专利名称：东北林蛙皮肤分泌的抗菌肽及其编码序列和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于抗菌肽及其制备领域，特别涉及一种东北林蛙皮肤分泌的抗菌肽(ranatuerin-2YJ)及其编码序列和应用。
背景技术：
抗菌肽又称肽抗生素，是生物机体在抵御病原微生物的防御反应过程中为适应环境而产生的最早的免疫活性分子，包括对病原微生物起抑制作用的所有肽类物质，具有水解活性的酶类如溶菌酶、壳多糖酶、葡聚糖酶等除外。抗菌肽广泛分布于自然界中各类生物体内，动物中以昆虫、两栖类、哺乳类居多，主要来源于皮肤粘膜、血液、胃肠道、肝、脾等组织器官，具有抗病原体入侵作用。 蛙科动物是自然界中分布最广泛的两栖类动物，遍及世界各地，其皮肤潮湿、裸露，给细菌、病毒等病原微生物提供了良好的滋生和繁衍环境。蛙科动物的皮肤在维持其生存和适应栖息环境中起着重要的作用，为了适应生存环境，蛙科动物的皮肤中分布了种类繁多、分子结构特殊、功能多样的生物活性物质，主要含有生物胺、生物碱、蟾蜍配基和多肽4大类生物化学成分，形成了一个巨大的生物活性分子资源库和药物资源库。其中，蛙科动物皮肤抗菌肽是抵抗病原微生物入侵先天防御系统中的重要组成成分，根据其结构功能特点被划分为以下类别，即 brevinin-1 和 brevinin-2 家族、esculentin-1 和 esculentin-2家方矣、ranalexin 家方矣、ranatuerin-1 和 ranatuerin-2 家方矣、temporin 家方矣、palustrin 家方矣、tigerinin 家方矣、japonicin-Ι 和 japonicin-2 家方矣、nigrocin-2 家方矣、dybowskin-1 和dybowskin-2 家方矣、melittin 相关妝和 Caerulein precursor 相关月太。两栖类动物皮肤抗菌肽一般由1(Γ50个氨基酸残基组成，分子量约f 7kDa，分子表面通常带有正电荷，等电点多大于7，属于碱性阳离子肽。已报道的蛙科动物皮肤抗菌肽的信号肽和酸性前肽的序列十分保守，以前体肽形式转录，最终以成熟肽形式分泌。信号肽有22个疏水氨基酸残基结构，切割位点位于半胱氨酸-谷氨酸残基(Cys-Glu)之间，其主要功能是促使活性肽从细胞内分泌到细胞外。酸性前肽位于信号肽和成熟肽之间，维持活性肽自身的结构稳定、防止酶解，同时也起到调节生物活性的作用。成熟肽位于酸性前肽赖氨酸-精氨酸(Lys-Arg)残基之后，活性肽成熟过程中，信号肽和酸性前肽被分别切除，通过α-螺旋、β折叠、氨基酸修饰等途径，最终由皮肤颗粒腺分泌至体外，介导一系列的生物效应，可以在不损伤正常细胞的前提下对细菌、病毒等病原微生物起杀灭作用。东北林娃广泛分布于中国东北部的林区湿地,包括长白山脉、大小兴安岭地区、张广才岭腹地等。从东北林蛙皮肤分泌物中分离得到了多种具有抑菌、抗病毒活性的抗菌肽，都可形成两亲的α -螺旋结构，其作用机理不同于传统的抗生素，它不是通过抑制细菌代谢过程中某些重要生命物质的合成来杀死细菌，而是直接通过物理方式作用于细胞壁或细胞膜，使细胞内的活性物质泄漏导致细菌死亡，因此该类抗菌肽不会使细菌产生耐药性，有望成为新一代的抗菌、抗病毒和抗癌药物。
发明内容
本发明的目的在于提供一种新的具有抗菌活性的东北林蛙皮肤抗菌肽(ranatuerin-2YJ),以及该抗菌肽的编码序列和制备方法及其在制备抗菌药物中的应用。本发明所采用的技术如下
一种东北林娃皮肤分泌的抗菌肽，其氨基酸序列为序列表SEQ ID No. I所述,其分子量为3000. 6道尔顿，等电点9. 7。本发明还具有如下特征
I、一种编码东北林蛙皮肤分泌的抗菌肽的完整基因，其核苷酸序列为序列表SEQ IDNo. 2所述。 2、基于如上所述的一种编码东北林蛙皮肤分泌的抗菌肽的完整基因，编码东北林蛙皮肤分泌的抗菌肽的核苷酸序，其核苷酸序列为序列表SEQ ID No. 2第124-207位所述。3、本发明的东北林蛙皮肤分泌的抗菌肽采用固相化学的方法进行制备，按照标准的Fmoc固相肽合成程序进行人工合成，合成肽经反相HPLC岛津Shim - pack VP-ODS反相色谱柱4. 6mm X 150mm纯化,采用乙腈/水/三氟乙酸溶液洗脱，得到的合成肽纯度高达99%
4、如上所述的一种东北林蛙皮肤分泌的抗菌肽，在制备治疗微生物感染疾病药物中的应用。抗菌肽发挥抗菌作用是通过本身带有的正电荷与细菌表面的负电荷的吸引而相互接触，然后通过疏水氨基酸形成跨膜离子通道，引起细胞内容物流失，造成细胞死亡。本发明的抗菌肽ranatUerin-2YJ氨基酸序列二级结构显示，其可形成α -螺旋，并具有阳离子性，属于阳离子抗菌肽，C-端显示亲水性而N-端显示疏水性，亲水和疏水氨基酸残基分布于螺旋轮两侧，对抗菌肽活性起关键作用，这些都是抗菌肽所具有的结构特征网。成熟肽的C-端是Rana box,是Rana属特有的结构。本发明的抗菌肽(ranatUerin-2YJ)采用琼脂扩散法进行了抑菌活性实验，并对其溶血活性进行了检测。实验结果显示，本发明抗菌肽ranatUerin-2YJ对肠炎沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、肺炎克雷伯杆菌、化脓性链球菌、粘质沙雷氏菌、蜡样芽胞杆菌、肠出血性大肠杆菌等G+菌和G_菌均具有较强的抑制活性(见图4)，10mg/mL抗菌肽ranatuerin-2YJ的溶血率为5. 64%，远低于哺乳动物红细胞发生溶血作用时的药物浓度，其具有显著的抗菌活性，说明该抗菌肽ranatuerin-2YJ在不破坏哺乳动物细胞完整性的情况下，其可以抑制部分G+菌和G—菌的生长，显示出作为新型抗生素药物的应用前景。
图I为东北林蛙皮肤总RNA提取效果的琼脂糖凝胶电泳检测结果(M DNA Marker2000 ；1-3为东北林蛙皮肤总RNA)；
图2为东北林蛙皮肤抗菌肽基因pr印roranatuerin-2YJ的PCR扩增结果(M =DNAMarker 2000 ；1 :阴性对照；2 :preproranatuerin_2YJ 基因)；
图3为抗菌肽ranatuerin-2YJ固相化学合成的HPLC 图4为抗菌肽ranatuerin-2YJ琼脂扩散法抑菌实验结果(A :肠炎沙门氏菌；B :绿脓杆菌；C :粘质沙雷氏菌；D :金黄色葡萄球菌；E :肠出血性大肠杆菌；F :肺炎克雷伯氏杆菌；G 蜡状芽孢杆菌:化脓性链球菌.其中1为抗菌肽ranatuerin-2YJ的抑菌效果；2为阴性对照)。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明
实施例I
抗菌妝 ranatuerin_2YJ 基因 preproranatuerin_2YJ 的克隆
I、引物的设计 根据GenBank中收录的两栖动物蛙类活性肽基因序列，
设计并合成上游引物 XDl 5' -ATGTTCACC(T/A) TGAAGAAA(T/C) -3'，
通用型下游引物XD2 =Oligo d(T) 15，引物由上海生工生物工程有限公司合成。 2、抗菌妝基因 preproranatuerin_2YJ 的 cNDA 克隆
2.I东北林蛙皮肤总RNA的提取采用东北林蛙背部皮肤，经超低温冷冻研磨机(美国SPEX CertiPrep公司，型号6770)研磨成粉末状；称取IOOmg样品加入ImL Trizol,充分混勻，冰浴5min,离心(12000rpm,4°C) IOmin,取上清；加入等体积预冷的氯仿,混勻，冰浴5min,离心(12000rpm, 4°C ) IOmin,取上层水相；加入等体积预冷的异丙醇，混勻，冰浴IOmin,离心(12000rpm, 4°C ) IOmin,小心弃去上清液；用ImL 75%乙醇洗漆两次，每次12000rpm 4°C离心lOmin，吹干残留的乙醇液，加入50 μ L DEPC水溶解沉淀，获得东北林蛙皮肤总RNA。取5μ 东北林蛙皮肤总RNA提取液，经1%琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的完整性，并用紫外分光光度计检测总RNA的纯度和浓度。结果清晰可见28SRNA、18SRNA和5SRNA三条带，且紫外分光光度计测定OD26Q/OD28Q比值在I. 90 2. Ol之间，表明所获得的东北林蛙皮肤总RNA无降解，完整性良好，且无明显蛋白质和DNA污染。2. 2 RT-PCR :取3 μ L提取的东北林蛙皮肤总RNA经反转录合成cNDA，反转录体系
如下所示
权利要求
1.一种东北林蛙皮肤分泌的抗菌肽，其特征在于其氨基酸序列为序列表SEQ IDNo. I所述，其分子量为3000. 6道尔顿，等电点9. 7。
2.一种编码东北林蛙皮肤分泌的抗菌肽的完整基因，其特征在于其核苷酸序列为序列表SEQ ID No. 2所述。
3.根据权利要求2所述的一种编码东北林蛙皮肤分泌的抗菌肽的完整基因，其特征在于编码东北林娃皮肤分泌的抗菌肽的核苷酸序，其核苷酸序列为序列表SEQ ID No. 2第124-207位所述。
4.一种如权利要求I所述的东北林蛙皮肤分泌的抗菌肽的制备方法如下采用固相化学的方法进行制备，按照标准的Fmoc固相肽合成程序进行人工合成，合成肽经反相HPLC岛津Shim - pack VP-ODS反相色谱柱4. 6mm X 150mm纯化,采用乙腈/水/三氟乙酸溶液洗 脱，得到的合成肽纯度高达99%。
5.如权利要求I所述的一种东北林娃皮肤分泌的抗菌肽，其特征在于在制备治疗微生物感染疾病药物中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种东北林蛙皮肤分泌的抗菌肽及其编码序列和应用。所述的抗菌肽氨基酸序列为序列表SEQIDNo.1所示，分子量为3000.6道尔顿，等电点为9.7。该抗菌肽基因完整DNA序列见序列表SEQIDNo.2所示，该抗菌肽可通过氨基酸合成仪进行制备，其具有显著的抗菌活性，且不会对哺乳动物的红细胞产生溶血作用，可用于开发制备抗菌药物。
文档编号A61P31/04GK102875659SQ20121038160
公开日2013年1月16日 申请日期2012年10月10日 优先权日2012年10月10日
发明者徐义刚, 肖向红, 吴岩, 刘忠梅, 刘新亮, 杨淑静 申请人:黑龙江出入境检验检疫局检验检疫技术中心