抗-α_vβ₆抗体及其用途的制作方法

专利名称：抗-α_vβ₆抗体及其用途的制作方法
技术领域：
本发明在细胞生物学、免疫学和肿瘤学领域中。具体而言，本发明涉及识别ανβ6整联蛋白的人源化抗体，所述抗体包含非人起源的可变区和人起源的免疫球蛋白的至少一部分。本发明还涉及关于其制备的过程、包含其的药物组合物，以及通过施用人源化抗ανβ6抗体治疗各种疾病的方法。本发明还涉及在肿瘤细胞和组织表面上差异表达的整联蛋白ανβ6的鉴定，这种差异表达在确定肿瘤细胞的转移潜能中的用途，以及使用与整联蛋白α νβ 6结合的配体特别是抗体，诊断和治疗/预防肿瘤转移以及用于清除残留转移性肿瘤细胞的方法。相关领域整联蛋白是结合细胞外基质蛋白且介导细胞-细胞和细胞-细胞外基质相互作用(一般称为细胞粘附事件)的细胞表面糖蛋白受体(Ruoslahti，E.，J. Clin. Invest. 87 :1-5
(1991)；Hynes, R. O. , Cell 69:11-25 (1992))。这些受体由非共价结合的 alpha (α)和beta (β)链构成，所述α链和β链组合以产生具有不同细胞和粘附特异性的各种异二聚蛋白质(Albeda，S. Μ.，Lab. Invest. 68 :4-14 (1993))。近期研究已暗示某些整联蛋白调节各种细胞过程，包括细胞粘附、迁移、侵袭、分化、增殖、凋亡和基因表达(Albeda，S. Μ.，Lab. Invest. 68 :4-14 (1993)；Juliano, R. , CancerMet. Rev. 13 :25-30 (1994)；Ruoslahti,E.和 Reed，J. C.，Cell77 :477-478 (1994);以及 Ruoslahti，E.和 Giancotti，F. G. ,CancerCellsl :119-126 (1989) ;Plow, Haas 等人 2000 ;van der Flier 和 Sonnenberg2001 )。ανβ6受体是作为细胞表面异二聚蛋白质表达的整联蛋白家族成员之一(Busk，Μ.等人，J. Biol. Chem. 267 (9):5790-5796 (1992))。尽管αν亚单位可以与各种β亚单位(β P β 3、β 5、β 6和β 8)形成异二聚体，但β 6亚单位只能与α ν亚单位作为异二聚体表达。α νβ 6整联蛋白已知是纤连蛋白、潜伏相关肽(LAP)和腱生蛋白C结合细胞表面受体，通过其上的RGD三肽结合位点与细胞外基质相互作用(Busk，Μ.等人，J. Biol. Chem. 267 5790-5796 (1992) ；ffeinacker, A.等人，J. Biol. Chem. 269 :6940-6948 (1994) ；Prieto,A. L.等人，Proc. Natl. Acad. Sci USA90 :10154-10158 (1993))。尽管 ανβ6 整联蛋白在超过10年前首次被鉴定和测序，但ανβ6特别是在疾病中的生物学意义仍有待研究。ανβ6的表达局限于上皮细胞，在其中它在健康组织中以相对低的水平表达，且在发育、损伤和创伤愈合期间显著上调(Breuss, J. Μ.等人,J. Histochem. Cytochem. 41 :1521-1527 (1993)；Breuss, J. Μ.等人，J. Cell Sci. 108 :2241-2251 (1995) ；Koivisto, L.等人，Cell Adhes.Communic. 7 :245-257 (1999);Zambruno，G.等人，J. Cell Biol. 129 (3):853-865 (1995)；Hakkinen, L.等人，J. Histochem. Cytochem. 48 (6):985-998 (2000))。日益增加的近期报道证实ανβ6在上皮起源的癌症中是上调的，所述癌症包括结肠癌(Niu，J.等人，Int.J. Cancer92 :40-48 (2001)；Bates,R. C.等人，J. Clin. Invest. 115 :339-347 (2005))、卵巢癌(Ahmed, N.等人，J. Cell Biochem. 84 :675-686 (2002) ；Ahmed, N.等人，J. Histochem.Cytochem. 50 :1371-1379 (2002) ；Ahmed, N.等人，Carcinogen. 23 :237-244 (2002))、鳞状细胞癌(Koivisto, L.等人，Exp. Cell Res. 255 :10-17 (2000) ；Xue, H.等人，Biochem.Biophys. Res. Comm. 288 :610-618 (2001) ；Thomas, G. J.等人，J. Invest. Derma toll 17 67-73 (2001) ；Thomas, G. J.等人，Int. J. Cancer 92 :641-650 (2001) ；Ramos, D. M.等人，MatrixBiol. 21 :297-307 (2002)； (Agrez,M.等人，Br. J. Cancer81 :90-97 (1999)；Hamidi,S.等人,Br. J. Cancer82 (8):1433-1440 (2000)；Kawashima,A.等人，Pathol. Res. Pract. 99
(2):57-64 (2003))，和乳腺癌(Arihiro，K.等人，Breast Cancer7 :19-26 (2000))。已报道a v亚单位可能涉及肿瘤转移，和阻断这种亚单位从而可以预防转移(关于综述，参见Imhof, B. A.等人，in ,Attempts to Understand Metastasis Formation I. ^U. Giinthert和 ff. Birchmeier, eds.，Berlin Springer-Verlag,第 195-203 页(1996))。ανβ6整联蛋白在肿瘤细胞生物学中可能具有多重调节功能。近期研究已证实β6亚单位的细胞外和细胞质结构域介导不同细胞活性。细胞外和跨膜结构域已显示介导 TGF-β 活化和粘附(Sheppard, D. , Cancer and Metastasis Rev. 24 :395-402 (2005)；Munger, J. S.等人，Cell96 :319-328 (1999))。β 6亚单位的细胞质结构域包含独特的11氨基酸序列，所述氨基酸序列在介导α νβ 6调节的细胞增殖、MMP生产、迁移和前存活中是重要的(Li，X.等人，J. Biol. Chem. 278(43) :41646-41653 (2003) ；Thomas, G. J.等人，J. Invest. Derm. 117 (1):67-73 (2001) ；Thomas, G. J.等人，Br.J. Cancer 87 (8):859-867 (2002)；Janes,S. M.和 Watt，F. M.，J. Cell Bioll66 (3):419-431 (2004))。β6亚单位已被克隆、表达和纯化(Sheppard等人,美国专利号6，787，322B2,所述专利的公开内容整体引入本文作为参考)，和与ανβ6整联蛋白选择性结合的功能阻断性抗体已被报道(Weinreb等人，J. Biol. Chem. 279 :17875-17877 (2004)，其公开内容整体引入本文作为参考)。ανβ6拮抗剂(包括某些单克隆抗体)已提议作为某些形式的急性肺损伤和纤维化的可能治疗(参见美国专利号6，692，741Β2和WO 99/07405，所述专利的公开内容整体引入本文作为参考)。 α νβ 6可以通过与精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(“RGD”)基序的直接相互作用与几种配体结合，所述配体包括纤连蛋白、腱生蛋白、和潜伏相关肽I和3(LAP1和LAP3)，潜伏前体形式的 TGF-β I 的 N 末端 278 氨基酸(Busk，M.等人，J. Biol. Chem. 267 (9):5790-5796
(1992)；Yokosaki,Y.等人，J. Biol. Chem. 271(39):24144-24150( 1996)；Huang,X. Z.等人，J. Cell Sci. Ill :2189-2195( 1998)；Munger, J. S.等人，Cell96 :319-328( 1999))。TGF-β细胞因子作为潜伏复合物合成，所述潜伏复合物具有与成熟活性TGF-β细胞因子的C末端非共价结合的N末端LAP。潜伏TGF-β复合物不能与其同源受体结合，且因此直到转换成活性形式才是生物学活性的(Barcellos-Hoff，M. H.，J Mamm. Gland Biol. I (4) :353-363(1996) ；Gleizes, P. E.等人，Stem Cells 15 (3):190-197 (1997) ；Munger, J. S.等人，Kid. Int. 51 :1376-1382 (1997)；Khalil,N. ,Microbes Infect.I (15):1255-1263 (1999))。α v β 6与LAPl或LAP3结合导致潜伏前体形式的TGF- β I和TGF- β 3活化(Munger，J. S.等人，Cell96 :319-328 (1999))，被提议是因为潜伏复合物中的构象变化允许TGF-β与其受体结合。因此，α νβ6的表达上调可以导致TGF-β局部活化，这依次可以激活下游事件级联事件。
TGF-β I细胞因子是调节细胞增殖、分化和免疫应答的多效生长因子(Wahl，S. M. , J. Exp. Med. 180 1587-1590 (1994) ；Massague, J. , Annu. Rev. Biochem. 67 753-791 (1998) ；Chen, ff.和 Wahl, S. M. , TGF-β Receptors, Signaling Pathways andAutoimmunity, Basel :Karger,第 62-91 页(2002) ；Thomas, D. A. ^PMassague, J. , CancerCell 8 :369-380 (2005))。TGF-β I在癌症中发挥的作用是两面的。虽然TGF-β被公认是肿瘤抑制物和生长抑制活性，但许多肿瘤进化出针对TGF-β I的生长抑制活性的抗性(Yingling, J. M.等人，Nature Rev. Drug Discov. 3 (12):1011-1022 (2004) ；Akhurst,RJ.等人，Trends Cell Biol. 11 (11) :S44_S51 (2001) ；Balmain, A.和 Akhurst, R. J.，Nature 428 (6980) =271-272 (2004))。在已建立的肿瘤中，TGF-β I表达和活性已涉及促进肿瘤存活、进展和转移(Akhurst，R. J.等人，Trends Cell Biol. 11 (11) S44-S51
(2001)；Muraoka, R. S.等人，J. Clin. Invest. 109 (12):1551 (2002) ；Yang, Y. A.等人，J. Clin. Invest. 109 (12):1607-1615 (2002))。这假定通过局部肿瘤-基质环境中的自分泌和旁分泌效应介导，所述效应包括TGF-β对免疫监督、血管发生和增加的肿瘤组织间隙压的影响。几项研究已显示抑制TGF-β I的抗肿瘤和抗转移效应(Akhurst，R. J.，J. Clin.Invest. 109 (12):1533-1536 (2002) ；Muraoka, R. S.等人，J. Clin. Invest. 109 (12):1551
(2002)；Yingling, J. M.等人，Nat. Rev. Drug Discov. 3 (12) :1011-1022 (2004) ；Yang,Y. A.等人，J. Clin. Invest. 109 (12) :1607-1615 (2002) ；Halder, S. K.等人，Neoplasia7
(5):509-521 (2005) ；Iyer, S.等人，Cancer Biol. Ther. 4 (3):261-266 (2005))。α νβ6在肿瘤特别是在肿瘤-基质界面上的表达增加，可能反映TGF-β I局部激活的独特机制以及促进肿瘤存活、侵袭和转移的能力。在人转移灶中高水平的表达推断α νβ 6在建立转移灶中的潜在作用，这与α νβ6可以介导上皮至间充质过渡、肿瘤细胞体外侵袭、和表达与小鼠模型中的转移相关的先前报道一致(Bates，R.C.等人，J. Clin. Invest. 115
(2):339-347 (2005) ；Thomas, G. J.等人，Br. J. Cancer 87 (8):859-867 (2002) ；Morgan,M. R.等人，J. Biol. Chem. 279 (25) :26533-26539 (2004))。我们先前已描述了有效和选择性抗ανβ6单克隆抗体(mAbs)的产生，所述抗ανβ6单克隆抗体与人和鼠类形式的ανβ6结合，且阻断ανβ6与其配体的结合和ανβ6介导的 TGF-β I 激活(Weinreb，P. H.等人，J. Biol. Chem. 279 (17):17875-17887 (2004))。同样在整体引入本文作为参考的PCT公开WO 03/100033中描述，开发和表征了针对ανβ6的高亲和力抗体，包括此类抗体互补决定区(⑶Rs)中的关键氨基酸残基的鉴定和分析。特别地，这些高亲和力抗体(a)与ανβ6特异性结合；(b)抑制ανβ6与其配体例如LAP、纤连蛋白、玻连蛋白和腱生蛋白的结合，其IC5tl值低于10D5的那种(国际专利申请公开WO99/07405) ; (c)阻断TGF-β激活；(d)包含在CDRs中提供针对α νβ 6的结合特异性的某些氨基酸序列；(e)与β 6亚单位特异性结合；和/或(f)在免疫染色操作中识别α νβ 6，例如石蜡包埋组织的免疫染色。WO 03/100033还描述了下述发现与α ν β 6结合的抗体可以分类为生物物理学不同的类别和亚类。一类抗体显示阻断配体(例如，LAP)与ανβ6结合的能力(阻断剂)。这类抗体可以进一步分成阳离子依赖性阻断剂和阳离子非依赖性阻断剂亚类。某些阳离子依赖性阻断剂包含精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)肽序列，而阳离子非依赖性阻断剂不包含RGD序列。另一类抗体显示与ανβ6结合的能力，但不阻断ανβ6与配体的结合(非阻断剂)。此外，WO 03/100033公开了包含重链和轻链的抗体，所述重链和轻链的互补决定区(⑶R) 1、2和3由某些氨基酸序列组成，所述氨基酸序列提供针对α νβ 6的结合特异性。WO 03/100033还提供了与ανβ6特异性结合但不抑制α νβ 6与潜伏相关肽(LAP)结合的抗体，以及与相同表位结合的抗体。W003/100033 进一步公开了杂交瘤 6. 1Α8、6· 2Β10、6· 3G9、6. 8G6、6. 2Β1、6· 2A1、6. 2Ε5、7· 1G10、7. 7G5和7. 1C5细胞，包含编码序列的分离核酸，和包含抗ανβ6抗体的氨基酸序列的分离多肽。特别地，W003/100033公开了作为通过杂交瘤6. 1A8、6. 3G9、6. 8G6、6. 2Β1、6· 2Β10、6· 2Α1、6· 2Ε5、7· 1G10、7. 7G5或7. 1C5生产的抗体，包含重和轻链多肽序列的抗ανβ6抗体。几种杂交瘤根据布达佩斯条约保藏于美国典型培养物保藏中心(“ATCC”；P. O. Boxl549, Manassas, VA20108, USA)。特别地，杂交瘤克隆 6. 3G9 和 6. 8G6 于 2001 年 8月16日保藏，且分别具有登记号ATCC PTA-3649和PTA-3645。由杂交瘤6. 3G9和6. 8G6生 产的鼠类抗体在本申请中进一步探究其作为人源化抗体的潜在发展。鼠类单克隆抗体3G9是鼠类IgGl，从用人可溶性ανβ6免疫的@6整联蛋白-/-小鼠中分离的K抗体(Huang等人，J. Cell Biol. 133 :921-928( 1996))。3G9抗体特异性识别在损伤、纤维化和癌症期间以上调水平表达的ανβ6整联蛋白表位(参见，例如，Thomas等人，J. Invest. Dermatologyl 17 :67-73 (2001)；Brunton 等人，Neoplasia3 :215-226 (2001)；Agrez 等人，Int.J. Cancer81 :90-97 (1999) ；Breuss, J. Cell Sciencel08:2241-2251(1995))。它不与其他联蛋白结合且与人和鼠类分子交叉反应。鼠类单克隆抗体3G9已描述阻断ανβ6与LAP的结合，如通过阻断配体与纯化的人可溶性ανβ6或β 6表达细胞的结合，从而抑制TGF-β受体活化的促纤维化活性所确定的(参见W003/100033)。它还已显示抑制ανβ6介导的TGF-β活化,其IC5tl值低于已知α νβ 6抗体10D5的那种(Huang等人，J Cell Sci. Ill :2189-2195 (1998))。如WO 03/100033中所述，鼠类单克隆抗体8G6是鼠类IgGl，同样识别α νβ 6整联蛋白表位的K抗体。鼠类单克隆抗体8G6是阳离子依赖性、高亲和力ανβ6阻断剂，显示抑制ανβ6介导的TGF-β活化的能力，其IC5tl值低于已知10D5的那种(参见WO 03/100033)。如WO 03/100033中所述，3G9和8G6鼠类抗体在预防肾和肺纤维化方面有效。此夕卜，鼠类抗体3G9能够有效抑制人肿瘤异种移植模型中的肿瘤生长，暗示α νβ 6在癌症病理学中的潜在作用和使用针对α ν β 6抗体的此类阻断的效力。因此，需要开发在人中抗原性更少、且可以用于治疗涉及ανβ6途径的疾病的ανβ6抗体。随着重组DNA方法的出现，已可能在结构上改造抗体基因、和产生具有不能通过杂交瘤技术获得的特性的改良抗体分子。在治疗领域中，这种方法的一个目标是通过修饰其初级氨基酸结构减少啮齿类动物单克隆抗体在人中的免疫原性。治疗抗体免疫原性的减少是希望的，因为免疫应答的诱导可以在患者中引起一系列不利效应，从治疗抗体的加速清除，功效随之丧失，至最极端的致命性过敏反应。减少外源单克隆抗体的免疫原性的一种策略是用人起源的类似结构域替换单克隆抗体的轻和重链恒定结构域，而使外源抗体的可变区结构域保持完整。轻和重链的可变区结构域负责抗体和抗原之间的相互作用。具有与人恒定结构域连接的小鼠可变结构域的嵌合抗体分子，通常以与嵌合体来源于其的小鼠抗体相同的亲和常数结合抗原。此类嵌合抗体在人中比其完全小鼠配对物免疫原性更少。然而，保留完整鼠类可变结构域的抗体往往在大部分患者中引起免疫应答。可预测人将设定针对整个鼠类可变结构域的免疫应答，因此，甚至在此类标准嵌合抗体的临床试验已报道前，就已开始获得具有更多人特征的可变结构域的努力。通常称为“人源化”的一类方法旨在通过重组构建具有小鼠和人特征的抗体可变结构域，将鼠类单克隆抗体的可变结构域转变成更人的形式。人源化策略基于抗体结构数据的几个一致同意的理解。首先，可变结构域包含在种类内保守、但在进化上遥远的种类例如小鼠和人之间不同的肽序列邻接段。其次，其他邻接段在种类内不是保守的、但即使在相同个体内的抗体产生细胞之间也不同。第三，抗体和抗原之间的接触主要通过可变结构域的非保守区域发生。第四，抗体可变结构域的分子结构在种类中非常相似，使得种类之间的相应氨基酸残基位置可以无需实验数据单独基于位置来鉴定。 人源化策略共有下述前提用人抗体相应位置中发现的残基替换鼠类序列特征的氨基酸残基，将减少所得到的抗体在人中的免疫原性。然而，种类之间的序列替换通常导致抗体与其抗原的结合减少。人源化技术因此存在下述平衡替换原始鼠类序列以减少免疫原性，和需要人源化分子以保留足够的抗原结合以在治疗上有用。这种平衡已使用2种方法达到。在由美国专利号No. 5，869，619例示的一种方法中，特有的人残基代替鼠类可变结构域残基，所述鼠类可变结构域残基被确定或预测(i)在与抗原的相互作用中不发挥显著的化学作用、和(ii)与伸出到溶剂内的侧链一起放置。因此，远离抗原结合位点的外部残基被人源化，而内部残基、抗原结合位点、和形成可变结构域之间的界面的残基保留鼠类的。这种方法的一个缺点是需要相当广泛的实验数据，以确定残基在抗原结合中不发挥显著的化学作用，还是在特定三维抗体结构中将位于溶剂中。在由美国专利号5，225，539例示的另一种更普遍的方法中，视为保守的鼠类可变结构域肽序列的邻接段用来自人抗体的相应段替换。在这种更普遍的方法中，所有可变结构域残基都是人源化的，除了涉及抗原结合的非保守区域外。为了确定用于替换的合适邻接段，美国专利号5，225，539利用先前已由Wu和Kabat，J Exp Med. 132 (2):211-250(1970)开发的抗体可变结构域序列分类。Wu和Kabat开创了抗体肽序列比对，并且他们在这点上的贡献是数倍首先，通过研究可变结构域之间的序列相似性，他们鉴定了在所有脊椎动物种类的所有抗体中或多或少同源的相应残基，因为它们采取类似的三维结构、发挥类似的功能作用、与邻近残基类似地相互作用、和存在于类似的化学环境中。其次，他们设计了其中同源免疫球蛋白残基被分配相同位置编号的肽序列编号系统。无需依赖除序列自身以外的任何实验数据，本领域技术人员即可明确地将现在通常称为Kabat编号分配给任何可变结构域序列。第三，对于每个Kabat编号序列位置，Kabat和Wu计算出变异性，所述变异性意指当可变结构域序列比对时更少或更多可能的氨基酸的发现。他们鉴定了包埋在4个变异性较少的邻接区域内的3个高变异性的邻接区域。其他工作者先前已指出大约在这些区域(高变区)中的变异性，且断定高变区表示用于抗原结合的氨基酸残基。Kabat和Wu正式区分构成这些可变段的残基，且将这些命名为“互补决定区”(⑶Rs)，指抗体和抗原之间的化学互补性。在可变结构域三维折叠而不是抗原识别中的作用，归于现在称为“框架区”的剩余变异性较少的区域。第四，Kabat和Wu建立了抗体肽和核酸序列的公众数据库，所述公众数据库继续被维持且是本领域技术人员众所周知的。由美国专利号5，225，539公开的使用Kabat分类的人源化方法，产生包含来自一种抗体的CDR和来自另一种抗体的框架区的嵌合抗体，所述第二种抗体在种类起源、特异性、亚类或其他特征方面不同。然而，没有具体序列或特性归于框架区，事实上，美国专利号5，225，539教导任何框架组可以与任何⑶R组进行组合。框架序列因此已被识别为对赋予抗体可变区的三维结构是重要的，所述三维结构是保持良好的抗原结合所需的。本领域中的后续发展已在美国专利号5，225，539的范围内改进，以处理相对于相应的小鼠抗体，使用某些人源化抗体观察到的对于抗原的亲合力丧失。美国专利号5，693，761公开了关于美国专利号5，225，539用于抗体人源化的一种改进，且基于下述前提将亲合力丧失归于人源化框架中的结构基序问题，由于立体或其他化学不相容性，所述结构基序干扰CDRs折叠成在小鼠抗体中发现的能够结合的构象。为了解决这个问题，美国专利号5，693，761教导使用在线性肽序列中与待人源化的小鼠抗体的·框架序列紧密同源的人框架序列。因此，美国专利号5，693，761的方法集中于种类间的框架序列比较。一般地，所有可用的人可变结构域序列与特定小鼠序列比较，且计算出相应框架残基之间的同一性百分比。选择具有最高百分比的人可变结构域以提供用于人源化计划的框架序列。美国专利号5，693，761还教导在人源化框架中保留来自小鼠框架的某些氨基酸残基是重要的，所述氨基酸残基对支持能够结合的构象的CDRs是关键的。在其他方法中，通过使单个残基回复小鼠序列且如Riechmann等人，Nature332(6162):323-327 (1988)所述测定抗原结合，获得低亲和力的人源化构建体后，在实验上测定特定框架氨基酸残基的关键性。用于鉴定框架序列中的氨基酸关键性的另一种示例方法由美国专利号5，821，337和美国专利号5，859，205公开。这些参考文献公开了框架中的特异性Kabat残基位置，所述残基位置在人源化抗体中可能需要用相应的小鼠氨基酸置换，以保留亲合力。因此，所得到的部分人和部分小鼠的构建框架仍经常显示人免疫原性或减少的抗原结合，从而在框架构建中需要众多反复以获得用于治疗用途的合适框架。本领域因此需要开发在人中抗原性更少的ανβ6抗体。本发明为产生与ανβ6特异性反应的人源化抗体作准备。本发明还提供了用于制备此类人源化抗体的方法，通过提供可靠鉴定合适的人框架序列以支持非人CDR区域的人源化抗体，和进一步提供保留高抗原结合、在人中具有低免疫原性的人源化抗体。本发明还提供了与ανβ6反应的此类人源化抗体在各种疾病和病症治疗、诊断和/或预防中的用途。发明简述本发明至少部分基于针对α νβ 6的高亲和力人源化抗体的开发和表征，包括此类抗体互补决定区(CDRs)中的关键氣基酸残基的鉴定和分析，以及框架序列中的关键氣基酸残基的鉴定和分析。在一个实施方案中，本发明涉及具有对于ανβ6整联蛋白的结合特异性的人源化单克隆抗体，其中所述抗体分别包含SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2的重和轻链可变结构域。此类人源化抗体来源于鼠类3G9抗体的人源化，在某些实施方案中，人源化抗体包含作为其互补决定区(⑶R) 1、2和3的分别由SEQ ID NO :1的氨基酸残基31 — 35、50 — 65和98 - 109限定的重链。在某些实施方案中，人源化抗体包含作为其⑶Rl、2和3的分别由SEQ ID NO:2的氨基酸残基24-35、51-57和90-98限定的轻链。在某些实施方案中，人源化抗体包含作为其框架区(FR)1、2、3和4的分别由SEQ ID NO 1的氨基酸残基1_30、36_49、66-97和110-120限定的重链。在某些实施方案中，人源化抗体包含作为其框架区(FR) I、
2、3和4的分别由SEQ ID NO 2的氨基酸残基1_23、36-50、58_89和99-108限定的轻链。在某些实施方案中，人源化抗体包含在SEQ ID NO :1的重链，且在SEQ ID N0:1的重链包含至少一个下述氨基酸置换Q3M和N74S。在某些实施方案中，人源化抗体包含SEQID NO 2的轻链，且SEQ ID NO 2的轻链包含至少一个下述氨基酸置换E1Q、L47W、I58V、A60V 和 Y87F。在某些实施方案中，人源化抗体包含重链形式I (“HV1”)，其中重链由具有氨基酸置换Q3M和N74S的SEQ ID N0:1组成。在某些实施方案中，人源化抗体包含重链形式2(“HV2”)，其中重链由具有氨基酸置换N74S的SEQ ID NO: I组成。在某些实施方案中，人源化抗体包含重链形式3 (“HV3”)，其中重链由SEQ ID NO :I组成。在某些实施方案中，人源化抗体包含轻链形式I (“LV1”)，其中轻链由具有氨基酸置换L47W、I58V、A60V和Y87F的SEQ ID NO :2组成。在某些实施方案中，人源化抗体包含轻链形式2 (“LV2”)，其中轻链由具有氨基酸置换L47W和I58V的SEQ ID NO :2组成。在某些实施方案中，人源化抗体包含轻链形式3(“LV3”)，其中轻链由具有氨基酸置换L47W的SEQ ID N0:2组成。在某些实施方案中，人源化抗体包含轻链形式4 (“LV4”)，其中轻链由具有氨基酸置换ElQ和L47WSEQ ID NO 2组成。在某些实施方案中，人源化抗体包含轻链形式5 (“LV5”)，其中轻链由SEQ ID NO 2组成。在某些实施方案中，人源化抗体包含具有HV3和LV5的重和轻链可变结构域，其中重链由SEQ ID NO 1组成，和其中轻链由SEQ ID NO 2组成。在某些实施方案中，人源化抗体具有来源于鼠类6. 3G9抗体(ATCC登记号PTA-3649)的 CDR。在相关实施方案中，本发明还涉及具有对于α ν β 6整联蛋白的结合特异性的人源化单克隆抗体，其中所述抗体包含SEQ ID NO :3和SEQ ID NO :4的重和轻链可变结构域。此类人源化抗体来源于鼠类8G6抗体的人源化。在某些实施方案中，人源化抗体包含下述重链，作为其互补决定区(⑶R)l、2和3分别由SEQ ID NO :3的氨基酸残基(B卩，除了某些保守变异外)31 - 35,50 - 66和99 一 115限定。在某些实施方案中，人源化抗体包含下述轻链，作为其CDRU2和3分别由SEQ ID NO 4的氨基酸残基24-38,54-60和93-101限定。在某些实施方案中，人源化抗体包含下述重链，作为其框架区(FR)1、2、3和4分别由SEQ IDNO 3的氨基酸残基1-30、36-49、67-98和116-126限定。在某些实施方案中，人源化抗体包含下述轻链，作为其FR1、2、3和4分别由SEQ ID NO :4的氨基酸残基1-23、39_53、61_92和102-111限定。在某些实施方案中，人源化抗体包含下述重链，所述重链由具有至少一个下述氨基酸置换A24G、G26S、Q39L、M48I、V68A、R72V和T74K的SEQ ID NO :3 组成。在某些实施方案中，人源化抗体包含下述轻链，所述轻链由具有至少一个下述氨基酸置换E1D、L46F和 Y49K 的 SEQ ID NO 4 组成。在某些实施方案中，人源化抗体包含其中重链由SEQ ID NO :3的氨基酸置换八246、6263、03^481、￥684、1 72￥和1741(组成的重链形式I (“HV1”)。在某些实施方案中，人源化抗体包含重链形式2 (“HV2”)，其中所述重链由具有氨基酸置换M48I、V68A、R72V和T74K的SEQ ID NO :3组成。在某些实施方案中，人源化抗体包含重链形式3 (“HV3”)，其中所述重链由具有氨基酸置换V68A、R72V和T74K的SEQ ID NO 3组成。在某些实施方案中，人源化抗体包含轻链形式I (light versionl, “LV1”),其中所述轻链由具有氨基酸置换E1D、L46F和Y49K的SEQ ID NO 4组成。在某些实施方案中，人源化抗体包含轻链形式2 (“LV2”)，其中所述轻链由具有氨基酸置换L46F和Y49K的SEQID N0:4组成。在某些实施方案中，人源化抗体包含轻链形式3 (“LV3”)，其中所述轻链由具有氨基酸置换Y49K的SEQ ID NO :4组成。在某些实施方案中，人源化抗体具有来源于鼠类6. 8G6抗体的⑶R。在某些实施方案中，人源化抗体可以与鼠类8G6抗体竞争结合ανβ6。
本发明还包含结合与任何上述抗体相同的表位的人源化抗体。本发明还包含通过重组载体产生的人源化抗体，所述重组载体包含编码所述抗体的核酸。在某些实施方案中，重组载体是选自PKJS195 (SEQ ID NO :5)、pKJS189 (SEQ IDNO :6)和 pKJS196 (SEQ ID NO :7)的质粒。本发明还包含包括关于SEQ ID NO I — 7中任何一个的编码序列的分尚核酸，和包含SEQ ID NO 1 - 7中任何一个的氨基酸序列的分离多肽。本发明还包含包括任何上述人源化抗体的核酸的重组载体。本发明还包含包括重组载体的宿主细胞，所述重组载体包含任何上述人源化抗体的核酸。本发明还包含组合物，所述组合物包含本发明的一种或多种人源化抗体和药学可接受的载体。在这些组合物的一些中，人源化抗体与细胞毒素剂(即损害细胞存活力和/或功能的试剂)例如毒素或放射性核素缀合。组合物可以施用于具有由ανβ6介导的疾病、或处于具有由ανβ6介导的疾病危险中的受试者(例如哺乳动物，例如人)，以便治疗(例如，减轻、缓和、减低、预防、延缓发作)疾病。此类疾病的例子包括但不限于纤维化(例如，硬皮病、瘢痕化、肝纤维化、肺纤维化和肾纤维化)；牛皮癣；癌症(如本文其他地方所述，例如上皮癌；口腔、皮肤、子宫颈、卵巢、咽、喉、食道、肺、乳腺、肾、胰腺、前列腺或结肠直肠癌)；阿尔波特氏综合征；肺、肝、肾及其他内脏器官的急性和慢性损伤；以及肺、肝、肾及其他内脏器官的硬化症。具有此类疾病的危险可以起因于遗传倾向；某些生活方式例如吸烟和酗酒；暴露于环境污染物例如石棉；生理条件例如糖尿病、肝炎病毒感染(丙型肝炎病毒感染)、自身免疫性疾病；和医学处理例如放射疗法。本发明还包含通过在适合于人源化抗体表达的条件下培养任何上述宿主细胞，制备任何上述人源化抗体的方法，其中使人源化抗体链表达和产生人源化抗体。在某些实施方案中，该方法进一步包括分离人源化抗体的步骤。在某些实施方案中，宿主细胞是CHO细胞。杂交瘤克隆6. 3G9和6. 8G6根据布达佩斯条约于2001年8月16日保藏于美国典型培养物保藏中心(“ATCC” ；Ρ. O. Box 1549，Manassas, VA 20108，USA)，且分别具有登记号ATCC PTA-3649 和-3645。本发明的人源化抗体指完整抗体，例如包含2条重链和2条轻链的抗体，或完整抗体的抗原结合片段，例如Fab片段、Fab’片段、F (ab’)2片段或F (V)片段。本发明的人源化抗体可以是任何同种型和亚型，例如IgA (例如，IgAl和IgA2)、IgG (例如，IgGU IgG2、IgG3和IgG4)、IgE、IgD、IgM，其中免疫球蛋白的轻链可以是κ或λ类型。在某些实施方案中，本发明的人源化抗体可以包含在重链的一个或多个(例如，2、
3、4、5或6)特定位置上的突变(例如，缺失、置换或添加)，从而使得抗体的效应子作用(例如，抗体与Fe受体或补体因子结合的能力)被改变，而不影响抗体的抗原结合能力。在其他实施方案中，本发明的人源化抗体可以包含在糖基化位点的氨基酸残基上的突变，从而使得糖基化位点被消除。此类人源化抗体可以具有临床利益，减少效应子作用或其他不希望有的功能，同时保留其抗原结合亲和力。糖基化位点的突变还可以有利于方法开发(例如，蛋白质表达和纯化)。在本发明的某些实施方案中，人源化抗体包含其⑶Rs来源于鼠类3G9抗体的去糖 基轻链。在某些实施方案中，人源化3G9抗体包含轻链可变结构域，其中CDRl区包含在SEQID NO :2氨基酸残基26上的天冬酰胺(N)至丝氨酸(S)的置换。鼠类3G9⑶Rl区包含在这个氨基酸位置上的天冬酰胺。然而，在3G9抗体的人源化形式中，所有5种轻链形式(LV1、LV2、LV3、LV4和LV5)包含在3G9CDR1区内的这个位置上的丝氨酸。在人源化3G9抗体的所有轻链形式中这个位点的去糖基化(aglycosyl)已显示有利于蛋白质表达和轻链纯化。在某些其他实施方案中，人源化3G9抗体包含在通常是正常Fe受体结合所需的糖基化位点上的突变。在某些实施方案中，人源化3G9抗体包含天冬酰胺(N)至谷氨酰胺(Q)的氨基酸置换。在某些实施方案中，人源化3G9抗体包含在重链形式3 (HV3)中N至Q的氨基酸置换，所述HV3由包含质粒pKJS196 (SEQ ID NO :7)的重组载体产生。在某些实施方案中，N至Q的氨基酸置换在SEQ ID NO :7的氨基酸残基319上发生。人源化3G9抗体的重链形式3 (HV3)中这个位点的去糖基化已显示去除糖基化信号，而不影响人源化抗体的抗原结合亲和力，所述糖基化信号是正常Fe受体结合所需的。在某些实施方案中，人源化3G9抗体包含由包含质粒PKJS189 (SEQ ID NO :6)的重组载体产生的重链形式3 (HV3)，和由包含质粒PKJS195 (SEQ ID NO :5)的重组载体产生的轻链形式5 (LV5)。在某些实施方案中，人源化3G9抗体包含由包含质粒pKJS196 (SEQ ID NO :7)的重组载体产生的去糖基重链形式3 (a-HV3)，和由包含质粒pKJS195 (SEQ ID NO :5)的重组载体产生的轻链形式5 (LV5)。在再其他的实施方案中，重或轻链可以包含增加亲和力或效力的突变。本发明的人源化抗体对于治疗任何临床上不希望有的病状或疾病(如本文所述)有用，所述病状或疾病由ανβ6与其配体例如LAP和纤连蛋白结合来介导。这些人源化抗体经由更高的亲和力或亲合力、以及与配体的阳离子依赖性或非依赖性结合，可以比先前已知的ανβ6抗体更有效。与鼠类单克隆抗体形成对比，本发明的人源化抗体在受试者特别是人体内将不引起抗小鼠免疫球蛋白抗体产生，而是显示延长的血液半衰期，不利反应的频率减少，从而使得可以预期它在治疗由ανβ6介导的疾病功效方面优于小鼠单克隆抗体。在另外的方面，本发明涉及使用ανβ6结合配体例如ανβ6结合抗体，诊断、治疗和预防癌症的方法。在一个实施方案中，本发明提供了用于减少或预防患者中的原发性肿瘤转移至次级部位的方法，所述方法包括给患者施用治疗有效量的一种或多种配体，所述配体与原发性肿瘤中的一种或多种细胞上的一个或多个整联蛋白α νβ6亚单位结合，其中配体与整联蛋白的结合导致肿瘤细胞死亡、化学敏感性或侵袭力减少。在相关实施方案中，本发明提供了减少或预防患者中的转移前肿瘤进展至转移性肿瘤的方法，所述方法包括给患者施用治疗有效量的一种或多种配体，所述配体与转移前肿瘤中的一种或多种细胞上的一个或多个整联蛋白ανβ6亚单位结合，其中配体与整联蛋白的结合导致减少或预防转移前癌症细胞侵入原发性肿瘤周围的组织区域内。在本发明的某些此类实施方案中，肿瘤细胞是癌，例如腺癌。在更具体的实施方案中，癌是乳腺癌、子宫内膜癌、胰腺癌、结肠直肠癌、肺癌、卵巢癌、子宫颈癌、前列腺癌、肝癌、食道癌、头与颈癌、胃癌或脾脏癌。更具体而言，癌是乳腺癌(包括但不限于原位乳腺癌，例如原位导管癌(DCIS)和原位小叶癌(LCIS))、子宫内膜癌、胰腺癌、结肠直肠癌、子宫颈癌或肺癌。根据本发明的这个方面的合适实施方案使用ανβ6整联蛋白结合配体，所述结合配体是ανβ6结合抗体或其ανβ6表位结合片段。根据某些此类实施方案，抗体是单克隆抗体(它可以是嵌合、灵长类化或人源化的)，包括美国专利申请公开号US 2005/0255102Α1中公开的那些，所述专利的公开内容整体引入本文。合适的此类抗体包括但不限于，命名为1A8、3G9、8G6、2B1、2B10、2A1、2E5、1G10、7G5、1C5、10D5 (ATCC 保藏号 HB12382)和 CS β 6 的ανβ6结合单克隆抗体，及其片段、嵌合体和杂交物。特别适合于在本发明的此类实施方案中使用的是单克隆抗体3G9和8G6。同样特别适合于在本发明的此类实施方案中使用的是人源化单克隆抗体，例如命名为hu3G9 (BG00011)的人源化3G9抗体和命名为hu8G6的人源化8G6抗体。在本发明的某些此类治疗实施方案中，ανβ6结合配体(例如，ανβ6结合抗体)与一种或多种细胞毒素化合物或试剂缀合或结合，在α ν β 6结合配体-毒素化合物缀合物与细胞或组织上的一种或多种α νβ 6整联蛋白结合后，所述细胞毒素化合物或试剂导致或引起细胞或组织死亡。在本发明另外的治疗实施方案中，ανβ6结合配体(例如，ανβ6结合抗体)结合一种或多种此类细胞毒素化合物或试剂施用于患者。可以根据本发明的这些方面适当使用的细胞毒素化合物或试剂包括但不限于，细胞毒素剂(例如，顺钼、卡钼、奥沙利钼、紫杉醇、美法仑、阿霉素、氨甲蝶呤、5—氟尿嘧唆、依托泊苷、氮芥、环磷酰胺、博来霉素、卡里奇霉素(calicheamicin)、美登素、单端孢霉烯族毒素(trichothene)、CC1065、白喉A链、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)外毒素A链、蓖麻毒素A链、相思豆毒蛋白 A链、蒴莲素A链、α -八叠球菌、油桐(Aleuritesfordii)蛋白质、石竹素蛋白质、美洲商陆(Phytolaca americana)蛋白质、苦瓜抑制剂、湾果素、巴豆毒素、司盘奥那(sapaonariaofficinalis)抑制剂、白树毒素、丝裂素(mitogellin)、局限曲霉素、酹霉素、依诺霉素、单端孢霉烯族毒素、核糖核酸酶和脱氧核糖核酸酶)，放射性同位素(例如211At、131I、125I、9°Y、186Re,188Re,153Sm^212Bi,32P和Lu的放射性同位素)，和前体药物活化酶(例如碱性磷酸酶、芳香基硫酸酯酶、胞嘧啶脱氨酶、蛋白酶、D 一丙氨酰羧肽酶、碳水化合物切割酶、P —内酰胺酶和青霉素酰胺酶)。在某些实施方案中，一种或多种ανβ6整联蛋白结合配体以药物组合物的形式施用于患者，所述药物组合物包含有效量的一种或多种ανβ6整联蛋白结合配体和一种或多种药学可接受的载体或赋形剂。一种或多种ανβ6整联蛋白结合配体和/或包含一种或多种ανβ6整联蛋白结合配体的一种或多种药物组合物，可以通过施用药物组合物的任何合适方式施用于患者，包括但不限于，口部施用、肠胃外施用(包括例如，经由肌内、静脉内、动脉内、腹膜内或皮下途径注射)、颅内施用、经皮施用、肺内施用和鼻内施用。
在另外的实施方案中，本发明提供了诊断或鉴定更可能进展至侵袭癌的癌例如腺癌，和/或更可能响应使用配体的治疗的癌，所述配体与一种或多种整联蛋白ανβ6亚单位结合。合适的此类方法可以包括例如，Ca)从患者获得包含肿瘤或其部分的癌性上皮组织样品，和非癌性上皮组织样品；(b)使组织样品与一种或多种配体接触，所述配体与一个或多个整联蛋白ανβ6亚 单位结合；和(c)测定组织样品中的整联蛋白ανβ6表达水平，其中相对于非癌性组织样品中的整联蛋白α νβ 6表达水平，癌性组织样品中的整联蛋白ανβ6表达水平增加指示在患者中存在癌，所述癌(a)从原位或非侵袭形式进展至侵袭、转移形式的可能性增加；和/或(b)更可能响应使用一种或多种上述治疗方法的治疗，所述治疗方法依赖于α νβ 6结合配体的结合，特别是与一种或多种细胞毒素化合物或试剂缀合的ανβ6结合配体，或与一种或多种细胞毒素化合物或试剂结合施用的ανβ6结合配体，所述细胞毒素化合物或试剂例如上文描述的那些。此类方法适合于诊断或鉴定各种癌，包括但不限于上文所述涉及上皮组织的那些。在某些此类实施方案中，与一个或多个整联蛋白ανβ6亚单位结合的配体是ανβ6整联蛋白结合抗体(它可以是单克隆抗体，例如上文描述的那些)或其ανβ6表位结合片段。特别适合于在本发明的此类诊断方法中使用的是可检测标记的α νβ 6结合配体(例如，抗体)，即包含至少一种可检测标记、与至少一种可检测标记缀合或结合的α ν β 6结合配体，所述可检测标记例如生色标记(例如，二氨基联苯胺或4 一羟基偶氮苯一 2—羧酸)，酶标记(例如，苹果酸脱氢酶、葡萄球菌核酸酶、δ —5—类固醇异构酶、酵母乙醇脱氢酶、α 一甘油磷酸脱氢酶、磷酸丙糖异构酶、过氧化物酶、碱性磷酸酶、天冬酰胺酶、葡萄糖氧化酶、β 一半乳糖苷酶、核糖核酸酶、尿素酶、过氧化氢酶、葡萄糖一 6 —磷酸脱氢酶、葡萄糖淀粉酶或乙酰胆碱酯酶)，放射性同位素标记(例如，3H、mIn、125I、131I、32P、35S、14C、51Cr、57T0、58C0、59Fe、75Se、152Eu、9°Y、67Cu、217Ci、211At、212Pb、47Sc 或 109Pd),非放射性同位素标记(例如，157Gd、55Mn、162Dy、52Tr、56Fe、99mTc或112In),荧光标记(例如，152Eu标记、荧光素标记、异硫氰酸酯标记、罗丹明标记、藻红蛋白标记、藻蓝蛋白标记、别藻蓝蛋白标记、绿色突光蛋白(GFP)标记、邻苯二醒标记或突光胺标记),毒素标记(例如，白喉毒素标记、蓖麻毒素标记或霍乱毒素标记)，化学发光标记(例如，鲁米诺标记、异鲁米诺标记、芳香族吖啶酯标记、咪唑标记、吖啶鎗盐标记、草酸酯标记、萤光素标记、萤光素酶标记或水母素标记)，X放射照相标记(例如，钡或铯)，自旋标记(例如，氣)，和核磁共振对比剂标记(例如，GcUMn和铁)。在另外的实施方案中，本发明提供了清除患者中的ανβ6阳性转移性肿瘤细胞的方法，所述方法包括给患者施用治疗有效量的一种或多种配体，所述配体与一种或多种ανβ6阳性转移性肿瘤细胞上的一个或多个整联蛋白α ν β 6亚单位结合，其中配体与整联蛋白的结合导致转移性肿瘤细胞死亡、化学敏化或侵袭力减少。此类方法适合于清除患者中的各种转移性肿瘤细胞，例如起因于转移癌的那些，所述癌包括但不限于上文所述涉及上皮组织的那些。根据本发明的这个方面的合适实施方案使用ανβ6整联蛋白结合配体，所述结合配体是α ν β 6结合抗体或其α ν β 6表位结合片段，特别是上文所述的单克隆抗体、或其变体或片段。在本发明的某些此类治疗实施方案中，α ν β 6结合配体(例如，α ν β 6结合抗体)与一种或多种细胞毒素化合物或试剂缀合或结合，在α ν β 6结合配体-毒素化合物缀合物与细胞或组织上的一种或多种α νβ 6整联蛋白结合后，所述细胞毒素化合物或试剂导致或引起细胞或组织死亡。在本发明另外的治疗实施方案中，ανβ6结合配体(例如，ανβ6结合抗体)结合一种或多种此类细胞毒素化合物或试剂施用于患者。可以根据本发明的这些方面适当使用的细胞毒素化合物或试剂包括但不限于，上文描述的细胞毒素剂、放射性同位素和前体药物活化酶。根据本发明的这个方面，ανβ6整联蛋白结合配体，或包含配体和一种或多种药学载体或赋形剂的药物组合物，可以根据上述施用方式施用于患者。在另外的实施方案中，本发明提供了手术摘除来自患者组织或器官的肿瘤后清除来自患者的残留ανβ6阳性肿瘤细胞的方法，所述方法包括给患者施用治疗有效量的一种或多种配体，所述配体与组织或器官中的一种或多种残留肿瘤细胞上的一个或多个整联蛋白α νβ6亚单位结合，其中配体与所述整联蛋白的结合导致肿瘤细胞死亡、化学敏感性或侵袭力减少。此类方法适合于清除各种患者组织中的各种转移性肿瘤细胞，例如起因于癌的那些，所述癌包括但不限于上文所述涉及上皮组织的那些。根据本发明的这个方面的合适实施方案使用ct νβ 6整联蛋白结合配体，所述结合配体是ανβ6结合抗体或其ανβ6表位结合片段，特别是上文所述的单克隆抗体、或其变体或片段。在本发明的某些此类治疗实施方案中，ανβ6结合配体(例如，ανβ6结合抗体)与一种或多种细胞毒素化合物或试剂缀
合或结合，在ανβ6结合配体-毒素化合物缀合物与细胞或组织上的一种或多种ανβ6整联蛋白结合后，所述细胞毒素化合物或试剂导致或引起细胞或组织死亡。可以根据本发明的这个方面适当使用的细胞毒素化合物或试剂包括但不限于，上文描述的细胞毒素剂、放射性同位素和前体药物活化酶。根据本发明的下述附图和描述以及权利要求，本发明的其他优选实施方案对于普通技术人员将是显而易见的。附图简述图I是纯化的、嵌合化3G9变体与α νβ 6的结合ELISA测定法。用可溶性α νβ 6包被的板与下述抗体一起温育纯化的杂交瘤来源的鼠类3G9抗体(m3G9)、纯化的嵌合3G9抗体(ch3G9)、或在轻链第I个⑶R中的N联糖基化位点内包含N至S置换的纯化的嵌合3G9抗体(ch3G9S)。用洗涤缓冲液洗涤后，板与过氧化物缀合的抗小鼠IgG (对于杂交瘤来源的材料)或抗人IgG (对于嵌合抗体)一起温育，随后用洗涤缓冲液洗涤。板用TMB溶液显色，反应用硫酸中止且用板阅读仪在A45tl处测定。在2种形式的嵌合3G9抗体之间没有可检测的显著差异。图2所示结果显示使用Easy Titer Assay (Pierce)来自转染的293E细胞的3G9人源化变体表达。通过Easy Titer方法根据制造商的方案(Pierce)测定来自瞬时转染的293E细胞的上清液的抗体滴度。分析人源化3G9抗体的不同变体的表达。包含轻链形式I的3G9变体表达很差，而包含轻链形式2的变体以较高水平表达。随着渐增的人源化存在朝向更高表达的趋势。图3显示如通过流式细胞术测定法确定的，hu_3G9抗体变体与ανβ6整联蛋白表达SW480细胞结合的FACS分析结果。SW480细胞通过胰酶消化进行收获、洗涤且重悬浮于FACS缓冲液中。2χ105细胞随后在冰上、在包含指示转染上清液的FACS缓冲液中温育I小时，所述上清液的滴度通过Easy Titer方法根据制造商的方案(Pierce)来测定。温育后，细胞用FACS缓冲液洗漆,且重悬浮于包含藻红蛋白缀合的抗人IgG (JacksonImmunoResearch)的FACS缓冲液中，且在冰上温育30分钟。细胞随后进行洗涤且重悬浮于200 μ I FACS缓冲液中，标记的次级抗体的结合通过流式细胞术来监控。测试的所有人源化形式与SW480细胞的结合至少与嵌合3G9 —样好。包含轻链形式2的变体显著超过嵌合3G9的活性。抗淋巴毒素β受体抗体Hu-BHAlO充当阴性对照。图4显示hu-3G9抗体形式2 — 5与FDCPl- β 6细胞结合的FACS分析。FACS分析如图3中所述 进行，除了使用FDCPl-β 6细胞代替SW480细胞外。完全人源化的变体形式5 (H3/L5)与FDCPl-β 6的结合明显比所有其他人源化形式更好。图5显示纯化的hu-3G9抗体形式2 — 5与FDCPl- β 6细胞结合的FACS分析。FACS分析使用纯化的3G9人源化形式如图4中所述进行。完全人源化的变体形式5 (H3/L5)与FDCPl-β 6的结合明显比所有其他人源化形式更好。图6是纯化的hu_3G9抗体形式2 — 5与α ν β 6结合的结合ELISA测定法。结合ELISA如图I中所述进行。人源化3G9形式5 (H3/L5)显得比其他抗体衍生物略微更好地
与α νβ 6结合。图7是纯化的hu_3G9抗体形式2 — 5与α ν β 6结合的阻断ELISA。板用O. 3 μ g/ml LAP或2. 5 μ g/ml LAP-Fc融合蛋白包被,且于4°C温育过夜。去除包被溶液并且将板阻断、洗涤、且在钙和镁的存在下如图例中标明的与生物素化的α νβ 6和3G9衍生物混合物一起温育。板再次进行洗涤、且与超抗生物素蛋白(extravidin)-辣根过氧化物酶缀合物(Sigma)—起温育。结合蛋白使用TMB底物进行检测随后在板阅读仪中在A45tl处检测。人源化3G9形式5 (H3/L5)显得比其他抗体衍生物略微更好地阻断α νβ 6与LAP的结合。图8显示来自纯化的hu_3G9抗体形式2 — 5的细胞粘附测定法结果。微量滴定板用50 μ I/孔的O. 5 μ g/ml LAP于4°C包被过夜。板随后进行洗涤和阻断。使FDCPl- β 6细胞(5χ106细胞/ml)与培养瓶分离,用突光染料(Calcein-AM,Molecular Probes,Eugene,OR)标记且重悬浮于测定缓冲液中。在钙和镁的存在下，板与上文所述的纯化抗体以及标记FDCPl-β 6细胞一起温育。将板洗涤且记录由于板上捕获细胞的荧光。结合百分比通过比较总细胞的荧光与结合细胞的那种进行测定。人源化3G9形式5 (H3/L5)显得比其他抗体衍生物略微更好地阻断α ν β 6表达细胞与LAP的结合。图9是pKJS195的质粒图和3G9形式5轻链序列的图示。这种质粒包含3G9形式5轻链(LV5)和新霉素抗性基因。轻链表达盒包含人CMV立即早期启动子和第I个内含子(包含小缺失)以及人生长激素多腺苷酸化序列。

图10是pKJS189的质粒图和3G9形式3重链序列的图示。这种质粒包含3G9形式3重链(HV3)和二氢叶酸还原酶(dhfr)基因。重链表达盒包含人CMV立即早期启动子和第I个内含子(包含小缺失)以及人生长激素多腺苷酸化序列。dhfr表达盒包含SV40早期启动子和SV40多腺苷酸化序列。图11是pKJS196的质粒图和去糖基3G9形式3重链序列的图示。这种质粒包含去糖基-3G9形式3重链(a-HV3)和dhfr基因。这种构建体等同于pKJS189，除了消除重链恒定区中的N联糖基化位点的N319Q置换外。图12显不使用Easy Titer Assay (Pierce)瞬时转染到CHO细胞内的hu_3G9CH0表达载体的装配和表达结果。Easy Titer测定法如图2中所述根据制造商的方案(Pierce)进行。将野生型(H3/L5)和去糖基(a-H3/L5)人源化3G9形式5载体瞬时转染到CHO细胞内，以证实来自这些细胞的人源化3G9的有效装配和分泌。2种形式的hu3G9抗体在CHO细胞中同样装配和表达。
图13的复合显微照片描述了某些人癌中的ανβ6表达(暗区)水平，所述癌已从所示原发性肿瘤位点转移至淋巴结(图13Α - 13D)或肺(图13Ε 一 13F)。图14的复合显微照片描述了某些人癌中的ανβ6表达(暗区)水平，所述癌已从所示原发性肿瘤位点转移至所示转移性肿瘤位点。图15的复合显微照片描述了在原发性子宫内膜癌肿瘤(图15A，15C)和匹配的淋巴结转移灶(图15B，15D)中观察到的ανβ6表达(暗区)水平。图16的复合显微照片描述了在人乳腺肿瘤样品中观察到的％06表达(暗区)水平。图16Α:来自具有原位管瘤(DCIS)患者的原发性肿瘤样品中的表达。图16Β:来自具有侵袭乳腺癌患者的原发性肿瘤样品中的表达。图17的复合显微照片描述了来自3个不同患者的原发性和转移性胰腺管腺癌肿 瘤的匹配样品中观察到的ανβ6表达(暗区)水平。图17Α— 17C:来自3个不同患者的原发性肿瘤样品中的表达。图17D — 17F:来自这3个相同患者的匹配淋巴结转移灶中的表达。图17G — 17Η :从3个患者中的2个获得的正常胰腺组织中的表达。图18的复合显微照片描述了来自5个不同患者的原发性和转移性胰腺腺癌肿瘤的匹配样品中观察到的ανβ6表达(暗区)水平。图18Α— 18Ε:来自5个不同患者的原发性肿瘤样品中的表达，3个具有表征为腺鳞状的肿瘤(图18Α — 18C)，和2个具有表征为低分化的肿瘤(图18D— 18Ε)。图18F— 18J :来自这5个相同患者的匹配淋巴结转移灶中的表达。图18Κ - 18L :从5个患者中的2个获得的正常胰腺组织中的表达。图19表示抗α νβ 6单克隆抗体(3G9)在人胰腺癌的BxPC_3小鼠异种移植模型中抑制肿瘤生长的能力。图19A:经由免疫组织化学用抗ανβ6单克隆抗体(3G9)染色的异种移植肿瘤切片的显微照片。图19Β:在用avi36mAb 3G9 (▲)、可溶性TGFbRII-Fc-Ig融合蛋白(▼)、或媒介物PBS (■)处理期间，BxPC-3异种移植肿瘤的生长曲线。图19C:在研究结束时(第66天)单个肿瘤大小的散布图。图20的一系列条形图表示抗ανβ6单克隆抗体(3G9)、和可溶性TGF-β受体-抗体片段缀合物(sTGF-β RII-Fc)，对表达β6 (用β6转染)的VB6细胞和模拟转染细胞的跨基质迁移、侵袭和基质金属蛋白酶9 (ΜΜΡ9)生产的影响。图20Α和20Β :细胞经过细胞外基质的迁移(图20Α)或侵袭(图20Β)。1社”:未处理的细胞；“369”:用10 μ g/ml 369 ανβ6单克隆抗体处理的细胞；“sTGFbR-Fc”:用10 μ g/ml可溶性TGF-β RII-Fc缀合物处理的细胞。空心条用β6整联蛋白转染且表达36整联蛋白的细胞(VB6细胞)；实心条不表达β6整联蛋白的模拟转染细胞(Cl细胞)。图20C:通过未处理(空心条)、用lOyg/ml 3G9处理(阴影条)、或用10 μ g/ml sTGF-β RII-Fc缀合物处理(实心条)的Cl或VB6细胞生产的MMP9 (ng/ml)。图21是免疫组织化学切片的显微照片，表示在侵袭到UM1863异种移植模型基质内的肿瘤细胞上的ανβ6表达(暗区)。关于连续切片的抗人角蛋白染色(未显示)确定这些细胞是人上皮(即，LIM1863)肿瘤衍生的。图22Α —22F描述了 α ν β 6mAb3G9和重组可溶性TGFbRII-Fc-Ig融合蛋白在UMl863异种移植肿瘤模型中对肿瘤生长和基质侵袭的影响。图22A:在用avi36mAb 3G9C4)、可溶性TGFbRII-Fc-Ig融合蛋白(▼)、或媒介物PBS (■)处理期间，LIM1863异种移植肿瘤的生长曲线。图22B:在研究结束时(第52天)单个肿瘤大小的散布图。图22C:在整个肿瘤切片上ανβ6阳性区的定量。图22D - 22F :描述从每个所示处理组收获的肿瘤中的代表性ανβ6染色的显微照片。图23Α - 23D是来自各种细胞系的荧光激活细胞分选仪(FACS)分析的直方图，所述细胞系用鼠类3G9mAb或对照mAb处理，且表示m3G9与NHP ανβ6表达细胞系的结合水平(A，Vero ；B, LLC-MK2 ；C, 12MBr6 ;D，4MBr5)。图24A - 24B的滴定曲线表示鼠类3G9与NHP α v β 6表达细胞系的结合水平(A，12MBr6 ;B，4MBr5)。图25的条形图表示NHP ανβ6表达细胞系与LAP的粘附(A，12MBr6 ;B，4MBr5)。图26A - 26B的滴定曲线表示经由m3G9抑制NHP α νβ 6表达细胞系与LAP的粘附(A,12MBr6 ;B，4MBr5)。
图27的条形图表示经由人和灵长类α νβ 6表达细胞系的潜伏TGFP活化。图28的滴定曲线表示在SW480 β 6和4MBr5细胞系上经由m3G9抑制TGFP活化。图29的一系列显微照片表示人肾脏疾病中的ανβ6免疫染色。(A)用α ν β 6mAb(红色)和泛细胞角蛋白mAb (绿色)免疫染色的冷冻人肾切片。(B)用avP6mAb免疫染色的石蜡包埋的人肾切片。图30表示Col4A3+/_和Col4A3_/_小鼠肾中的α νβ 6免疫染色。图30Α :来自7周大的Col4A3+/_小鼠和Col4A3-/_小鼠的冷冻肾切片的显微照片，所述小鼠用avP6mAb (红色)和泛细胞角蛋白mAb (绿色)免疫染色。图30B:来自用α νβ 6mAb免疫染色的、4和8周大的Col4A3+/_小鼠和Col4A3-/_小鼠的石蜡包埋的肾切片。图30C :表示在来自4、7和8周大的Co 14A3+/-小鼠和Co 14A3-/-小鼠(n=3 )肾中α ν β 6免疫染色定量的条形图。图31 表示 av36mAb 结合的特异性。图 31A : α νβ 6mAbs (3G9、8G6、8B3)、抗 a vmAb (RMV-7)、阴性对照mAbs (1E6和M0PC21 )、和同位素对照(大鼠IgGl)与NIH3T3细胞和NIH3T3b6细胞结合的流式细胞术分析。图31B :用抗avi36mAb (人/小鼠嵌合3G9)免疫染色的Col4A3-/-、和Col4A3-/_ ； β 6~/~肾切片。图31C :用抗a v多克隆抗体免疫染色的 Col4A3-/-、和 Col4A3-/- ； β 6~/~ 肾切片。图32表示使用各种处理的Col4A3-/_肾中的SMA免疫染色。图32A :显示关于3周一 8. 5周大的处理的Col4A3-/_小鼠、和年龄相一致的未处理的Col4A3+/_小鼠肾中免疫染色的SMA (红色)和层粘连蛋白(绿色)。显示了关于每个处理组的代表性切片的免疫染色(皮质和髓质)(n=8/组)。图32B和32C 3 一 7周大或3周一 8. 5周大的未处理的Col4A3+/-小鼠、和用各种试剂处理的Col4A3-/_小鼠肾中的SMA定量。显示相对于全图像大小，关于皮质(32B)和髓质(32C)的阳性免疫染色百分比。关于每个处理组的N值在散布图中指定。(*=ρ〈0· 01,**=ρ<0. 05，*#=ρ〈(λ 001比较处理组与阴性对照mAb，1E6，处理的)。图33A和33B的散布图表示mRNA水平的胶原Ia I (图33A)、和胶原I a 2 (图33B)的Taqman分析。RNA从7周大的未处理或处理的Col4A3_/_小鼠和7周大的未处理的Col4A3+/+小鼠肾中分离。图34的一对散布图表示用延迟mAb处理的SMA免疫染色的Col4A3_/_肾。未处理的8. 5周Col4A3+/-;未处理的6周Col4A3-/_ ;未处理的8. 5周Col4A3-/_ ;和用1E6和3G9处理6周一 8. 5周的8. 5周Col4A3-/_小鼠。N值在散布图中指定。*=p〈0. 0005，比较处理与阴性对照1E6，处理的Col4A3-/_小鼠。**=p〈0. 02比较处理与未处理的6周Col4A3-/-小鼠。图35描述了 7周大的Col4A3-/_小鼠肾中的基因表达和调节模式。显示的是对于在p〈0. 01时野生型(WT)和未处理的Alport (UN)组之间2倍或更多的差异选择的395个GeneChip探针组。热柱图显示关于单个实验组的相对基因表达水平模式。每个柱表示对于5只小鼠的单个实验组395个标准化的平均探针组信号强度值。如色带所示，在实验条件中基因表达的变化反映在颜色变化中。进行二维分级聚类以探究实验组中的关系(由树状图显示)。图36A —36D的条形图显示与C014A3-/-肾中的肾脏疾病相关的ανβ6依赖基因的功能注释。分别对探针组列表进行Ingenuity Pathways Analysis(IPA),所述列表对应与野生型比较Alport肾中过量表达或表达不足的基因。对于IPA使用的列表是最初对于Alport和野生型组之间的显著(>2倍，p〈0. 01)差异选择的395个探针组的子集。显示的是与基因相关的生物学功能(A，C)和正规途径(B，D)的等级次序列表，所述基因在7周大·的Alport小鼠肾中过量表达(A，B)和下调(C，D)。图37A - 37C是基因的子集和网络分析图示，所述基因在Col4A3-/_肾中差异表达且由阻断性α νβ 6mAb处理来调节。图37A :探针组列表的Venn图。Venn圆圈、其并集、和交集面积与相应列表中的探针组数目成比例。图37B，37C :最高评分的调节网络推断显著(处理和天然Alport肾之间的差异>2倍，ρ〈0· 05)受α νβ 6阻断性mAbs3G9 (图37B)和8G6 (图37C)影响的探针组列表。网络边缘显示基因中的相互作用方向，所述基因描述为节点且根据其细胞定位来排列。图38描述了 TGF-β I表达的免疫组织化学和Taqman分析。图38A:来自对于TGF-β I表达进行免疫染色、用所示试剂处理的Col4A3+/_和Col4A3-/_小鼠的肾切片。显示关于来自每个处理组的代表性切片的染色。图38B :在处理组中TGF-β I mRNA水平的Taqman 分析。图39描述了关于肾中胶原表达的三色染色法。对于10周大的Col4A3+/+;β 6+/+, Col4A3-/_ ； β 6+/+,和Col4A3-/_ ； β 6-/-小鼠进行染色。显不关于肾皮质(图39Α)和髓质(图39Β)区域的代表性组织切片。图40Α和40Β的散布图描述使用剂量逐渐增加的3G9处理的SMA免疫染色。显示关于用指定剂量的mu3G9、或10mg/kg mulE6 (IgG对照)处理后，肾小球(皮质)(图40A)、和间质(髓质)(图40B)区域的SMA免疫染色的定量分析，所述处理为每周3次，从3到7周大。关于皮质的ED5tl=O. 4mg/kg ;关于髓质的ED5tl=O. 3mg/kg。水平线表示平均值。图41的一系列显微照片表示正常肾和UUO后的肾中ανβ6表达的免疫组织化学分析。图41Α :正常未损伤的肾；图4川UU0后7天；图41C :UU0后10天；图41D :UU0后14天。图42的一系列显微照片表示α νβ 6上调在照射后18周时发生。用14Gy照射的C57BL/6小鼠在所示时间点时被处死，且肺切片用抗β 6抗体染色。图43的一对显微照片表示α νβ 6表达上调在纤维化区域中持续。肺切片如图I中对于β 6表达进行染色。切片来自14-Gy照射后24周(左)或27周(右)时被处死的小鼠。两种切片都显示具有表达高水平ανβ6的许多上皮细胞的纤维化损伤。在邻近的非纤维化上皮中，α νβ 6表达在24周时仍然很高但到27周时明显少得多。图44的一系列显微照片表示Itgbe-/-小鼠被保护不受辐射诱导的肺纤维化。Itgb6+/+和Itgb6-/_小鼠(C57BL/6背景)暴露于14_Gy胸部辐射。27周后，小鼠被处死且左肺用Masson’s三色进行染色。显示代表性肺；总之，21/23只Itgb6+/+小鼠具有明显的纤维化，而17只Itgb6-/-小鼠中没有一只具有纤维化。图45的条形图表示如通过羟脯氨酸测量的，Itgbe-/-小鼠被保护不受辐射诱导的肺纤维化。照射的Itgbe+/+肺的胶原含量显著大于未照射的Itgbe+/+肺以及照射和未照射的Itgb6-/_肺的那种(对照射的Itgb6+/+p〈0. 03,对于每个组N=5 — 6)。图46的线条图表示在ανβ6整联蛋白缺乏不影响在肺照射后的存活。Itgb6+/+和Itgb6-/_小鼠组用14Gy照射。关于2个组的存活曲线没有显著不同(WT=Itgb6+/+，K0=Itgb6-/-)。图47的散布图描述了在照射后26周时被处死，接受3G9、可溶性TGF β R或对照AbIP的小鼠中的肺纤维化测量。肺纤维化在接受lrng/kg/周3G9的小鼠中被预防。每个点表示单个小鼠，条表示平均值。在O. 3-mg/kg组和对照组之间在纤维化中没有差异。1-mg/kg组的纤维化明显少于对照。10-mg/kg和可溶性TGFii受体组具有更少的纤维化，但与对照的差异没有达到显著性。图48的散布图描述了在接受3G9、可溶性TGF β R或对照Ab IP的所有小鼠(从照射后20到26周被处死的小鼠、垂死小鼠、和被发现死亡的小鼠)中的肺纤维化测量。数据如图47中呈现。在O. 3-mg/kg组和对照组之间在纤维化中没有差异。1-mg/kg、10-mg/kg和可溶性TGF β受体组的纤维化明显少于对照。图49的条形图描述了来自在照射后26周时被处死，接受3G9、可溶性TGF β R或对照Ab IP的小鼠的BAL细胞分类计数。图50的线条图表示接受IP3G9抗体注射的14_Gy照射小鼠具有与对照类似的存活。对所有组进行存活分析作为复合分析(P=0. 088, C=对照,0. 3=0. 3mg/kg, l=lmg/kg,SolR=可溶性 TGFP 受体，10=10mg/kg)。图51的条形图描述了用3G9 (1、3、6或10mg/kg)每周I次SC处理的小鼠中的肺纤维化测量。显示了关于所有小鼠(被发现死亡/垂死小鼠和被处死的小鼠)、在28或32周时被处死的小鼠、和被发现死亡/垂死小鼠的分别结果。与所有抗体组比较，在对照中存在显著增加的纤维化(对于所有剂量对对照P〈0. 05)。图52的条形图描述了来自在照射后28或32周时被处死，接受3G9或对照Ab SC的小鼠的BAL细胞分类计数。3、6和10mg/kg的3G9剂量导致嗜中性粒细胞和淋巴细胞的百分比明显增加(对于所有比较p〈0. 05 )。图53的一系列显微照片描述了在对照对3G9处理小鼠中的BAL细胞外观。在对照细胞离心涂片器(cytospin)中可见正常肺泡巨曬细胞。来自用lmg/kg3G9处理的小鼠的BAL细胞类似于对照。在3mg/kg剂量时，许多大的泡沫状巨噬细胞变得明显。(类似巨曬细胞在Itgb6-/_小鼠中可见。)在更高剂量时(本文显示的6mg/kg和10mg/kg),增加数目的嗜中性粒细胞(箭头)和淋巴细胞以及某些细胞碎片是显而易见的。图54的线条图描述了在照射后28周时被处死的小鼠股的卡普兰-迈耶存活曲线。
图55的线条图描述了在照射后32周时被处死的小鼠股的卡普兰-迈耶存活曲线。图56的条形图表示与照射后存活32周的小鼠比较，RV/LV质量比在照射后29 —32周之间死亡的小鼠中增加。将小鼠心脏固定在福尔马林中。解剖不含左心室加隔膜(LV)的右心室(RV)，且对组织进行称重。相同品系的7只未照射小鼠用作对照。条表示平均值+/-SD0显示关于所有小鼠(用1E6对照抗体或任何剂量的3G9处理的小鼠)、用对照抗体1E6处理的小鼠、和用任何剂量的3G9处理的小鼠的照射小鼠数据。小鼠数目如下未照射小鼠，N=7 ;1E6处理的小鼠存活的N=10，死亡的N=5 ;3G9处理的小鼠存活的，N=8，死亡的N=9。RV/LV比在存活的小鼠中与未照射对照没有显著不同。相比之下，与未照射小鼠比较，RV/LV比在死亡的小鼠(所有小鼠以及1E6和3G9子集)中显著增加(P〈0. 02)。同样，与存活的等价小鼠组比较，RV/LV比在死亡的小鼠(所有小鼠以及1E6和3G9子集)中显著增加(Ρ〈0· 0007)。
图57的一对显微照片描述了来自被发现死亡的小鼠的肺，所述小鼠已用对照抗体(1Ε6)，左，或用抗ανβ6抗体(3G9，lmg/kg/周)，右处理。指出在肺泡壁中缺乏红细胞的周围区域。这种表现与灌注丧失一致。图58的一系列显微照片描述了人肺病中的ανβ6表达，表明ανβ6表达在人肺病中显著上调。人和小鼠肺的石蜡组织切片用ανβ6特异性抗体进行免疫染色，以显示正常(图58Α)以及患病肺特发性肺纤维化(图58Β)、弥漫性间质性肺病(图58C)和弥漫性间质性肺病(图58D)中的相对表达水平。染色代表在下文表16-1 (实施例16)中概述的41个不同患者样品中可见的上调水平。图59的一系列显微照片描述了博来霉素肺纤维化模型中的ανβ6表达，表明ανβ6表达在博来霉素诱导的肺纤维化小鼠模型中显著上调。小鼠肺的石蜡组织切片用ανβ6特异性抗体进行免疫染色，以显示博来霉素滴注肺中的相对表达水平。图60的一系列条形图描述了 mu3G9处理对博来霉素处理的SV129小鼠中肺羟脯氨酸含量的影响。在对于列出的各种治疗期所示的前3次实验中，小鼠各自接受4mg/kgmu3G9 (阻断性α νβ 6mAb)>lE6 (对照IgGl)。在第4次实验中，小鼠各自接受PBS、4mg/kgmu3G9 (阻断性 α νβ 6mAb)>4B4 (非阻断性 α νβ 6mAb)、或 8G6 (第二种阻断性 α νβ 6mAb),每周3次，博来霉素处理后15到60天。误差条表示标准误。组平均值和标准差在实施例16的附录A中提供。图61的一系列条形图描述了 mu3G9处理对博来霉素处理的C57B16小鼠中胶原含量(组织形态测定术)的影响。小鼠接受每周3次剂量的mu3G9 (阻断性avi36mAb)、8G6(第二种阻断性 ave6mAb)、8B3 (非阻断性 av^6mAb)UE6 (对照 IgGl mAb)、或 sTGFbR (可溶性TGF-β受体一关于TGF-β抑制的阳性对照)。在所示的前3次实验中(图61A、61B和61C)，小鼠在博来霉素攻击前I天开始处理、且在第14天时实施安乐死。在前2次实验中(图61A和61B)，每种试剂的剂量是4mg/kg，而在第3次实验(图61C)中，mu3G9的剂量如所不的改变。在最后一次实验中(图61D),小鼠在博来霉素攻击后14天开始处理、且在弟28天时实施安乐死。组织学切片用三色染色、成像、且使用Metamorph软件计算蓝染(含胶原)组织的面积作为组织总面积百分比。误差条表示标准误。组平均值和标准差在实施例16的附录B中提供。*=通过ANOVA与PBS处理组显著不同。
图62的条形图描述了使用胶原报道小鼠在博来霉素肺纤维化中的mu3G9。将博来霉素气管内滴注到胶原-萤光素酶报道小鼠内。小鼠在博来霉素损伤前当天用PBS，5mg/kg可溶性TGF-bRII-Ig，或剂量为O. 1,0. 3、I. 0、3和10mg/kg的mu3G9开始处理，每周I次，共2周。还包括用4mg/kg mu3G9每周处理3次的另外小鼠组(3X4mg/kg)。假小鼠用气管内盐水滴注且用PBS处理。肺萤光素酶含量在第14天时测定。误差条表示标准误。组平均值和标准差在实施例16的附录C中提供。*=通过ANOVA与PBS处理组显著不同。图63的一系列线条图描述了时程，以评估在博来霉素攻击小鼠中低有效剂量的mu3G9对主·要BAL细胞群体的影响。小鼠在第O天时用博来霉素滴注到肺内。在第_1和+6天时，小鼠用PBS，剂量为O. 3、I. O和3. Omg/kg的mu3G9，或剂量为I. Omg/kg的对照IgGl(1E6)处理。细胞在第2、5、8和11天时被处死，且收集肺并评估总BAL细胞计数。巨噬细胞、嗜中性粒细胞和淋巴细胞群体通过细胞涂片离心器区分染色进行分析。组平均值和标准差在实施例16的附录C中提供。图64的一系列条形图描述了在弟5天时在博来霉素攻击小鼠中，闻剂量的mu3G9对主要BAL细胞群体的影响。小鼠在第O天时用博来霉素滴注到肺内。在第-I、+1和+3天时，小鼠用PBS，剂量为4、20和40mg/kg的mu3G9,或剂量为20和40mg/kg的对照IgGlmAb (1E6)处理。小鼠在第5天时被处死，且收集肺并评估总BAL细胞计数。巨噬细胞、嗜中性粒细胞和淋巴细胞群体通过细胞涂片离心器区分染色进行分析。组平均值和标准差在实施例16的附录D中提供。*=p〈0. 05相对于博来霉素攻击的用PBS处理的对照，而不是相对于用1E6 IgGl mAb处理的对照。图65描述了 mu3G9在仓鼠的多剂量博来霉素模型中缺乏功效。在第0、7和14天时，用博来霉素(BL)或盐水(SA)滴注到仓鼠肺内。仓鼠在第O天时用PBS、mu3G9 (Abl),或对照IgGl (1E6)开始处理。另外的组在第7天(Ab2)或第14天(Ab3)时用mu3G9处理。所有抗体以5mg/kg的剂量每周施用3次。存活的仓鼠在第28天时被处死，且收集肺并评估羟脯氨酸含量(图65AA)和脂质过氧化(图65B)。误差条表示标准误。在多剂量博来霉素研究自始至终的仓鼠存活(图65C)。当与PBS或IgG处理的对照组比较时，在用mu3G9处理的仓鼠存活中没有看到显著差异。组平均值和标准差在实施例16的附录C中提供。图66描述了关于鉴定为显著受实验处理影响的基因的标准化信号强度曲线图。在第1、8、15和22天时，小鼠用5mg/kg sTGFbRII_Ig( sR)、或用PBS、或用剂量指定为O. 3 —30mg/kg的mu3G9处理,且在第29天时(无恢复期)或在第78天时(7周的恢复期)实施安乐死。由处理小鼠的肺制备RNA并分析转录物。图67描述了在3mg/kg 3G9处理组中显示向上趋势的基因的基因表达曲线图。在第1、8、15和22天时，小鼠用5mg/kg sTGFbRII-Ig (sR)、或用PBS、或用剂量指定为O. 3 —30mg/kg的mu3G9处理,且在第29天时(无恢复期)或在第78天时(7周的恢复期)实施安乐死。由处理小鼠的肺制备RNA并分析转录物。图68的一对条形图描述了显著受mu3G9影响的基因的IPA注释。图69A和69B的网状图示意性描述了在小鼠肺中受mu3G9影响的调节网络。图70的条形图描述了 MMP-12转录物对mu3G9处理的剂量响应。图71是正常和照射小鼠中BAL流体蛋白水平的一系列散布图。图72的一系列散布图描述了由辐射诱导的纤维化上调、和在28周时由mu3G9处理下调的蛋白质。图73 是 SEQ ID NO: I 至 SEQ ID NO: 80 的序列说明。发明详述除非本文另有说明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域普通技术人员通常理解相同的含义。虽然下文描述了优选方法和材料，但类似于或等同于本文所述那些的任何方法和材料都可以在本发明的实践或测试中使用。虽然下文描述了示例性方法和材料，但类似于或等同于本文所述那些的任何方法和材料都可以在本发明的实践中使用。本文提及的所有出版物和其他参考文献整体引入作为参考。在冲突的情况下，以本说明书包括定义为准。材料、方法和实施例仅是举例说明性的且不希望是限制性的。本说明书自始至终，单词“包含”应当理解为指包含所述整数或整数群、但不排除任何其他整数或整数群。 定义约如本文使用的，当涉及任何数值时，术语“约”意指所述值±10%的值(例如，“约50°C”包含45°C— 55°C的温度范围，包括45°C和55°C;类似地，“约100mM”包含90mM —IlOmM的浓度范围，包括90mM和I IOmM)。拮抗剂如本文使用的，术语“拮抗剂”指减少、基本上减少或完全抑制ανβ6整联蛋白在细胞、组织或生物中的生物和/或生理效应的化合物、分子、部分或复合物。可以是对于α νβ6的配体的拮抗剂，可以以各种方式进行此类效应，包括但不限于，与另一种配体竞争结合细胞表面上的ανβ6;&这样的方式与ανβ6相互作用以便减少、基本上减少或抑制整联蛋白结合其他配体的能力；与细胞表面ανβ6结合且诱导ανβ6中的构象变化，从而使得整联蛋白呈现其他配体不能再与之结合的结构(或只能以减少或基本上减少的亲和力和/或功效结合);诱导细胞、组织或生物中的生理学变化(例如，细胞内信号复合物增加；转录抑制剂增加；细胞表面α ν β 6表达减少；等)，从而使得在与细胞上的ανβ6结合后,其他配体的结合，或通过此类配体诱导的生理学信号被减少、基本上减少或完全抑制；以及通过其拮抗剂可以实现其活性的其他机制，所述机制将是普通技术人员熟悉的。如普通技术人员应当理解的，拮抗剂可以具有与它拮抗的另一种ανβ6结合部分(例如，ανβ6结合配体)类似的结构(例如，拮抗剂可以是激动剂的突变型蛋白、变体、片段或衍生物)，或可以具有完全无关的结构。结合如本文使用的，术语“结合”指可以是共价例如通过化学偶联，或非共价例如离子相互作用、疏水性相互作用、氢键等的结合或附着。共价键可以是例如，酯、醚、磷酸酯、硫酯、硫醚、乌拉坦、酰胺、胺、肽、酰亚胺、腙、酰肼、碳-硫键、碳-磷键等。术语“结合”比术语例如“偶联”、“缀合”和“附着”更广泛，且包括“偶联”、“缀合”和“附着”。缀合物/缀合如本文使用的，“缀合物”指部分例如化学药品或放射性同位素与配体的共价附着产物，所述配体与ανβ6例如ανβ6结合抗体或其片段结合。“缀合”指如前句中限定的缀合物的形成。使化学药品或放射性同位素与生物学活性材料例如蛋白质或多肽(包括抗体)缀合、由本领域技术人员通常使用的任何方法都可以在本发明中使用。疾病、病症、病状如本文使用的，术语“疾病”或“病症”指人或动物的任何不利条件，包括肿瘤、癌症、变态反应、成瘾、自身免疫性、感染、最佳精神或躯体功能中毒或损害。如本文使用的，“病状”包括疾病和病症但还指生理学状态。例如，生育力是生理学状态但不是疾病或病症。因此适合于通过降低生育力预防妊娠的本发明组合物将被描述为病状(生育力)治疗，而不是病症或疾病治疗。其他病状将是本领域普通技术人员理解的。有效量如本文使用的，术语“有效量”指实现所需生物学效应所需或足够的给定化合物、缀合物或组合物量。依照本发明方法给定化合物、缀合物或组合物的有效量将是达到这个选择结果的量，且此类量可以由本领域技术人员按常规进行测定，使用本领域已知和/或本文描述的测定法，无需过度实验。例如，用于治疗或预防癌症转移的有效量可以是在体内预防肿瘤细胞经 过基底膜或经过内皮层移动和侵袭所需的量。该术语还与“足够量”同义。关于任何具体应用的有效量可以依此类因素而变，如待治疗的疾病、病症或病状，待施用的具体组合物，施用途径，受试者大小，和/或疾病或病状的严重度。依照本文提供的指导，无需过度实验，本领域普通技术人员即可以经验为主地确定本发明的具体化合物、缀合物或组合物的有效量。一个(种)、a或an :当术语“一个(种)”、“a”或“an”在本公开内容中使用时，除非另有说明，它们意指“至少一个(种)”或“一个(种)或多个(种)”。像这样，术语“a”(或“an”)、“一个(种)或多个(种)”和“至少一个(种)”在本文中可以互换使用。肽、多肽、蛋白质如本文使用的，术语“多肽”意欲包含单数“多肽”以及复数“多肽”，且指通过酰胺键(也称为肽键)线性连接的单体(氨基酸)构成的分子。术语“多肽”指2个或更多氨基酸的任何一条或多条链，且不涉及产物的具体长度。因此，肽、二肽、三肽、寡肽、“蛋白质”、“氨基酸链”、或用于指2个或更多氨基酸的任何一条或多条链的任何其他术语，包括在“多肽”的定义内，和术语“多肽”可以代替任何这些术语使用，或可与任何这些术语互换使用。术语“多肽”还意指多肽的表达后修饰产物，所述表达后修饰包括但不限于，糖基化、乙酰化、磷酸化、酰胺化、通过已知保护/阻断基衍生化、蛋白酶剪切、或通过非天然存在的氨基酸修饰。多肽可以来源于天然生物源或通过重组技术产生，但不必由指定核酸序列翻译。它可以以任何方式产生，包括通过化学合成。依照这个定义，本发明中使用的多肽大小可以为约3个或更多、5个或更多、10个或更多、20个或更多、25个或更多、50个或更多、75个或更多、100个或更多、200个或更多、500个或更多、1，000个或更多、或2000个或更多氨基酸。多肽可以具有限定三维结构，尽管它们不必具有此类结构。具有限定三维结构的多肽称为折叠的，和没有限定三维结构、而是可以采取大量不同构象的多肽称为未折叠的。如本文使用的，术语糖蛋白指与至少一种碳水化合物部分偶联的蛋白质，所述碳水化合物部分经由氨基酸残基的含氧或含氮侧链与蛋白质附着，所述氨基酸残基例如丝氨酸残基或天冬酰胺残基。依照本发明使用的优选多肽包括是配体或与细胞表面上的ανβ6整联蛋白结合的多肽，包括但不限于，识别且与ανβ6上的一个或多个表位结合的抗体(特别是单克隆抗体)。“分离”多肽或其片段、变体或衍生物意指不在其天然环境中的多肽。不要求具体纯化水平。例如，分离多肽可以取自其天然或自然环境。为了本发明的目的，在宿主细胞中表达的重组生产的多肽和蛋白质被视为分离的，与已通过任何合适技术分离、分馏、或部分或基本上纯化的天然或重组多肽一样。作为本发明多肽还包括的是前述多肽的片段、衍生物、类似物或变体，或其任何组合。术语“片段”、“变体”、“衍生物”和“类似物”当指抗ανβ6抗体或抗体多肽时，包括保留相应天然抗体或多肽的至少某些抗原结合特性的任何多肽，即保留与α νβ 6整联蛋白上的一个或多个表位结合能力的那些多肽。本发明的多肽片段包括蛋白水解片段以及缺失片段，除了本文其他地方讨论的具体抗体片段。依照本发明有用的抗ανβ6抗体和抗体多肽变体包括如上所述的片段，以及由于氨基酸置换、删除、或插入具有改变的氨基酸序列的多肽。变体可以天然发生或非天然发生。非天然发生的变体可以使用本领域已知的诱变技术来产生。变体多肽可以包含保守或非保守氨基酸置换、删除或添加。依照本发明有用的抗ανβ6抗体和抗体多肽衍生物是已被改变以便显示天然多肽上未发现的另外特征的多肽。例子包括融合蛋白。变体多肽在本文中还可以称为“多肽类似物”。如本文使用的，抗ανβ6多肽或多肽片段“衍生物”指具有通过功能侧基反应化学衍生的一个或多个残基的主题多肽。作为“衍生物”还包括的是包含20种标准氨基酸的一个或多个天然存在的氨基酸衍生物的那些肽。例如，4-羟脯氨酸可以代替脯氨酸；5_羟赖氨酸可以代替赖氨酸；3_甲基组氨酸可以代替组氨酸；高丝氨酸可以代替丝氨酸；和鸟氨酸可以代替赖氨酸。基本上，基本如本文使用的，如果缀合蛋白质与受体的结合比率和/或量不小于未缀合的相应细胞因子、趋化因子、生长因子或多肽激素的结合比率和/或量的约40%、约 50%、约 60%、约 65%、约 70%、约 75%、约 80%、约 85%、约 90%、约 91%、约 92%、约93%、约94%、约95%、约96%、约97%、约98%、约99%或约100%或更多，那么蛋白质缀 合被说成“基本上”不干扰蛋白质与其一种或多种受体结合的能力。处理如本文使用的，术语“处理”指特别是其中目的是预防或减缓(减少)不希望有的生理学变化或紊乱的预防和/或治疗，所述生理学变化或紊乱例如多发性硬化症的进展。有利或希望的临床结果包括但不限于，无论是可检测的还是不可检测的症状减轻、病变范围减少、疾病状态稳定(即不恶化)、疾病进展延迟或减慢、疾病状态改善或减轻、和好转(无论是部分还是全部)。“处理”还可以指与未接受处理时的预期存活比较延长的存活。需要处理的那些包括已具有病状或病症的那些，以及易于具有病状或病症的那些，或其中病状或病症待预防的那些。“受试者”或“个体”或“动物”或“患者”或“哺乳动物”意指需要诊断、预后或治疗的任何受试者，特别是哺乳动物受试者。哺乳动物受试者包括人和其他灵长类、家畜、农场动物、和动物园、运动、或宠物动物例如狗、猫、豚鼠、兔、大鼠、小鼠、马、牛、奶牛等。概括本发明的特征在于对整联蛋白ανβ6特异的人源化抗体。本文描述了制备本发明抗体的各种方法。本领域已知但本文未具体描述的方法也在本发明的范围内。本发明还至少部分基于下述发现整联蛋白ανβ6在肿瘤细胞表面上差异表达，其中相对于在非转移性或具有较低转移潜能的肿瘤细胞上观察到的表达水平，它在转移性或具有较高转移潜能肿瘤细胞上以增加的量表达。为了分析这种差异表达，本发明使用与整联蛋白ανβ6结合的配体，特别是抗体(和更具体而言由本发明提供的人源化抗体)。在其他实施方案中，本发明还提供了在确定肿瘤细胞的侵袭和/或转移潜能中、以及在更可能进展至侵袭或转移癌的那些癌的鉴定中使用这种差异表达鉴定的方法，所述癌例如某些腺癌和原位癌(包括DCIS和LCIS)。本发明还提供了鉴定其中构成肿瘤的细胞更可能响应治疗的那些肿瘤的方法，所述治疗使用与整联蛋白ανβ6结合的一种或多种配体。本发明还提供了诊断和治疗/预防肿瘤转移，以及用于在肿瘤手术摘除后清除残留转移性肿瘤细胞的方法。
人源化抗体在一个实施方案中，由本发明提供的抗体是单克隆抗体，在优选实施方案中，所述单克隆抗体是来源于其他种类的同类抗ανβ6抗体的人源化形式。人源化抗体是由重组DNA技术生产的抗体，其中并非抗原结合所需的人免疫球蛋白轻或重链的某些或所有氨基酸(例如，可变结构域的恒定区和框架区)，用于代替来自同类非人抗体的轻或重链的相应氨基酸。例如，针对给定抗原的人源化形式的鼠类抗体在其重和轻链上具有(I)人抗体的恒定区；(2)来自人抗体的可变结构域的框架区；和(3)来自鼠类抗体的CDRs。必要时，人框架区中的一个或多个残基可以变成鼠类抗体相应位置上的残基，以便保留人源化抗体对抗原的结合亲和力。这种变化有时称为“回复突变”。与嵌合人抗体比较，人源化抗体在人中一般更不可能引发免疫应答，因为人源化抗体包含明显更少的非人组分。用于制备本发明的人源化抗体的合适方法在下述参考文献中描述例如WinterEP 0239400 Jones 等人，Nature321 :522-525( 1986);Riechmann 等人，Nature332 :323-327(1988)；Verhoeyen 等人，Science239 :1534-1536 (1988)；Queen 等人,Proc. Nat. Acad. Sci.·USA86 :10029 (1989);美国专利 6，180,370 ;以及 Orlandi 等人，Proc. Natl. Acad. Sci.USA86 :3833 (1989)，所述参考文献的公开内容全部整体引入本文作为参考。一般地，鼠类(或其他非人)CDRs到人抗体上的移植如下完成。编码重和轻链可变结构域的cDNAs从杂交瘤中分离。可变结构域包括CDRs的DNA序列通过测序来确定。通过定点诱变将编码CDRs的DNAs转移至人抗体重或轻链可变结构域编码序列的相应区域。随后添加所需同种型(例如Y I对于C1^P K对于CJ的人恒定区基因区段。人源化重和轻链基因在哺乳动物宿主细胞(例如，CHO或NSO细胞)中共表达，以产生可溶性人源化抗体。为了促进抗体的大规模生产，通常希望在包含抗体表达细胞的生物反应器中生产此类人源化抗体，或产生在乳中表达抗体的转基因哺乳动物(例如，山羊、奶牛或绵羊)(参见，例如，美国专利5，827，690)。有时候，CDRs至人框架的直接转移导致所得到的抗体的抗原结合亲和力丧失。这是因为在某些同类抗体中，在框架区内的某些氨基酸与⑶Rs相互作用，且因此影响抗体的总体抗原结合亲和力。在此类情况下，在受体抗体的框架区中引入“回复突变”(同上)以便保留同类抗体的抗原结合活性将是关键的。进行回复突变的一般方法是本领域已知的。例如，Queen等人(同上)，Co等人，Proc. Nat. Acad. Sci. USA88 =2869-2873 (1991)，和 WO 90/07861 (Protein Design LabsInc.)描述了涉及2个关键步骤的方法。首先，通过计算机分析对于与同类鼠类抗体的可变区框架的最佳蛋白质序列同源性选择人可变框架区。随后，通过计算机模拟鼠类可变区的三级结构，以便显示可能与鼠类CDRs相互作用的框架氨基酸残基，且随后将这些鼠类氨基酸残基叠加在同源人框架上。根据这种2步方法，存在关于设计人源化抗体的几个标准。第一个标准是使用来自特定人免疫球蛋白的框架作为人受体，所述人免疫球蛋白通常与非人供体免疫球蛋白同源，或使用来自许多人抗体的共有框架。第二个标准是如果人受体残基是罕见的、和供体残基在框架的特定残基上对于人序列是一般的，那么使用供体而不是受体氨基酸。第三个标准是在紧邻CDRs的位置上使用供体而不是受体框架氨基酸残基。还可以使用如例如Tempest, Biotechnology9 :266-271 (1991)中所述的不同方法。根据这种方法，来源于NEWM和REI重和轻链的可变区框架分别用于CDR移植，而不是自由引入小鼠残基。使用这种方法的优点是NEWM和REI可变区的三维结构由于X射线晶体学是已知的，且因此可以容易地模拟CDRs和可变区框架残基之间的特异性相互作用。如TO 03/100033中所述，本发明人由从杂交瘤6. 3G9和6. 8G6分离的mRNAs制备抗体重链可变区cDNA和轻链可变区cDNAs。这些杂交瘤生产与α νβ 6整联蛋白结合的IgGl类小鼠单克隆抗体。嵌合人抗体表达载体通过将cDNA插入表达载体内来构建，所述表达载体包含人抗体重链恒定区或人抗体轻链恒定区编码序列。随后将此类载体引入动物细胞内以实现抗ανβ6嵌合人抗体的生产。在生产的嵌合抗体中，发现抗ανβ6嵌合人抗体3G9和8G6与ανβ6整联蛋白反应，且显示阻断活性。使用上述方法，产生人源化形式的嵌合抗体3G9和8G6。如本文实施例中所述，对于3G9抗体，这包括克隆鼠类3G9可变重和轻链区域。如本文实施例中所述，编码鼠类3G9轻和重链可变区的cDNA随后用于构建用于表达鼠类-人嵌合体的载体，其中鼠类3G9可变区与人IgGl (对于重链)和人K (对于轻链)恒定区连接。转染到293-ΕΒΝΑ细胞内后轻链和重链3G9表达载体的表达表明，嵌合3G9转染细胞、合成且有效装配重和轻链且分泌抗体 (参见实施例2)。此外，还制备了去糖基突变型嵌合3G9抗体。在3G9轻链第I个⑶R的N联糖基化位点内天冬酰胺(N)至丝氨酸(S)的氨基酸置换显示极大地改善蛋白质表达和纯化，而不改变结合亲和力(图I)。为了生产人源化3G9抗体，通过与人种系序列相配的同源性选择人受体框架结构域。如实施例3中所述，对于轻链，发现人L6受体框架是最同源的，和对于重链，发现人3 -7受体框架是最同源的。使用这些选择的人受体框架，设计轻和重链可变结构域，且产生和表达每一种的许多变体/形式(实施例4)。本发明描述了作为包含SEQ ID NO :I的重链可变结构域和SEQ ID NO :2的轻链可变结构域的人源化3G9抗体。SEQ ID NO IEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYVMSWVRQAPGKGLEWVASISSGGRMYYPDTVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGSIYDGYYVFPYWGQGTLVTVSSSEQ ID NO 2EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCSASSSVSSSYLYWYQQKPGQAPRLLIYSTSNLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCHQWSTYPPTFGGGTKVEIK产生具有不同程度回复突变的3G9重和轻链的不同变体/形式，以确定哪个组合产生具有对于ανβ6的较好结合亲和力和阻断活性的最佳人源化抗体。在产生的5种不同形式的轻链和3种不同形式的重链中，3G9重链形式3 (HV3)与3G9轻链形式5 (LV5)的配对产生最佳的人源化抗体(实施例4)。这种人源化3G9形式5 (H3/L5)抗体通过下述产生表达关于重链形式3 (Η3)包含质粒pKJS189 (SEQ ID NO 6)的重组载体，与关于轻链形式5 (LV5)包含质粒pKJS195 (SEQ ID NO :5)的重组载体组合。
权利要求
1.一种与ανβ6特异性结合的人源化抗体，其包含SEQ ID NO :3的重链可变结构域序列和SEQ ID NO 4的轻链可变结构域序列。
2.一种用于预防或治疗哺乳动物中由ανβ6介导的疾病的组合物，其包含权利要求I的抗体和药学可接受的载体。
3.权利要求2的组合物在制备用于治疗受试者中由ανβ6介导的疾病的药物中的用途，其中所述组合物用于减轻或延缓选自下述的疾病的发作纤维化、牛皮癣、癌症或阿尔波特氏综合征。
4.权利要求3的用途，其中所述受试者是人。
5.权利要求3的用途，其中所述疾病是纤维化。
6.权利要求5的用途，其中所述纤维化是硬皮病、瘢痕化、肝纤维化、肾纤维化、或肺纤维化。
7.权利要求6的用途，其中所述纤维化是肺纤维化。
8.权利要求3的用途，其中所述疾病是牛皮癣。
9.权利要求3的用途，其中所述疾病是癌症。
10.权利要求3的用途，其中所述癌症是上皮、口腔、皮肤、子宫颈、卵巢、咽、喉、食道、肺、乳腺、肾或结肠直肠癌。
全文摘要
本发明提供了识别αvβ6整联蛋白的人源化抗体，所述抗体包含非人起源的可变区和人起源的免疫球蛋白的至少一部分。本发明还提供了包含所述抗体的药物组合物及其应用。本发明另外涉及用于制备此类抗体的方法。
文档编号A61P35/00GK102875681SQ201210396180
公开日2013年1月16日 申请日期2006年6月10日 优先权日2005年7月8日
发明者S·维奥莉特, L·A·库珀曼, K·J·西蒙, P·H·温莱博, H·范维利吉曼, J·萨尔丹哈, A·A·鲁格夫斯科 申请人:拜奥根Idec马萨诸塞公司