一组鸡Cathelicidins抗菌肽及其制备方法和应用的制作方法

专利名称：一组鸡Cathelicidins抗菌肽及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域,具体地说涉及一组鸡Cathelicidins抗菌肽及其制备方法和应用。
背景技术：
近年来，多种传染性疾病困扰着我国的养殖业，抗生素自发现以来在预防细菌感染、防治畜禽疾病方面发挥了重要作用，对促进畜牧业生产的快速发展起到了巨大的推动作用，但长期大量使用抗生素类药物使得病原菌逐步产生耐药性，为疾病防治工作增加了难度。同时，抗生素引发的药物残留使得动物性食品的安全性问题日益突出，耐药质粒容易交叉散播传给人类，给人类健康和疾病的预防与治疗带来威胁，为此，国际社会提出减少抗生素生长促进剂(AGP)使用量或取消某些抗生素的使用。从2006年I月开始，欧盟全面禁止食品动物使用抗生素类促生长饲料添加剂，并于3月成立预防抗生素抗药性扩大研究网，随后日本和韩国等发达国家也建立了相应的条例，国际奥委会也要求北京为2008年奥运会提供符合欧盟要求的抗生素含量极低的安全肉食品。寻求抗生素替代品，研制既能有效防控畜禽疾病、促进动物生长，又无毒副作用、无残留、不易产生耐药性的绿色兽药和饲料添加剂，已成为动物营养、食品加工、新兽药研发等领域内面临的重大课题。抗菌肽(antimicrobial peptide)是在诱导条件下,动物免疫防御系统产生的一类对抗外源性病原体致病作用的防御性肽类活性物质，是宿主免疫防御系统的一个重要组成部分。抗菌肽具有高效、广谱的抗菌活性，对革兰氏阴性菌(G_)、革兰氏阳性菌(G+)、真菌、原生生物、有被膜的病毒和肿瘤细胞均表现出较强的活性(Jenssen H, et al. PeptideAntimicrobial Agents. Clin Microbiol Rev, 2006，19 (3) :491_511)。而绝大多数抗菌妝对哺乳动物正常细胞无害，具有不同于传统抗生素的独特抗菌机制，而且对机体无毒副作用、无残留，这将为解决细菌对青霉素等传统抗生素日益增强的耐药性这一棘手的全球性难题提供新途径，应用前景十分广阔。迄今已从包括动物、植物、昆虫、原核生物等多种生物体内分离、鉴定了千余种抗菌活性肽，有几十种抗菌肽已进入临床试验或临床前研究阶段。目前在家禽体内已发现了三大类抗菌肽，即防御素类(Gallinacin)、Cathelicidin类和肝内表达抗菌肽2 (LEAP-2)。从目前相关研究结果来看，鸡防御素在体外对多杀性巴氏杆菌及大肠杆菌、白色念珠菌、肠炎沙门氏菌、空肠弯曲杆菌等均有抑菌作用(Harwig S S，etal. Gallinacins: cysteine-rich antimicrobial peptides of chicken leukocytes. FEBSLett，1994，342(3):281-285;Evans E Wj et al. Antimicrobial activity of chicken andturkey heterophil peptides CHP1，CHP2，THP1，and THP3. Vet Microbiol, 1995，47(3-4):295-303)。
Cathelicidins类抗菌肽是最初被发现于哺乳动物的一类结构多变的抗菌肽，因其在信号肽与成熟肽之间含有一高度保守的Cathelin肽段而自成一家族。Cathelicidins在体外具有强的广谱抗革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌活性，包括抗生素抗性菌，有的在50%血清和生理盐浓度下仍有杀菌活性。同防御素一样，Cathelicidins抗菌肽也是宿主防御系统的重要组成部分，但它们通常更耐盐和溶媒。除了主要的杀灭细菌、真菌和病毒活性外，Cathelicidins还具有对免疫细胞的趋化作用、抑制组织损伤、促进创伤修复、结合内毒素、诱导血管生成等多种生物学功能(Zaiou M, et al. Cathelicidins, essentialgene-encoded mammalian antibiotics. J Mol Med, 2002, 80(9):549-61;RamanathanB, et al. Cathelicidins:microbicidal activity, mechanisms of action, and roles ininnate immunity. Microbes Infect, 2002, 4(3):361-372 ；Carretero M, et al, In vitroand in vivo wound healing-promoting activities of human cathelicidin LL-37.J Invest Dermatol, 2008，128(1) :223-236.)。由于具有如此广泛的生物学活性和功能，Cathelicidinds抗菌肽已成为免疫学、分子生物学和生物医药领域内的研究热点，其药用开发前景十分广阔。 然而，家禽体内天然抗菌肽的含量极低，分子量小，分离纯化困难，无法满足需要。化学合成与基因工程方法就成为获得抗菌肽的主要手段，但化学合成抗菌肽成本太高，也难以应用于临床；因此，通过基因工程的方法在特定宿主内大量表达抗菌肽就成为一条有效的途径。但由于抗菌肽本身对原核宿主菌有一定的杀伤作用，不适宜在原核系统中直接表达，通常采用融合表达或真核表达等方式。大肠杆菌因其遗传背景清晰、易于培养、周期短、成本低廉而备受青睐，成为目前应用最为广泛的外源基因表达宿主之一，多种抗菌多肽通过融合形式在大肠杆菌表达系统中成功表达，产物经处理后可产生抗菌活性。

发明内容
本发明的目的在于提供一组具有很强抗微生物活性的鸡抗菌肽Cathelicidinl，2，本发明利用基因工程技术从白来航鸡的骨髓组织中克隆出Cathelicidins抗菌肽基因(CathL-1, -2)cDNA片段，并将其成熟肽编码序列克隆至pET_30a(+)等融合表达载体中，在E. coli Rosetta(DE3)表达菌株中重组表达融合蛋白并对其进行初步鉴定,表达产物以可溶形式存在，不需蛋白酶切割，经亲和层析方法即可制备一组具有很强抗微生物活性的鸡重组抗菌肽 Cathelicidinl, 2。本发明还公开了该组鸡Cathelicidins抗菌肽的氨基酸序列及编码所述鸡Cathelicidins抗菌肽的DNA序列。本发明同时提供了该组鸡Cathelicidins抗菌肽的基因工程制备方法和固相化学合成法。本发明还进一步公开了该组鸡Cathelicidins重组抗菌肽在制备治疗鸡细菌感染药物中的用途。为了实现本发明的目的，本发明提供了如下技术方案本发明提供的一组Cathelicidins抗菌肽,是白来航鸡基因编码的抗菌肽,属于家禽Cathelicidins抗菌肽家族，它们的这一系列序列被命名为Cathelicidin I，2，其前体蛋白的氨基酸序列(从氨基端至羧基端)如下
Cathelicidinl (SEQ ID NO. 5)Met Leu Ser Cys Trp Val Leu Leu Leu Ala Leu Leu Gly Gly Ala Cys Ala LeuPro Ala Pro Leu Gly Tyr Ser Gln Ala Leu Ala Gln Ala Val Asp Ser Tyr Asn Gln ArgPro Glu Val Gln Asn Ala Phe Arg Leu Leu Ser Ala Asp Pro Glu Pro Gly Pro Asn ValGln Leu Ser Ser Leu His Asn Leu Asn Phe Thr He Met Glu Thr Arg Cys Gln Ala ArgSer Gly Ala Gln Leu Asp Ser Cys Glu Phe Lys Glu Asp Gly Leu Val Lys Asp Cys AlaAla Pro Val Val Leu Gln Gly Gly Arg Ala Val Leu Asp Val Thr Cys Val Asp Ser MetAla Asp Pro Val Arg Val Lys Arg Val Trp Pro Leu Val He Arg Thr Val He Ala GlyTyr Asn Leu Tyr Arg Ala He Lys Lys LysCathelicidin 2 (SEQ ID NO. 10)Met Leu Ser Cys Trp Val Leu Leu Leu Ala Leu Leu Gly Gly Val Cys Ala LeuPro Ala Pro Leu Ser Tyr Pro Gln Ala Leu He Gln Ala Val Asp Ser Tyr Asn Gln Arg Pro Glu Val Gln Asn Ala Phe Arg Leu Leu Ser Ala Asp Pro Glu Pro Gly Pro Gly ValAsp Leu Ser Thr Leu Arg Ala Leu Asn Phe Thr He Met Glu Thr Glu Cys Thr Pro SerAla Arg Leu Pro Val Asp Asp Cys Asp Phe Lys Glu Asn Gly Val He Arg Asp Cys SerGly Pro Val Ser Val Leu Gln Asp Thr Pro Glu He Asn Leu Arg Cys Arg Asp Ala SerSer Asp Pro Val Leu Val Gln Arg Gly Arg Phe Gly Arg Phe Leu Arg Lys He Arg ArgPhe Arg Pro Lys Val Thr He Thr He Gln Gly SerAlaArg Phe Gly鸡抗菌肽Cathelicidinl和Cathelicidin2，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO. I和SEQ ID NO. 6 所述。本发明的一组鸡Cathelicidins抗菌肽，其编码基因cathelicidin 1,2,来自于自成年白来航鸡骨髓组织中提取总RNA，经反转录合成cDNA第一链后，再以cDNA为模板，分别用2对基因特异性引物CathLl P1/P2和CathL2 P1/P2进行PCR，扩增产物即为cathelicidinl, 2 cDNA全序列。PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳分离并回收目的片段(见图1)，将目的片段与克隆载体PMD18-T连接并转化E. coli DH5 α感受态细胞，阳性菌株用Μ13F/R引物测序，得到含cathelicidinl，2开放阅读框(ORF)的完整核苷酸序列，其ORF序列全长分别为447bp、465bp，其自5’端至3’端的序列详见序列表(SEQ ID NO. I和SEQ IDNO. 6)。本发明提供的一组鸡Cathelicidins抗菌肽，其制备方法可以是固相化学合成法，也可以将抗菌肽的编码基因克隆到表达载体上，然后导入特定的宿主细胞中表达后获得。其中表达载体可以是质粒或病毒中的一种，宿主细胞可以是原核细胞，包括大肠杆菌、枯草芽孢杆菌等，宿主细胞也可以是真核细胞、包括酵母细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞等。制备的抗菌肽可通过质谱法鉴定。本发明提供一种鸡抗菌肽Cathelicidinl，2高效的基因工程制备方法，主要通过以下步骤实现(I)将鸡抗菌肽Cathelicidinl和鸡抗菌肽Cathelicidin2成熟肽的编码基因分别克隆到大肠杆菌融合表达载体pET30a ( + )中，得到融合表达载体pET30-CathLlS、pET30-CathL2S ；(2)将 pET30_CathLlS、pET30_CathL2S 质粒分别转化大肠杆菌 Rosetta(DE3)菌株，得到重组大肠杆菌基因工程菌株；(3)37°C下，在LB培养基中，诱导物IPTG浓度为I. Ommol/L的条件下，对上述重组大肠杆菌基因工程菌进行诱导表达3小时；(4)离心收集上述表达菌体，超声波破碎，分离细胞可溶组分与包涵体；(5) Ni2+-NTA Sepharose 4B亲和层析柱纯化融合蛋白。其具体步骤为(I)采用RT-PCR方法从白来航鸡骨髓组织中扩增编码鸡抗菌肽Cathelicidinl，
2前体蛋白的核苷酸序列(cDNA序列)，将所述基因分别克隆至pMD-18T载体中，转化大肠杆菌DH5 α菌株，并进行序列测定；
(2) PCR方法扩增编码鸡抗菌肽Cathelicidinl，2成熟肽的核苷酸序列，PCR产物经EcoRI和Xho I双酶切后与同样酶切的pET-30a(+)(或pET_32a(+))融合表达载体连接，转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，小量提取质粒，应用PCR和质粒酶切的方法筛选阳性克隆,通过DNA测序验证插入片段阅读框的正确性,从而构建出原核表达载体。将构建的融合表达载体分别命名为pET30-CathLlS、pET30-CathL2S ；(3)将测序正确的重组表达质粒pET30_CathLlS、pET30_CathL2S分别转化大肠杆菌Rosetta(DE3)菌株，挑取阳性菌株接种至LB培养基中37°C培养8 12h。次日离心取菌体重悬至新鲜LB培养基中，待培养液OD6tltol值达到O. 5^0. 6时加入IPTG使其终浓度为I. Ommol/L,开始进行诱导；37°C继续培养4h，每隔I小时取样lmL。离心收集诱导培养后的菌体，用PBS缓冲液洗涤菌体2次，再加入裂解缓冲液(50mmol/L Tris-HCl, pH
8.O, 50mmol/L NaCI, lmmol/LEDTA, 5%甘油，临用前加入蛋白酶抑制剂PMSF至终浓度为lmmol/L)，冰浴中超声破碎菌体，每次破碎5s，间隔2s，功率600W，破碎lOmin。超声后12000r/min, 4°C下离心lOmin,分离可溶组分与和包涵体,进行SDS-PAGE电泳和WesternBlot检测。浓缩胶浓度为5%，分离胶浓度为15%。将pET-30a(+)质粒按同样方法进行转化、诱导表达，取3h诱导表达产物(上清)作为对照。Western Blot操作参照《分子克隆实验指南》中的方法进行。电泳后将SDS-PAGE凝胶中的条带电转移至硝酸纤维素膜上，以鼠抗His单克隆抗体为一抗，羊抗鼠IgG-HRP为二抗，DAB为显色底物进行Western-blot分析，鉴定表达产物。(4)融合蛋白表达条件优化与表达产物的亲和层析纯化通过采用高渗培养基(即LB/SB培养基)、低温(25°C或15 20°C )长时间诱导、调节诱导物IPTG的浓度等方法，抑制包涵体形成，提高表达产物中可溶性蛋白所占比例。试验证明，在25°C、IPTG浓度为I. Ommol/L的条件下诱导培养8小时，可溶性目的蛋白所占的比例较37°C条件下明显提高，利于下游纯化操作。按上述优化后的条件进行扩大培养和目的蛋白的诱导表达，取诱导后的菌体，力口入适量结合缓冲液，冰浴中超声波破碎菌体，分离包涵体和可溶组分，将裂解上清液上样于固定化金属配体亲和柱层析柱(Ni2+-NTA Sepharose 4B柱),样品经含O. I "O. 5mol/L咪唑的缓冲液梯度洗脱，收集融合蛋白洗脱峰进行SDS-PAGE检测。结果显示，洗脱液中目的蛋白在目标位置呈现单一条带，表明经亲和层析可获得纯度较高的融合蛋白，为成熟产物的获得创造条件。(5)采用标准琼脂孔穴扩散法(AWDA)检测重组鸡抗菌肽Cathelicidin 1,2的对指示菌株的体外抑菌活性。本发明的一组新的鸡抗菌肽Cathelicidinl, 2,还可方便地采用固相化学合成方法进行制备。从鸡Cathelicidinl抗菌肽核苷酸序列推导出其前体蛋白的氨基酸序列(Seq-Ι)，根据目前对鸡Cathelicidins类抗菌肽成熟肽酶切加工位点(弹性蛋白酶切割位点)的认识，即鸡体内弹性蛋白酶一般是从该基因第四 个外显子编码氨基酸序列中的第一个缬氨酸(Val)位点进行切割加工，释放出有生物学活性的成熟肽的N-端；结合对信号肽与成熟肽间高度保守的Cathelin结构域肽段的分析，可以推断在其前体蛋白中，Arg123-Lys 148为鸡Cathelicidinl抗菌肽的成熟肽序列(Seq_4)。根据编码鸡Cathelicidinl抗菌肽的核酸序列推导出成熟抗菌肽的氨基酸序列，按照标准固相肽合成程序用全自动多肽合成仪合成其成熟肽序列(其N端至C端的氨基酸序列为Arg Val LysArg Val Trp Pro Leu Val He Arg Thr Val He Ala Gly Tyr AsnLeu Tyr Arg Ala He Lys Lys Lys,见序列表中Seq_4)。合成肽经反相-高压液相柱层析(RP-HPLC, Column X Bridge 4. 6X 250mm)脱盐、纯化，采用乙腈/水/三氟乙酸系统洗脱，合成肽的样品纯度>95% (95. 4%)。采用电喷雾质谱(ESI-MS)测定其分子量为3142. 80，与理论分子量(3141. 86)基本一致。本发明通过抑菌活性检测发现，利用Rosetta(DE3)/pET30a表达体系表达的重组Cathelicidins抗菌肽不需酶切等处理，对革兰氏阳性、阴性菌均有很好的抑菌活性，对金黄色葡萄球菌、芽孢杆菌、藤黄微球菌、大肠杆菌、鸡白痢沙门氏菌C79-13、巴氏杆菌、鸭疫里默氏杆菌、绿脓杆菌等标准菌株和临床分离菌株均有较强的抑制作用。与常规药敏试验结果比对发现，藤黄微球菌、大肠杆菌等标准菌株对试验中所使用的大多数抗生素类药物均耐药,而重组Cathelicidins抗菌肽对这些菌株却有明显的抑制效果。表明重组Cathelicidins抗菌肽对某些细菌菌株的抑制作用在一定程度上可能超过传统抗生素。本发明通过抗菌肽Cathelicidinl对金黄色葡萄球菌急性感染抑菌活性的雏鸡试验显示，抗菌肽给予5. Omg/kg剂量，就能达到100%杀菌抑制率，而作为抑杀金黄色葡萄球菌的氨苄青霉素给予5. Omg/kg剂量未能达到明显的杀菌抑制率，表明本发明抗菌肽对金黄色葡萄球菌急性感染有很显著的杀菌效果，因此本发明抗菌肽可应用于制备治疗革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌或真菌感染引起的疾病的药物，尤其是应用于制备治疗金黄色葡萄球菌、芽孢杆菌、大肠杆菌、沙门氏菌等的药物。本发明抗菌肽同时还可以用于制备动物饲料添加剂和防腐剂。本发明的有益效果在于(I)本发明选择大肠杆菌/融合表达载体作为外源基因的原核表达体系，选择pET30a等融合表达载体，使鸡Cathelicidins抗菌肽获得高效表达，并避免表达产物对宿主细胞造成直接的杀伤性。(2)本发明提供的方法表达效率高，表达产物分离纯化简单，生产成本低，易放大，稳定性好，适用于大规模工业化生产，具有广阔的应用推广前景。(3)本发明应用基因工程技术在原核宿主细胞中高效表达鸡Cathelicidins抗菌肽，经实验证实该组抗菌肽对多种革兰氏阳性菌、阴性菌均有明显的抑制作用。该组抗菌肽可应用于制备抗菌药物，或用于制备动物饲料添加剂和防腐剂。(4)与其它来源的碱性抗菌肽相比，该组抗菌肽还具有结构简单、人工合成方便、抗菌谱系广等有益特点。


图I为PCR扩增白来航鸡Cathelicidinl，2抗菌肽基因产物的2%琼脂糖凝胶电泳图。在图I中，I为DL15000DNAmarker，其中各核酸片段的碱基数目(数目单位为bp)分别为 15000，10000，7500，5000，2500，1000，250 ;2，3 分别为 Cathelicidin-1，_2cDNA序列的PCR扩增产物；图中5为DL2000DNA Marker，其中各核酸片段的碱基数目(数目单位为bp)分别为 2000，1000，750，500，250，100。图2为含鸡Cathelicidin-1, -2基因cDNA序列的阳性质粒pMD-CathL酶切后2%琼脂糖凝胶电泳图。图2中I为λ-EcoTHI digest DNA marker，其中各核酸片段的碱基数目(数目单位为 bp)分别为 19329，7743，6223，4254，3472，2690，1882，1489，925 ；2 为质粒pMD-CathLl/EcoR I+Hind III 双酶切后条带，3 为质粒 pMD-CathLl/EcoR I+Not I 双酶切后条带，4为质粒pMD-CathL2/EcoR Ι+HindIII双酶切后条带，5为质粒pMD_CathL2/EcoRI+Sma I双酶切后条带，8为DL2000DNAmarker，其中各核酸片段的碱基数目(数目单位为·bp)分别为 2000，1000，750，500，250，100。图3为重组表达质粒pET30_CathLS酶切后I. 5%琼脂糖凝胶电泳图。图3中I为λ-EcoT14Idigest DNAmarker,其中各核酸片段的碱基数目(数目单位为bp)分别为19329,7743，6223，4254，3472，2690，1882，1489，925 ;2 为质粒 pET-30a Sma I+Xba I 双酶切后条带;3 为质粒 pET30-CathLlS Sma I+Xba I 双酶切后条带；4 为质粒 pET30_CathL2S SmaI+Xba I双酶切后条带。图4为鸡抗菌肽Cathelicidinl，2成熟肽片段融合表达载体pET30_CathLS的构建示意图。在图4中，5. 5Kb代表构建的融合表达载体pET30-CathLS大小为5. 5Kb ；P1, P2分别代表Cathe I i c i din I，2cDNA序列克隆所用的上、下游引物；MCS代表多克隆位点；LacZ代表β-半乳糖苷酶的编码基因；LacI代表Iac阻抑物的编码基因；CathL代表连接插入克隆载体的Cathelicidinl, 2cDNA序列；CathLS代表连接插入表达载体的Cathelicidinl, 2成熟肽编码序列；Amp代表氨苄青霉素抗性基因位点；Kan代表卡那霉素抗性基因位点；pUCorigin, florigin, pBR322 origin 均代表复制起始位点。图5为SDS-PAGE及Western-Blot分析鸡Cathelicidinl, 2成熟肽融合蛋白的表达产物图。其中，左侧是SDS-PAGE电泳图，右侧是Western blot图。泳道I，I’是空载体转化菌株Rosetta(DE3)/pET30a IPTG诱导3h菌体经超声破碎后可溶性蛋白；泳道2，2’是预染低分子量标准蛋白质Marker，其中各蛋白片段的分子量分别为117，85，48，34，26，19kDa，KDa代表蛋白分子量的单位，即千道尔顿；泳道3，3’是Rosetta (DE3)/pET30-CathLlS菌株IPTG诱导3h菌体经超声破碎后可溶性蛋白；泳道4，4’是Rosetta (DE3) /PET30_CathLlS菌株IPTG诱导3h菌体经超声破碎后包涵体蛋白；泳道5，5’是Rosetta (DE3) /pET30_CathL2S菌株IPTG诱导3h菌体经超声破碎后可溶性蛋白；泳道6，6’是Rosetta(DE3)/pET30-CathL2S菌株IPTG诱导3h菌体经超声破碎后包涵体蛋白。图6.固相化学合成鸡抗菌肽Cathelicidinl的反相-高压液相(RP-PHLC)色谱图。图7.固相化学合成鸡抗菌肽Cathelicidinl的质谱(ESI-MS)图。
具体实施例方式下面结合附图和具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规方法如Sambrook等编著的《分子克隆实验室指南》(Molecular cloning:A laboratorymanual, 2nd ed . New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999)中所述的条件进行，或按照制造厂商提供的说明书进行。具体实施例中所使用的工具酶和其他试剂RNAiso Plus总RNA提取试剂、Reverse Transcriptase M-MLV (Rnase Η-)、核糖核酸酶抑制剂-RNAsin、Taq DNA 聚合酶、限制性内切酶、PMD18-T Vector、T4DNA连接酶除特别指明外均为TAKARA公司产品；鼠抗His单克隆抗体均购自Tiangen公司；UNIQ_10柱式质粒小量抽提试剂盒和UNIQ-IO柱式DNA胶回收试剂盒均为上海生工产品；IPTG为BBI公司产品；HRP标记羊抗鼠IgG为SouthernBiotech公司产品；预染蛋白质分子量标准为Fermentas (MBI)公司产品；金属螯合层析树脂Ni2+-NTA S印harose4B购自北京鼎国公司；细菌培养用TMP、TSA等固体培养基为青岛高科园海博生物技术公司产品，按说明书提供方法制备；常规药敏试纸片为杭州天和微生物试剂有限公司产品，其他试剂均为进口或国产分析纯。实施例I :鸡Cathelicidinl，2抗菌肽完整编码基因的克隆及测序测定分析，具体包括I.引物的设计根据GenBank中发表的原鸡Cathelicidins类抗菌妝基因序列(DQ092350,DQ092351)和PCR引物的设计原则，并借助计算机软件DNASTAR进行辅助分析，设计了三对PCR基因特异性引物分别用于扩增鸡Cathelicidinl，2编码基因的cDNA序列，引物分别为表中CathLl Pl/P2、CathL2 P1/P2，其中Pl为正向引物，P2为反向引物。引物均由上海博尚公司合成。本实施例和实施例2中所用的引物序列如表I所示。在CathLlS F/R，CathL2S F/R，引物对中，下划线处的碱基分别代表在上下游引物中引入的EcoR I、Xho I限制性内切酶位点。表I鸡Cathelicidins类抗菌肽基因扩增所用引物
权利要求
1.鸡抗菌肽Cathelicidin2，其核苷酸序列如SEQID NO. 6所述。
2.鸡抗菌肽Cathelicidin2，其特征是，其氨基酸序列如SEQID NO. 10所述。
3.如权利要求I或2所述的鸡抗菌肽Cathelicidin2的制备方法,其特征是,所述制备方法为固相化学合成法或基因工程方法，所述基因工程方法是将鸡抗菌肽Cathelicidin2的编码基因克隆到表达载体上，然后导入宿主细胞中表达；所述表达载体为质粒或病毒中的一种，所述宿主细胞为原核细胞或真核细胞。
4.如权利要求3所述的鸡抗菌肽Cathelicidin2的制备方法，其特征是，所述基因工程方法为 (O将鸡抗菌肽Cathelicidin2成熟肽的编码基因克隆到大肠杆菌融合表达载体pET30a(+)中，得到融合表达载体pET30-CathL2S ； (2)将pET30_CathL2S质粒转化大肠杆菌Rosetta(DE3)菌株，得到重组大肠杆菌基因工程菌株； (3)37°C下，在LB培养基中，诱导物IPTG浓度为I.OmmoI/L的条件下，对上述重组大肠杆菌基因工程菌进行诱导表达3小时； (4)离心收集上述表达菌体，超声波破碎，分离细胞可溶组分与包涵体； (5)Ni2+-NTA Sepharose 4B亲和层析柱纯化融合蛋白。
5.如权利要求4所述的鸡抗菌肽Cathelicidin2的制备方法,其特征是， (1) 0 方法扩增编码鸡抗菌肽0&访611(^也112成熟肽的核苷酸序列，PCR产物经EcoR I和Xho I双酶切后与同样酶切的pET-30a(+)融合表达载体连接，转化大肠杆菌DH5 α感受态细胞，提取质粒，应用PCR和质粒酶切的方法筛选阳性克隆，通过DNA测序验证插入片段阅读框的正确性，从而构建出原核表达载体；将构建的融合表达载体命名为pET30-CathL2S； (2)将测序正确的质粒pET30-CathL2S转化大肠杆菌Rosetta(DE3)菌株，获得重组表达Cathelicidins2成熟肽融合蛋白的工程菌Rosetta(DE3)/pET30_CathL2S ;挑取工程菌单菌落接种至LB培养基中37°C培养8 12h ;次日离心取菌体重悬至新鲜LB培养基中，待培养液OD6tltol值达到O. 5^0. 6时加入IPTG使其终浓度为I. OmmoI/L,开始进行诱导；37°C继续培养4h，每隔I小时取样ImL ;离心收集诱导培养后的菌体，用PBS缓冲液洗涤菌体2次，再加入裂解缓冲液，冰浴中超声破碎菌体，每次破碎5s，间隔2s，功率600W，破碎IOmin ；超声后12000r/min，4°C下离心lOmin，分离可溶组分与和包涵体，进行SDS-PAGE电泳和WesternBlot检测；电泳后将SDS-PAGE凝胶中的条带电转移至硝酸纤维素膜上，以鼠抗His单克隆抗体为一抗，羊抗鼠IgG-HRP为二抗,DAB为显色底物进行Western_blot分析,鉴定表达产物； (3)然后进行工程菌扩大培养和目的蛋白的诱导表达，条件为:25V、IPTG浓度为I. OmmoI/L的条件下诱导培养8小时；取诱导后的菌体，加入结合缓冲液，冰浴中超声波破碎菌体，分离包涵体和可溶组分，将裂解上清液上样于Ni2+-NTA Sepharose 4B亲和层析柱，样品经含O. Γ0. 5mol/L咪唑的缓冲液梯度洗脱，收集融合蛋白洗脱峰进行SDS-PAGE检测。
6.如权利要求5所述的鸡抗菌肽Cathelicidin2的制备方法,其特征是,所述步骤(I)扩增编码鸡抗菌肽Cathelicidin2成熟肽的核苷酸序列的引物为CathL2S F/R，其中F为正向引物，R为反向引物，所述CathL2S F/R的核苷酸序列如SEQ ID NO. 17-18所述。
7.如权利要求4-6中任意一项所述的鸡抗菌肽Cathelicidin2的制备方法,其特征是，鸡抗菌肽鸡抗菌肽Cathelicidin2的编码基因的获取方法为自成年白来航鸡骨髓组织中提取总RNA，经反转录合成cDNA第一链后，再以cDNA为模板，用I对基因特异性引物CathL2Pl/P2进行PCR，扩增产物即为cathelicidin2cDNA全序列；PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳分离并回收目的片段，将目的片段与克隆载体PMD18-T连接并转化E. coli DH5a感受态细胞，阳性菌株用M13F/R引物测序，得到含cathelicidin2开放阅读框的完整核苷酸序列；所述CathL2Pl/P2的核苷酸序列如SEQ ID NO. 13-14所述。
8.权利要求I或2所述的鸡抗菌肽Cathelicidin2在制备治疗革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌或真菌感染引起的疾病的药物中的应用。
9.权利要求I或2所述的鸡抗菌肽Cathelicidin2在制备治疗金黄色葡萄球菌、芽孢杆菌、藤黄微球菌、大肠杆菌、沙门氏菌、巴氏杆菌、鸭疫里默氏杆菌或绿脓杆菌感染引起的疾病的药物中的应用。
全文摘要
本发明公开了一组鸡Cathelicidins抗菌肽及其制备方法和应用。鸡抗菌肽Cathelicidin1和Cathelicidin2的核苷酸序列和氨基酸序列如序列表所示。所述抗菌肽的制备方法为固相化学合成法或基因工程方法，所述基因工程方法是将鸡抗菌肽Cathelicidin1-2成熟肽的编码基因分别克隆到表达载体上，然后导入宿主细胞中表达。本发明应用基因工程技术在原核宿主细胞中高效表达鸡Cathelicidins抗菌肽，经实验证实该组抗菌肽对多种革兰氏阳性菌、阴性菌均有明显的抑制作用。
文档编号A61K38/17GK102911943SQ20121038442
公开日2013年2月6日 申请日期2010年12月22日 优先权日2010年12月22日
发明者吴静, 宋敏训, 李玉峰, 马秀丽, 姜亦飞, 黄兵, 林树乾, 于可响 申请人:山东省农业科学院家禽研究所