不稳定，重复性差，并且体外细胞缺少药物在生物整体的代谢转化和体内的循环分布，不能反映药物在体内的真实情况。目前用于高脂血症模型的动物有大鼠、小鼠、兔、金黄地鼠、豚鼠、悬猴、非洲绿猴以及恒河猴等，其他还有用鹌鹑、鸡、鸽子建立高脂血症模型。这些动物高脂血症模型的建立方法主要是利用高脂饲料如胆固醇、猪油、胆酸钠、蛋黄粉等喂养动物。虽然上述造模方法效果较好，但耗时较长，花费大，不适于高通量快速筛选[3]。建立一种能很好的模拟药物在体内的过程，又能快速方便的评价与筛选高脂血症治疗药物的动物模型具有重要的应用价值。斑马鱼是一种新颖的模式生物。与传统的体内和体外筛选模型相比较，活体斑马鱼筛选模型具有诸多优势，克服了原有体外模型在吸收、分布、代谢和排泄环节验证的欠缺及传统体内筛选模型实验周期长、操作复杂、成本高的弊端。斑马鱼是一种脊椎动物，与人类基因的相似度高达85%左右，实验结果可比性强。与鼠类等哺乳动物相比，斑马鱼胚胎透明，可同时观察分析多个器官，实验周期短，样本容量大，结果可信度高，所需费用低[4]。更重要的是，斑马鱼模型具有与生俱来的优点M:①饲养成本低，性成熟周期短；②繁殖能力强，一尾雌鱼每次可产200 300枚卵；③生长发育速度快，在受精后24小时，斑马鱼主要的组织器官基本已形成，可为研究提供大量的样本和较短的实验周期；④胚胎及幼鱼透明，体外受精，体外发育，可直接观察，并可同时分析多个器官系统；⑤胚胎有可以提供营养的卵黄囊，第一周内不需喂食，可避免化合物处理时化合物与食物成份的相互作用胚胎体积小，幼鱼体长只有I 4mm，能够在一个标准的6、12、24、48或96孔板内进行分析；⑦给药方式简单溶于水的小分子物质可直接经皮肤、鳃及消化系统进入斑马鱼体内；不溶于水的物质、大分子物质及蛋白质可进行显微注射。因此斑马鱼可作为很好的评价与筛选药物的高通量体内脊椎动物模型。国内外学者已经应用斑马鱼研究营养物质如脂类、糖类的代谢吸收。HOlttS-Vuori等[5’6]利用斑马鱼研究脂类的代谢。Konstantin等m利用斑马鱼研究脂类物质在血管内的聚集和氧化。Baek等M利用高胆固醇饲料喂食斑马鱼，建立高胆固醇模型，但是该文章中高胆固醇模型的建立耗时长，胆固醇分析使用裂解后的斑马鱼，检测过程繁琐，易出现假阳性或假阴性，不适于降脂药物筛选。Clifton等[9]利用斑马鱼荧光染料筛 选新的脂肪吸收抑制剂，在文章中作者提到用蛋黄粉和药物共同处理斑马鱼，之后进行脂肪染色，观察药物的抑制脂肪吸收效果；在该文中，作者并没有建立斑马鱼高脂血症模型，对实验结果也只是定性地观察，并没有建立药效学定量评价方法。鸡蛋黄粉是采用新鲜鸡蛋为原料，经过抽检验照，洗蛋、消毒、喷淋、吹干、打蛋、分离、过滤、均质、巴氏杀菌、喷雾、干燥等10多道工序制成，是新鲜鸡蛋的最为理想的替代品。在蛋黄粉中脂肪的含量> 60%，并且蛋黄粉具有较好的乳化性，是建立斑马鱼高脂血症模型的理性饲料(图I)。油红0(0il Red O)和尼罗红(nile red)都已经被证明是脂肪特异性染料，可以特异性地与脂肪结合，将脂肪染成红色(图2)。用油红O或和尼罗红对斑马鱼进行染色，斑马鱼血液中的脂肪含量越高，则染色后的血液就越红；斑马鱼血液中的脂肪含量越低，则染色后血液颜色就越浅[9a°]。
发明内容
为了克服上述现有技术的缺陷和不足，发明人经研究，旨在提供一种简单、快速、经济、高通量的斑马鱼模型体内快速筛选和评价降血脂药物的方法。本发明是通过以下技术方案实现的I. 一种斑马鱼高脂血症模型的建立方法，其特征在于，包括以下步骤(I)斑马鱼选取挑取发育正常的斑马鱼放入微孔板中；(2)用鸡蛋黄粉喂养斑马鱼移除微孔板中的培养液，设置多个实验组若干个不同浓度的鸡蛋黄粉喂食组和I个空白对照组，每个实验组根据微孔板的规格分别加入相同体积的相应溶液，然后恒温培养。优选的，还包括以下几个步骤(3)斑马鱼组织化学染色或荧光染色；
(4)图像分析和/或微孔板分析；(5)统计学分析。优选的，步骤(I)中挑选的斑马鱼为受精后6-7天的斑马鱼；优选的，步骤⑵中斑马鱼培养时间为72小时；优选的，空白对照组使用的溶液为斑马鱼养殖用水，此养殖用水溶解氧浓度为
6-8mg/L、水温为 28°C、pH 为 7. 2-7. 6、总硬度为 200_250mg/L ；优选的，斑马鱼恒温培养的温度为28°C ；优选的，斑马鱼组织化学染色或荧光染色包括以下步骤1)固定，2)脱水，3)染色，4)脱色，5) PBST洗脱； 优选的，图像分析具体步骤为斑马鱼组织化学染色或活体斑马鱼荧光染色结束后，在显微镜下拍照并保存图片；一方面通过观察斑马鱼血液中脂肪染色强度来进行定性评价；另一方面利用软件对斑马鱼尾部血管进行图像分析，通过计算斑马鱼尾部血管的脂肪染色强度来进行定量评价；优选的，微孔板分析具体步骤为斑马鱼荧光染色后，将斑马鱼转入96孔板中，每孔I尾，然后将微孔板置于多功能微孔板分析仪下检测荧光强度；优选的，统计学分析步骤为统计学处理结果以X士SE表示，多组间比较采用单因子方差分析，两组间比较采用Dunnett’ s T-检验进行统计学处理，p < O. 05为差异性显著。优选的，斑马鱼组织化学染色或荧光染色具体步骤如下I)固定移除微孔板中的鸡蛋黄粉培养液，加入4%多聚甲醛(PFA)对斑马鱼进行固定，需室温固定4小时(h)以上或者4°C固定过夜；2)脱水①室温下，在IOml的75% PBS/25%丙二醇，脱水10分钟；②室温下，在IOml的50% PBS/50%丙二醇，脱水10分钟；③室温下，在IOml的25% PBS/75%丙二醇，脱水10分钟；④室温下，在IOml的100%丙二醇，脱水10分钟；3)染色A:组织化学染色用1%油红O染色液进行染色，28°C过夜；B :荧光染色用10ng/mL尼罗红染色液进行染色，28°C过夜；4)脱色①室温下，在IOml的100%丙二醇，脱色10分钟；②室温下，在IOml的25% PBS/75%丙二醇，脱色10分钟；③室温下，在IOml的50% PBS/50%丙二醇，脱色10分钟；④室温下，在IOml的75% PBS/25%丙二醇，脱色10分钟⑤室温下，在IOml的100% PBS，脱色10分钟；5) PBST 洗脱室温下用PBST洗脱15min，重复4次。2.前述的建立方法得到的斑马鱼高脂血症模型用于高血脂疾病研究的用途。
3.前述的建立方法得到的斑马鱼高脂血症模型用于评价或筛选降血脂药物的用途。优选的，还包括以下步骤(3)化合物处理移除微孔板中的鸡蛋黄粉培养液，设置多个实验组若干个化合物处理组、I个模型组、I个阳性对照组、I个溶剂对照组和I个空白对照组，每个实验组根据微孔板的规格分别加入相同体积的相应溶液，然后恒温培养；(4)斑马鱼组织化学染色或突光染色；(5)图像分析和/或微孔板分析；(6)统计学分析。优选的，步骤(3)中化合物处理组加入的溶液为待测化合物溶液，阳性对照组加入的溶液为降血脂药物溶液，溶剂对照组中加入的溶液为O. 1%的DMSO ；优选的，斑马鱼组织化学染色或荧光染色包括以下步骤1)固定，2)脱水，3)染色，4)脱色，5) PBST洗脱；优选的，图像分析具体步骤为斑马鱼组织化学染色或活体斑马鱼荧光染色结束后，在显微镜下拍照并保存图片；一方面通过观察斑马鱼血液中脂肪染色强度来进行定性评价；另一方面利用软件对斑马鱼尾部血管进行图像分析，通过计算斑马鱼尾部血管的脂肪染色强度来进行定量评价；优选的，微孔板分析具体步骤为斑马鱼荧光染色后，将斑马鱼转入96孔板中，每孔I尾，然后将微孔板置于多功能微孔板分析仪下检测荧光强度；优选的，统计学分析步骤为统计学处理结果以X士SE表示，多组间比较采用单因子方差分析，两组间比较采用Dunnett’ s T-检验进行统计学处理，p < O. 05为差异性显·著。优选的，化合物处理后的斑马鱼培养时间为72小时。优选的，斑马鱼组织化学染色或荧光染色具体步骤如下I)固定移除微孔板中的鸡蛋黄粉培养液，加入4%多聚甲醛(PFA)对斑马鱼进行固定，需室温固定4小时(h)以上或者4°C固定过夜；2)脱水⑤室温下，在IOml的75% PBS/25%丙二醇，脱水10分钟；⑥室温下，在IOml的50% PBS/50%丙二醇，脱水10分钟；⑦室温下，在IOml的25% PBS/75%丙二醇，脱水10分钟；⑧室温下，在IOml的100%丙二醇，脱水10分钟；3)染色A :组织化学染色用I %油红O染色液进行染色，28°C过夜；B :荧光染色用10ng/mL尼罗红染色液进行染色，28°C过夜；4)脱色⑥室温下，在IOml的100%丙二醇，脱色10分钟；⑦室温下，在IOml的25% PBS/75%丙二醇，脱色10分钟；
⑧室温下，在IOml的50% PBS/50%丙二醇，脱色10分钟；⑨室温下，在IOml的75% PBS/25%丙二醇，脱色10分钟⑩室温下，在IOml的100% PBS，脱色10分钟；5) PBST 洗脱室温下用PBST洗脱15min，重复4次。本发明提供的斑马鱼高脂血症模型与以往的动物高脂血症模型相比，本发明具有如下优点I)活体内一实验材料为活体斑马鱼，作为一种脊椎动物，其筛选模型属体内模型，能够真实反映药物在体内的吸收、分布、代谢与排泄，真正反映药物的整体生物活性。
2)高通量-斑马鱼幼鱼很小，只有1-4毫米，能够在一个标准的6，12，24，48孔板内进行分析和实验周期短使斑马鱼成为一种能进行高通量药物筛选的理想模型。3)经济-所需费用低，以猴子为实验载体的筛选实验每只每天耗费大于10美元，以老鼠为实验载体的筛选实验每只每天耗费大于I美元，而以斑马鱼为实验载体的筛选实验每只每天耗费小于0.01美元。4)化合物用量少-检测化合物用量少，通常只需几毫克，而传统的筛选实验则需几毫克以上的化合物。5)简便-实验过程操作简单，斑马鱼经药物处理、染色后便可进行定量与定性分析，而传统实验操作过程复杂，容易产生假阳性结果。6)快速-实验周期短，可在一周内完成；而老鼠常需要数周到数月的时间，猴子常需要数月至数年的时间。斑马鱼在第一个72小时以内完成胚胎发育。多数的内部器官，包括心血管系统、肠、肝脏和肾，在24-48小时内快速成型，传统的实验载体老鼠和猴子则分别需要21天和9个月方可完成胚胎发育。7)高效-斑马鱼胚胎及幼鱼透明，可同时观察多个器官系统，实验分析方法简单、快速。8)可靠的预测性-斑马鱼的基因与人类基因的相似度高达85%左右，其生物学功能与哺乳动物及人类高度相似，实验结果可比性强，预测性好。9)直观性强-胚胎及幼鱼透明，可直接置于立体显微镜下观察对比各实验组斑马鱼染色强度。10)稳定性高、重复性好-本发明重复实验十几次，所获实验结果基本相同。本发明应用价值斑马鱼高脂血症模型具有可靠、快速、高效、低廉、高性价比等优点，本模型可用于高血脂疾病研究以及筛选降血脂药物。本发明对加快降血脂药物的研发及改善高脂血症患者的治疗具有意义重大。发明详述本发明的目的在于提供一种斑马鱼高脂血症模型的构建方法及其应用。本发明提供的方法具有简便、快速、经济、高效、高通量等优点。一、本发明提供一种斑马鱼高脂血症模型的建立方法，具体步骤为I.斑马鱼选取取4 5对斑马鱼亲本交配,按照Westerfieldtici]的方法孵化胚胎。将处于最佳处理阶段的斑马鱼置于解剖显微镜下观察，挑取发育正常的斑马鱼移入6、12、24、48、96孔微孔板中，根据微孔板规格放入不同数量的斑马鱼。2鸡蛋黄粉喂养斑马鱼设置5个实验组4个鸡蛋黄粉喂食组、I个不喂食组。移除微孔板中的养殖用水，鸡蛋黄粉浓度分别为O. 01%,O. 05%,O. 1%和O. 5% ;空白对照组中加入等体积的养殖用水。于28 °C恒温培养箱中培养。3斑马鱼组织化学染色或荧光染色I)固定移除微孔板中的鸡蛋黄粉培养液，加入4%多聚甲醛(PFA)对斑马鱼进行固定，需 室温固定4小时(h)以上或者4°C固定过夜。2)脱水①室温下，在IOml的75% PBS/25%丙二醇，脱水10分钟；②室温下，在IOml的50% PBS/50%丙二醇，脱水10分钟；③室温下，在IOml的25% PBS/75%丙二醇，脱水10分钟；④室温下，在IOml的100%丙二醇，脱水10分钟。3)染色A :组织化学染色用1%油红O染色液进行染色，28°C过夜；B :荧光染色用10ng/mL尼罗红染色液进行染色，28°C过夜。4)脱色(Q)室温下，在IOml的100%丙二醇，脱色10分钟；室温下，在IOml的25% PBS/75%丙二醇，脱色10分钟；室温下，在IOml的50% PBS/50%丙二醇，脱色10分钟；@室温下，在IOml的75% PBS/25%丙二醇，脱色10分钟 室温下，在IOml的100% PBS，脱色10分钟。5) PBST 洗脱室温下用PBST洗脱15min，重复4次。4图像分析A :斑马鱼组织化学染色结束后，利用解剖显微镜观察、拍照并保存。一方面通过观察对比各实验组斑马鱼的血脂染色强度来定性判断斑马鱼高脂血症模型是否建立成功；另一方面用图像处理软件进行图像分析，计算斑马鱼尾部血脂染色强度，定量判断斑马鱼高脂血症模型是否建立成功。B:斑马鱼荧光染色结束后，利用荧光显微镜观察、拍照并保存。一方面通过观察对比各实验组斑马鱼的血脂荧光强度来定性判断斑马鱼高脂血症模型是否建立成功；另一方面用图像处理软件进行图像定量分析，计算斑马鱼尾部血脂染色强度，定量判断斑马鱼高脂血症模型是否建立成功。5微孔板分析斑马鱼荧光染色后，将斑马鱼转入96孔板中，每孔I尾。然后将微孔板置于多功能微孔板分析仪下检测荧光强度。将激发光设置为485nm，在525nm处采集发射光的荧光强度，试验重复3次取其平均值，定量判断斑马鱼高脂血症模型是否建立成功。6统计学分析利用JMP8. O软件对上述图像分析和微孔板分析所得的血脂相对增加倍数进行统计分析。统计学处理结果以Z士SE表示，多组间比较采用方差分析，两组间比较采用Dunnetf s T-检验进行统计学处理，P < O. 05为差异性显著。根据统计学处理结果来评价斑马鱼高脂血症模型是否建立成功。二、本发明提供一种评价与筛选降血脂药物的方法，设计方案为I斑马鱼选取
将处于最佳处理阶段的斑马鱼置于解剖显微镜下观察，挑取发育正常的斑马鱼移入6、12、24、48、96或384孔板中，根据微孔板规格放入不同数量的斑马鱼。2鸡蛋黄粉喂养斑马鱼设置7个实验组,移除微孔板中的养殖用水，加入O. 5 %的鸡蛋黄粉培养液，于28 V恒温培养箱中培养。3化合物处理设置7个实验组4个化合物处理组、I个阳性对照组、I个溶剂对照组、I个空白对照组。微孔板每个孔中放入高脂血症模型斑马鱼，移除微孔板中的养殖用水，4个化合物处理组的化合物溶液浓度分别为O. 01 μ g/ml、0. I μ g/ml、l μ g/ml和10 μ g/ml ;阳性对照组中加入高脂血症治疗药物；溶剂对照组中加入等体积浓度为O. 1%的DMSO ;空白对照组中加入等体积的养殖用水。按照最佳处理时间长度于28°C恒温培养箱中培养。4斑马鱼组织化学染色或突光染色实验方法同发明内容一中的斑马鱼组织化学染色或荧光染色步骤。5图像分析A :斑马鱼组织化学染色结束后，利用解剖显微镜观察、拍照并保存。一方面通过观察对比各实验组斑马鱼的血脂染色强度来定性评价与筛选降血脂药物；另一方面用图像处理软件进行图像分析，计算斑马鱼尾部血脂染色强度。B:斑马鱼荧光染色结束后，利用荧光显微镜观察、拍照并保存。一方面通过观察对比各实验组斑马鱼的血脂荧光强度来定性评价与筛选降血脂药物；另一方面用图像处理软件进行图像定量分析，计算斑马鱼尾部血脂染色强度。根据待测化合物处理组斑马鱼的血脂降低率来评价待测化合物的降血脂效果，血脂降低率计算公式见(a)。
化合物处理组血脂染色虽度、,,
月曰削氏率()_( 溶剂组血脂染色强度)Xl00% U)6微孔板分析斑马鱼荧光染色后，将斑马鱼转入96孔板中，每孔I尾。然后将微孔板置于多功能微孔板分析仪下检测荧光强度。将激发光设置为485nm，在525nm处采集发射光的荧光强度，试验重复3次取其平均值，血脂降低率计算公式见(b)。
权利要求
1.一种斑马鱼高脂血症模型的建立方法，其特征在于，包括以下步骤 (1)斑马鱼选取 挑取发育正常的斑马鱼放入微孔板中； (2)用鸡蛋黄粉喂养斑马鱼 移除微孔板中的培养液，设置多个实验组若干个不同浓度的鸡蛋黄粉喂食组和I个空白对照组，每个实验组根据微孔板的规格分别加入相同体积的相应溶液，然后恒温培养。
2.如权利要求I所述的方法，其特征在于，还包括以下几个步骤 (3)斑马鱼组织化学染色或荧光染色； (4)图像分析和/或微孔板分析； (5)统计学分析。
3.如权利要求I或2所述的建立方法，其特征在于优选的，步骤(I)中挑选的斑马鱼为受精后4-7天的斑马鱼； 优选的，步骤(2)中斑马鱼培养时间为72小时； 优选的，空白对照组使用的溶液为斑马鱼养殖用水，此养殖用水溶解氧浓度为6-8mg/L、水温为 28°C、pH 为 7. 2-7. 6、总硬度为 200_250mg/L ； 优选的，斑马鱼恒温培养的温度为28°C。
4.如权利要求2或3所述的建立方法，其特征在于 优选的，斑马鱼组织化学染色或荧光染色包括以下步骤1)固定，2)脱水，3)染色，4)脱色，5) PBST洗脱； 优选的，图像分析具体步骤为斑马鱼组织化学染色或活体斑马鱼荧光染色结束后，在显微镜下拍照并保存图片；一方面通过观察斑马鱼血液中脂肪染色强度来进行定性评价；另一方面利用软件对斑马鱼尾部血管进行图像分析，通过计算斑马鱼尾部血管的脂肪染色强度来进行定量评价； 优选的，微孔板分析具体步骤为活体斑马鱼荧光染色后，将斑马鱼转入96孔板中，每孔I尾，然后将微孔板置于多功能微孔板分析仪下检测荧光强度； 优选的，统计学分析步骤为统计学处理结果以J 表示，多组间比较采用单因子方差分析，两组间比较采用Dunnett’ s T-检验进行统计学处理，p < O. 05为差异性显著。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于斑马鱼组织化学染色或荧光染色具体步骤如下 1)固定 移除微孔板中的鸡蛋黄粉培养液，加入4%多聚甲醛(PFA)对斑马鱼进行固定，需室温固定4小时(h)以上或者4°C固定过夜； 2)脱水 ①室温下，在IOml的75%PBS/25%丙二醇，脱水10分钟； ②室温下，在IOml的50%PBS/50%丙二醇，脱水10分钟； ③室温下，在IOml的25%PBS/75%丙二醇，脱水10分钟； ④室温下，在IOml的100%丙二醇，脱水10分钟；3)染色 A :组织化学染色用1%油红O染色液进行染色,28°C过夜； B :荧光染色用10ng/mL尼罗红染色液进行染色，28°C过夜； 4)脱色 ①室温下，在IOml的100%丙二醇，脱色10分钟； ②室温下，在IOml的25%PBS/75%丙二醇，脱色10分钟； ③室温下，在IOml的50%PBS/50%丙二醇，脱色10分钟； ④室温下，在IOml的75%PBS/25%丙二醇，脱色10分钟 ⑤室温下，在IOml的100%PBS，脱色10分钟； 5)PBST洗脱 室温下用PBST洗脱15min，重复4次。
6.权利要求1-5所述建立方法得到的斑马鱼高脂血症模型用于高血脂疾病研究的用途。
7.权利要求I或3所述建立方法得到的斑马鱼高脂血症模型用于评价或筛选降血脂药物的用途。
8.如权利要求7所述的用途，其特征在于还包括以下步骤 (3)化合物处理 移除微孔板中的鸡蛋黄粉培养液，设置多个实验组若干个化合物处理组、I个模型组、I个阳性对照组、I个溶剂对照组和I个空白对照组，每个实验组根据微孔板的规格分别加入相同体积的相应溶液，然后恒温培养； (4)斑马鱼组织化学染色或荧光染色； (5)图像分析和/或微孔板分析； (6)统计学分析。
9.如权利要求8所述的建立方法，其特征在于 优选的，步骤(3)中化合物处理组加入的溶液为待测化合物溶液，阳性对照组加入的溶液为降血脂药物溶液，溶剂对照组中加入的溶液为O. 1%的DMSO ； 优选的，斑马鱼组织化学染色或荧光染色包括以下步骤1)固定，2)脱水，3)染色，4)脱色，5) PBST洗脱； 优选的，图像分析具体步骤为斑马鱼组织化学染色或活体斑马鱼荧光染色结束后，在显微镜下拍照并保存图片；一方面通过观察斑马鱼血液中脂肪染色强度来进行定性评价；另一方面利用软件对斑马鱼尾部血管进行图像分析，通过计算斑马鱼尾部血管的脂肪染色强度来进行定量评价； 优选的，微孔板分析具体步骤为活体斑马鱼荧光染色后，将斑马鱼转入96孔板中，每孔I尾，然后将微孔板置于多功能微孔板分析仪下检测荧光强度； 优选的，统计学分析步骤为统计学处理结果以I土SE表示，多组间比较采用单因子方差分析，两组间比较采用Dunnett’ s T-检验进行统计学处理，p < O. 05为差异性显著。
优选的，化合物处理后的斑马鱼培养时间为72小时。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于斑马鱼组织化学染色或荧光染色具体步骤如下 1)固定 移除微孔板中的鸡蛋黄粉培养液，加入4%多聚甲醛(PFA)对斑马鱼进行固定，需室温固定4小时(h)以上或者4°C固定过夜； 2)脱水 ⑤室温下，在IOml的75%PBS/25%丙二醇，脱水10分钟； ⑥室温下，在IOml的50%PBS/50%丙二醇，脱水10分钟； ⑦室温下，在IOml的25%PBS/75%丙二醇，脱水10分钟； ⑧室温下，在IOml的100%丙二醇，脱水10分钟； 3)染色 A :组织化学染色用1%油红O染色液进行染色,28°C过夜； B :荧光染色用10ng/mL尼罗红染色液进行染色，28°C过夜； 4)脱色 ⑥室温下，在IOml的100%丙二醇，脱色10分钟； ⑦室温下，在IOml的25%PBS/75%丙二醇，脱色10分钟； ⑧室温下，在IOml的50%PBS/50%丙二醇，脱色10分钟； ⑨室温下，在IOml的75%PBS/25%丙二醇，脱色10分钟 ⑩室温下，在IOml的100%PBS，脱色10 分钟； 5)PBST洗脱 室温下用PBST洗脱15min，重复4次。
全文摘要
本发明涉及一种斑马鱼高脂血症模型的构建方法，并利用该动物模型进行高血脂疾病研究以及筛选降血脂药物。模型的构建方法主要包括斑马鱼选取，用蛋黄粉喂养斑马鱼，斑马鱼组织化学染色或荧光染色，图像分析和/或微孔板分析，统计学分析几个步骤。本发明的方法具有简便、快速、经济、高效、高通量等优点，本模型可用于高血脂疾病研究以及筛选降血脂药物。本发明对加快降血脂药物的研发及改善高脂血症患者的治疗具有意义重大。
文档编号A61K49/00GK102907357SQ20121037760
公开日2013年2月6日 申请日期2012年9月27日 优先权日2012年9月27日
发明者李春启, 陈汝家, 郭胜亚, 张勇 申请人:杭州环特生物科技有限公司