专利名称：一种Hib多糖与精制破伤风类毒素偶联工艺的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种Hib多糖与精制破伤风类毒素偶联工艺。
背景技术：
b型流感嗜血杆菌Hib (Hamephilus influenzae type b,简称Hib)多糖疫苗自1985年在美国上市以来对较大儿童接种以后产生了良好的免疫效果，但对18月龄以下婴幼儿不能诱生有效杀菌抗体，也不能诱发免疫记忆，免疫实际效力很低，阻碍了 Hib多糖疫苗的推广使用。第一种Hib多糖疫苗于1985年4月在美国上市，这种疫苗适用于2 5岁的儿童。对于小于18月龄的儿童，这种采用PRP的疫苗的有效率实际为零，成为这种疫苗使用上的最大障碍。据流行病学调查表明，6月龄前儿童就需要保护。结合疫苗的研制成功解决了疫苗在婴幼儿中无效的问题。结合疫苗比以往的疫苗具有更强的免疫原性和更好的免疫效果。结合疫苗于1987年投放市场，主要针对18月龄以上的儿童。在随后几年间，三种新的疫苗很快面市，采用了不同的蛋白作为结合蛋白。这些新疫苗在婴幼儿中非常有效。即使在小年龄的婴儿中使用Hib疫苗，也是安全有效的。Hib荚膜多糖是Hib的主要毒力因子之一，是由以磷酸多聚核糖基核糖醇(PRP)为主要成分的重复单位组成的多聚体，具有较好的免疫原性，可诱发机体产生有效的保护性杀菌抗体。Hib多糖在较大儿童和成年人中诱发很高的杀菌抗体，但对18月龄以下婴幼儿不能诱生有效杀菌抗体，也不能诱发免疫记忆。这是因为多糖属T细胞非依赖性抗原，在免疫系统机能发育尚不完善的2岁以下婴幼儿中，多糖类抗原不能刺激机体产生有效抗体，所以PRP对这一高危人群不能起到有效保护作用。为了改变多糖的非T细胞依赖性，人们将多糖共价偶联到一种蛋白载体上，使之转变为T细胞依赖性抗原，从而解决了在2岁以下婴幼儿免疫原性差的问题。这种新一代结合疫苗不仅在任何年龄段人群中均可诱生出高浓度的以IgG为主的保护性抗体，并可产生明显的免疫回忆反应。在工业化国家和发展中国家，疫苗接种都是唯一能迅速降低Hib疾病发病的公共卫生措施。将Hib疫苗纳入儿童常规免疫规划的国家多数在数年内就实际上消除了 Hib严重病例。由于细菌对一些最有效的抗生素耐药性正在不断增加，通过疫苗预防Hib疾病就变得比以往更为重要。在Hib结合疫苗制备的过程中，Hib精糖与TT (精制破伤风类毒素)偶联是最关键，也是最接近成品的步骤。很多医药公司在去除溴化氢、己二酰肼和碳二亚胺的时候都是采用传统的透析方法，但是透析往往需要2 3天才能完成，并且每4 5个小时候就要换一次透析液，既浪费了大量时间和溶液，也容易被污染。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺点，提供一种提高工作效率、省工省时、节约成本的Hib多糖与精制破伤风类毒素偶联工艺。本发明的目的通过以下技术方案来实现一种Hib多糖与精制破伤风类毒素偶联工艺，它包括Hib多糖-AH衍生物生成和Hib多糖-TT结合物制备两个步骤，
所述的Hib多糖-AH衍生物生成包括以下子步骤Al、多糖溶解，称取Hib多糖，加入灭菌后的注射用水，使其终浓度为I 3mg/ml ；A2、多糖活化，按O. 2 O. 6倍Hib多糖的量加入CNBr进行活化，并维持PH为
9.5 10. 5间反应20 30min ；A3、生成，加入2 5倍于Hib多糖量的ADH进行连接，并维持PH在7. 5 8. 5间反应20 30min ；A4、提纯，用30 50KD的膜包，先用O. 02 O. 05mol/L的NaCl按1:1的体积比进行稀释，然后超滤至1/2体积，反复稀释和超滤10 15次。完成后，用O. 45 μ m滤膜过滤，即为多糖-AH衍生物；
所述的Hib多糖-TT结合物制备包括以下子步骤BI、在多糖-AH衍生物溶液中加入等体积的浓度为I 3mg/ml的TT溶液，充分混匀，在2 8°C温度下反应20 30min ；B2、在PH为5. O 6. O时加入EDAC，充分混匀，并维持PH在5. O 7. O间反应
I.5 2个小时；B3、用30 50KD的膜包，O. I O. 3mol/L的NaCl循环超滤5 10次去除EDAC，得到多糖-TT偶联物；B4、将多糖-TT偶联物经S印harose 4FF凝胶柱分离纯化，用O. I O. 15mol/L的NaCl溶液洗脱，收集VO起始部份的高分子偶联物，并将收集到的洗脱液进行除菌过滤，得到多糖-TT结合物，并置于2 8°C下保存。本发明具有以下优点本发明制备的Hib-TT偶联物的质量指标可达到行业标准；采用超滤代替透析去除溴化氢、己二酰肼和碳二亚胺的方法，提高了工作效率，省工省时，同时，节约了 NaCl溶液的用量；本发明与传统工艺采用的透析相比，减少了样品被污染的几率。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明做进一步的描述实施例I :一种Hib多糖与精制破伤风类毒素偶联工艺，它包括Hib多糖-AH衍生物生成和Hib多糖-TT结合物制备两个步骤，所述的Hib多糖-AH衍生物生成包括以下子步骤Al、多糖溶解，称取Hib多糖，加入灭菌后的注射用水，使其终浓度为lmg/ml ；A2、多糖活化，按O. 3倍Hib多糖的量加入CNBr进行活化，并维持PH为9. 8间反应 25min ；A3、生成，加入3倍于Hib多糖量的ADH进行连接，并维持PH在8. O反应20 30min ；A4、提纯，用30KD的膜包，先用O. 05mol/L的NaCl按I: I的体积比进行稀释，然后超滤至1/2体积，反复稀释和超滤13次。完成后，用O. 45 μ m滤膜过滤，即为多糖-AH衍生物；所述的Hib多糖-TT结合物制备包括以下子步骤
BI、在多糖-AH衍生物溶液中加入等体积的浓度为lmg/ml的TT溶液，充分混匀，在2 8 °C温度下反应20min ；B2、在PH为5. 5时加入EDAC，充分混匀，并维持PH在6. O反应I. 5个小时；B3、用30KD的膜包，O. 2mol/L的NaCl循环超滤10次去除EDAC，得到多糖-TT偶联物；B4、将多糖-TT偶联物经S印harose 4FF凝胶柱分离纯化，用O. 15mol/L的NaCl溶液洗脱，收集VO起始部份的高分子偶联物，并将收集到的洗脱液进行除菌过滤，得到多糖-TT结合物，并置于2 8°C下保存。本实施例样品的检测结果如下取样并按中国药典(2010版第三部)方法检测多糖含量、蛋白含量、高分子结合物 含量、溴化氢、己二酰肼和碳二亚胺残留量，本发明中制备3批多糖-精制破伤风类毒素蛋 白结合物进行检测，其检测结果如下表I、表2所示。实施例2 一种Hib多糖与精制破伤风类毒素偶联工艺，它包括Hib多糖-AH衍生物生成和Hib多糖-TT结合物制备两个步骤，所述的Hib多糖-AH衍生物生成包括以下子步骤Al、多糖溶解，称取Hib多糖，加入灭菌后的注射用水，使其终浓度为2mg/ml ；A2、多糖活化，按O. 2倍Hib多糖的量加入CNBr进行活化，并维持PH为9. 5间反应 30min ；A3、生成，加入5倍于Hib多糖量的ADH进行连接，并维持PH在8. 5反应20min ；A4、提纯，用50KD的膜包，先用O. 02mol/L的NaCl按I: I的体积比进行稀释，然后超滤至1/2体积，反复稀释和超滤15次。完成后，用O. 45 μ m滤膜过滤，即为多糖-AH衍生物；所述的Hib多糖-TT结合物制备包括以下子步骤BI、在多糖-AH衍生物溶液中加入等体积的浓度为2mg/ml的TT溶液，充分混匀，在2 8 °C温度下反应25min ；B2、在PH为6. O时加入EDAC，充分混匀，并维持PH在5. O反应I. 75个小时；B3、用50KD的膜包，O. 3mol/L的NaCl循环超滤9次去除EDAC，得到多糖-TT偶联物；B4、将多糖-TT偶联物经S印harose 4FF凝胶柱分离纯化，用O. 12mol/L的NaCl溶液洗脱，收集VO起始部份的高分子偶联物，并将收集到的洗脱液进行除菌过滤，得到多糖-TT结合物，并置于2 8°C下保存。本实施例样品的检测结果如下取样并按中国药典(2010版第三部)方法检测多糖含量、蛋白含量、高分子结合物含量、溴化氢、己二酰肼和碳二亚胺残留量，本发明中制备3批多糖-精制破伤风类毒素蛋白结合物进行检测，其检测结果如下表I、表2所示。实施例3 一种Hib多糖与精制破伤风类毒素偶联工艺，它包括Hib多糖-AH衍生物生成和Hib多糖-TT结合物制备两个步骤，
所述的Hib多糖-AH衍生物生成包括以下子步骤Al、多糖溶解，称取Hib多糖，加入灭菌后的注射用水，使其终浓度为lmg/ml ；A2、多糖活化，按O. 6倍Hib多糖的量加入CNBr进行活化，并维持PH为10. 5反应20min ；A3、生成，加入2倍于Hib多糖量的ADH进行连接，并维持PH在7. 5反应30min ；A4、提纯，用40KD的膜包，先用O. 03mol/L的NaCl按I: I的体积比进行稀释，然后超滤至1/2体积，反复稀释和超滤10次。完成后，用O. 45 μ m滤膜过滤，即为多糖-AH衍生物；所述的Hib多糖-TT结合物制备包括以下子步骤
BI、在多糖-AH衍生物溶液中加入等体积的浓度为3mg/ml的TT溶液，充分混匀，在2 8 °C温度下反应30min ；B2、在PH为5. O时加入EDAC，充分混匀，并维持PH在7. O反应2个小时；B3、用40KD的膜包，O. lmol/L的NaCl循环超滤5次去除EDAC，得到多糖-TT偶联物；B4、将多糖-TT偶联物经S印harose 4FF凝胶柱分离纯化，用O. lmol/L的NaCl溶液洗脱，收集VO起始部份的高分子偶联物，并将收集到的洗脱液进行除菌过滤，得到多糖-TT结合物，并置于2 8°C下保存。本实施例样品的检测结果如下取样并按中国药典(2010版第三部)方法检测多糖含量、蛋白含量、高分子结合物含量、溴化氢、己二酰肼和碳二亚胺残留量，本发明中制备3批多糖-精制破伤风类毒素蛋白结合物进行检测，其检测结果如下表I、表2所示。表I溴化氢、己二酰肼和碳二亚胺残留量检测结果
#溴化氢己二酰肼碳二亚胺
准(<10ng/mg)(16 45ug/mg)(< 10umol/L)
次
实施例I样品6.7727.055.35
实施例I样品5.8926.024.60
实施例I样品5.0130.185.21表2多糖-TT结合物中多糖含量、蛋白含量、高分子结合物含量检测结果
权利要求
1.一种Hib多糖与精制破伤风类毒素偶联工艺，其特征在于它包括Hib多糖-AH衍生物生成和Hib多糖-TT结合物制备两个步骤， 所述的Hib多糖-AH衍生物生成包括以下子步骤 Al、多糖溶解，称取Hib多糖，加入灭菌后的注射用水，使其终浓度为I 3mg/ml ； A2、多糖活化，按O. 2 O. 6倍Hib多糖的量加入CNBr进行活化，并维持PH为9. 5 10.5间反应20 30min ； A3、生成，加入2 5倍于Hib多糖量的ADH进行连接，并维持PH在7. 5 8. 5间反应20 30min ； A4、提纯，用30 50KD的膜包，先用O. 02 O. 05mol/L的NaCl按I: I的体积比进行稀释，然后超滤至1/2体积，反复稀释和超滤10 15次。
2.完成后,用O.45 μ m滤膜过滤,即为多糖-AH衍生物； 所述的Hib多糖-TT结合物制备包括以下子步骤 BI、在多糖-AH衍生物溶液中加入等体积的浓度为I 3mg/ml的TT溶液，充分混匀，在2 8 °C温度下反应20 30min ； B2、在PH为5. O 6. O时加入EDAC，充分混匀，并维持PH在5. O 7. O间反应I. 5 2个小时； B3、用30 50KD的膜包，O. I O. 3mol/L的NaCl循环超滤5 10次去除EDAC，得到多糖-TT偶联物； B4、将多糖-TT偶联物经S印harose 4FF凝胶柱分离纯化，用O. I O. 15mol/L的NaCl溶液洗脱，收集VO起始部份的高分子偶联物，并将收集到的洗脱液进行除菌过滤，得到多糖-TT结合物，并置于2 8°C下保存。
全文摘要
本发明公开了一种Hib多糖与精制破伤风类毒素偶联工艺，它包括Hib多糖-AH衍生物生成和Hib多糖-TT结合物制备两个步骤，Hib多糖-AH衍生物生成包括以下子步骤A1、多糖溶解，A2、多糖活化，A3、加入ADH进行连接，A4、去除CNBr和ADH；Hib多糖-TT结合物制备包括以下子步骤B1、加入TT溶液，B2、加入EDAC，B3、去除EDAC，得到多糖-TT偶联物；B4、将多糖-TT偶联物分离纯化，洗脱，除菌过滤，得到多糖-TT结合物。本发明的有益效果是提高了工作效率，省工省时，同时，节约了NaCl溶液的用量；本发明与传统工艺采用的透析相比，减少了样品被污染几率。
文档编号A61K47/48GK102861330SQ20121039338
公开日2013年1月9日 申请日期2012年10月16日 优先权日2012年6月29日
发明者陈庚, 伍长华, 罗力心, 吴强, 关晓峰, 陈克平 申请人:成都欧林生物科技股份有限公司