专利名称：一种可以用于上皮种植的新型纳米支架及其制备方法
技术领域：
本发明涉及纳米支架，尤其涉及一种可以用于上皮种植的新型纳米支架及其制备方法。
背景技术：
目前，机体在因炎症、外伤、肿瘤或其他病变导致气管大范围受损、切除较长段气管的情况下，需要修复缺损气管。长期以来，气管软骨缺损的修复问题，一直困扰着临床医生。一期端端吻合技术仅适合局部缺损的修复，当缺损长度超过6. Ocm时，由于吻合口张力高而易产生吻合口漏等严重为、并发症。组织工程技术研究的突飞猛进给气管重建带来了新的希望，但自1994年初尝试后再无突破性进展，仍处于实验和探索阶段，仍有问题有待解决。许多学者尝试应用同种异体移植、自体组织移植以及人工材料替代物等方法，效果均不够理想。人工气管完善应用更关键的是如何在人工气管内腔表面引入具有调节气管粘膜 细胞生长代谢作用的材料，促进粘膜上皮爬行再生。在众多的生物材料中，胶原被认为是较理想的选择。然而，胶原属于异体动物组织提取物，存在传染病毒等疾病的潜在可能性，且制作过程复杂，而丝素蛋白属于天然蛋白，来源丰富，价格适宜。国外学者研究了不同的人体细胞株在丝素蛋白膜上的生长情况，结果表明，丝素蛋白和胶原蛋白一样，可以促进细胞的生长。丝素蛋白是一种天然结构性蛋白，主要有三种简单的氨基酸甘氨酸、丙氨酸和丝氨酸组成，它们约占丝素蛋白总量的85%，所以丝素蛋白表面含有相当比例的OH、C00H、NH2等极性基团，这对成纤维细胞的粘附和增殖具有重要作用，而且丝素蛋白表面还含有一定比例的带正电荷的氨基酸残基，这也为成纤维细胞的粘附和增殖创造了良好条件。聚乳酸乙醇酸共聚物(poly (lactic-co-glycolic acid), PLGA)由两种单体-
乳酸和羟基乙酸聚合而成，是一种可降解的功能高分子有机化合物，PLGA的降解产物是乳酸和羟基乙酸，是人代谢途径的副产物，所当它应用在医药和生物材料中时不会有毒副作用。由于其具有良好的生物相容性、无毒、良好的成囊和成膜的性能，PLGA被广泛应用于制药、医用工程材料和现代化工业领域。但是迄今为止，国内外尚无丝素蛋白与PLGA结合应用于气管缺损重建方面的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种含有丝素蛋白与PLGA的可以用于上皮种植的新型纳米支架。本发明所述的一种可以用于上皮种植的新型纳米支架，其中，组成材料包括乳酸乙醇酸共聚物和丝素蛋白，乳酸乙醇酸共聚物与丝素蛋白的质量比为1-3: 7-9。优选地，所述乳酸乙醇酸共聚物与丝素蛋白的质量比为2:8。所述乳酸乙醇酸共聚物中单体乳酸和乙醇酸的摩尔比为40-60%: 40-60%，优选为50%:50%ο所述可以用于上皮种植的新型纳米支架可以经高压静电纺丝技术制成。电纺工艺参数条件为高压静电纺的电压为15-25kv，接受台离喷射孔的板距为10-20cm。进一步地，高压静电纺时的环境空气湿度〈20%，经过甲醇蒸汽交联8-16小时。所述丝素蛋白的制作方法为采用桑蚕蚕茧在MHCO3水溶液中脱胶，将脱胶蚕丝溶于AlX3或钙盐溶液，得丝素蛋白盐溶液，去离子透析除去溶液中的无机盐，透析，压力过滤，将滤液冷冻干燥，即可得到纯化的丝素蛋白，其中，M为碱金属，如Li、Na、K或Cs等，优选为Na、K，更优选为Na ;X为卤素，如F、Cl、Br或I等，优选为Br或I，更优选为Br等。所述钙盐可以为氟化钙、氯化钙、溴化钙、磷酸钙或磷酸氢钙等可溶解的钙盐，更优选为氯化钙等。·
优选地，所述丝素蛋白的制作方法中，桑蚕蚕茧脱胶过程为，干的桑蚕蚕茧25-35克加入含10-20g NaHCO3的3升沸水，煮20-40分钟，可根据需要反复脱胶数次。优选地，所述丝素蛋白的制作方法中，制备丝素蛋白盐溶液，可采用经脱胶处理后的干蚕茧8-12克放入溴化铝溶液(70-90克溴化铝加水配成IOOml溶液)，或者将上述烘干的蚕茧45-55克放入氯化钙溶液(150-170g氯化钙加水208ml和165. 7g乙醇的混合溶液)，加热溶解，加热温度为55-75°C。本发明所述的可以用于上皮种植的新型纳米支架可以为圆形，椭圆形、三角形、四边形、多边形等任意平面几何图形。一种制备上述可以用于上皮种植的新型纳米支架的方法包括以下步骤
I)制备丝素蛋白，所述丝素蛋白的制作方法如下
采用桑蚕蚕茧在MHCOyK溶液中脱胶，将脱胶蚕丝溶于AlX3或钙盐溶液，得丝素蛋白盐溶液，去离子，透析除去溶液中的无机盐，透析，压力过滤，将滤液冷冻干燥，即可得到纯化的丝素蛋白，其中，M为碱金属，如Li、Na、K或Cs等，优选为Na等；X为卤素，如F、Cl、Br或I等，优选为Cl等。2)制备纳米支架，原料包括乳酸乙醇酸共聚物和所述丝素蛋白，乳酸乙醇酸共聚物与丝素蛋白混合后制成纳米级网状纤维平面支架。步骤2)中所述乳酸乙醇酸共聚物和所述丝素蛋白的质量比为1-3: 7-9。优选地，所述丝素蛋白的制作方法中，制备丝素蛋白盐溶液，可采用经脱胶处理后的干蚕茧8-12克放入溴化铝溶液(70-90克溴化铝加水配成IOOml溶液)，或者将上述烘干的蚕茧45-55克放入氯化钙溶液(150-170g氯化钙加水208ml和165. 7g乙醇的混合溶液)，加热溶解，加热温度为55-75°C。优选地，步骤2)中所述乳酸乙醇酸共聚物与丝素蛋白的质量比为2:8。优选地，步骤2)中乳酸乙醇酸共聚物与丝素蛋白混合后经高压静电纺丝的技术制成纳米级网状纤维平面支架。
本发明所述的可以用于上皮种植的新型纳米支架，利于细胞的黏附和增殖，可以用作气管上皮、消化道上皮、消化腺腺泡和导管等的修复，尤其可用作气管缺损修补，对促进气管粘膜修复及临床重建气管缺损、减少重建气管术后并发症提供了有意义的参考。下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细的介绍和描述，以更好的理解本发明，在下文中可以用于上皮种植的新型纳米支架表示为PLGA/SF。
图I为本发明实施例PLGA/SF的超微结构电子显微镜照片；
图2为本发明实施例PLGA/SF纤维直径测量结果；
图3为大鼠气管上皮细胞在PLGA/SF上的黏附攀爬能力实验结果；
图4为大鼠气管上皮细胞在PLGA/SF上的黏附实验电镜超微结构 图5为大鼠气管上皮细胞在PLGA/SF增殖能力实验结果；
图6为大鼠气管上皮细胞在PLGA/SF上的HE染色以及荧光蛋白表达染色照片。
具体实施方式
下面参照附图，通过具体实施例对本发明所述的一种可以用于上皮种植的新型纳米支架进行详细的介绍和描述，以更好的理解本发明，但是应当理解的是，下述实施例并不限制本发明范围。一、制备丝素蛋白 按照下述步骤制备丝素蛋白
1)15gNaHC03加入到3升水煮沸后，加入干的桑蚕蚕茧30克，煮30分钟后，取出蚕茧，重新加上述NaHCO3水溶液，继续煮，重复3次；
2)用去离子水漂洗煮过的蚕茧5-6次后，将蚕茧放入45度烘箱，烘干(尽量将蚕茧剪碎后分散摆放，使之干燥彻底)；
3)将上述烘干的蚕茧10克放入溴化铝溶液(78.165克溴化铝加水配成IOOml溶液)，或者将上述烘干的蚕茧50克放入氯化钙溶液(160g氯化钙加水208ml和165. 7g乙醇的混合溶液)，置于65度水浴锅，定时搅拌混匀，直至完全溶解，然后室温下冷却至常温；
4)用去离子水冲洗透析袋，将蚕茧溶解液灌入透析袋(1/3至1/2袋)，然后封扎两端，置于去离子水中透析3天(每4-5小时换水)；
5)将透析液进行压力过滤，将滤液转移至大口培养皿中(高度一半为宜)置于-80度预冻1-2天，冻存干燥2-3天，即可得到纯化的丝素。二、PLGA与丝素蛋白经高压静电纺丝技术制成纳米支架
PLGA与丝素蛋白按质量比为2:8的比例混合，PLGA与丝素蛋白混合物按质量体积比12%充分溶解在分析纯的六氟异丙醇溶液中，然后经高压静电纺丝机制成纳米支架。电纺工艺参数条件为高压静电纺的电压为20kV，接受台离喷射孔的板距为15cm。电纺时的环境空气湿度〈20%，经过甲醇蒸汽交联12小时。超微结构电子显微镜观察效果，如图I所示，纤维直径均一，表面光滑没有断裂，孔隙率均一，孔隙直径约为30-40 μ m。测量纳米支架纤维直径，结果如图2所示，其中，6. 5%的纤维直径为240-360nm，12%的纤维直径为361_480nm，直径为481_600nm占15%，直径为601-720nm的占17. 8%,直径为721_840nm的占16%，直径为841_840nm的占16. 2%,直径为841-960nm和直径为961_1080nm的分别占9. 8%，直径为1081_1200nm的占6. 4%，平均直径为650nm，标准差210nm，整体纤维的直径变异范围符合正态分布。测试大鼠气管上皮细胞在不同材料上的黏附攀爬能力，实验结果如图3和图4所示图3中，在接种细胞最初30分钟内，PLGA/SF (PLGA)就显示出较玻璃板(Glass)和塑料板(TCP)显著优越的利于细胞黏附能力(*表示统计学P〈0. 01，**表示统计学P〈0. 001)，在接种后24小时这种差异变小，可能是细胞在材料上的增殖影响的原因。图4中显示，随着时间的推移，上皮细胞在PLGA/SF上的数量逐渐增多，并且细胞膜上的突起逐渐形成，攀沿着纤维支架，并且细胞之间开始连接成片。测试大鼠气管上皮细胞在PLGA/SF上的增殖能力，实验结果如图5和图6所示图5中，在接种细胞在24小时以后，在PLGA/SF上的增殖显著快于另外两种材料。在种植后的第3至第7天，这种增殖的速率达到最大值，随后至第14天增殖速率趋于相对平稳，且PLGA/SF材料上的细胞绝对数始终显著大于对照的两种材料(TCP :塑料培养板，Bo :玻璃板，Mo :PLGA/SF)。图6中，荧光染色是活体细胞经由慢病毒转染表达荧光蛋白，只有活体细胞才可以表达荧光，可以清晰地看到随着时间的推移，上皮细胞在PLGA/SF上的数量逐渐增多连成片状，并且细胞活性良好。本发明的可以用于上皮种植的新型纳米支架纤维直径均一，表面光滑没有断裂，孔隙率均一，细胞在其上具有良好的黏附攀爬能力和增殖能力，这可用于气管缺损修补，对 促进气管粘膜修复及临床重建气管缺损、减少重建气管术后并发症提供了有意义的参考。以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。
权利要求
1.一种可以用于上皮种植的新型纳米支架，其特征在于，组成材料包括乳酸乙醇酸共聚物和丝素蛋白，乳酸乙醇酸共聚物与丝素蛋白的质量比为1-3: 7-9。
2.根据权利要求I所述的一种可以用于上皮种植的新型纳米支架，其特征在于，所述乳酸乙醇酸共聚物与丝素蛋白的质量比为2:8。
3.根据权利要求I所述的一种可以用于上皮种植的新型纳米支架，其特征在于，所述乳酸乙醇酸共聚物中单体乳酸和乙醇酸的摩尔比为40-60%:40-60%。
4.根据权利要求I所述的一种可以用于上皮种植的新型纳米支架，其特征在于，所述乳酸乙醇酸共聚物中单体乳酸和乙醇酸的摩尔比为50%:50%。
5.根据权利要求I所述的一种可以用于上皮种植的新型纳米支架，其特征在于，乳酸乙醇酸共聚物与丝素蛋白经高压静电纺丝的技术制成纳米级网状纤维平面支架。
6.根据权利要求I所述的一种可以用于上皮种植的新型纳米支架，其特征在于，所述丝素蛋白的制作方法如下 采用桑蚕蚕茧在MHCOyK溶液中脱胶，将脱胶蚕丝溶于AlX3或钙盐溶液，得丝素蛋白盐溶液，去离子透析除去溶液中的无机盐，透析，压力过滤，将滤液冷冻干燥，即可得到纯化的丝素蛋白，其中，M为碱金属，X为卤素。
7.一种制备如权利要求I所述的可以用于上皮种植的新型纳米支架的方法，其特征在于，包括以下步骤 1)制备丝素蛋白，所述丝素蛋白的制作方法如下 采用桑蚕蚕茧在MHCOyK溶液中脱胶，将脱胶蚕丝溶于AlX3或钙盐溶液，得丝素蛋白盐溶液，去离子透析除去溶液中的无机盐，透析，压力过滤，将滤液冷冻干燥，即可得到纯化的丝素蛋白，其中，M为Li、Na、K或Cs，X为F、Cl、Br或I ； 2)制备纳米支架，原料包括乳酸乙醇酸共聚物和所述丝素蛋白，乳酸乙醇酸共聚物与丝素蛋白混合后制成纳米级网状纤维平面支架。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，步骤2)中所述乳酸乙醇酸共聚物和所述丝素蛋白的质量比为1-3: 7-9。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，步骤2)中所述乳酸乙醇酸共聚物和所述丝素蛋白的质量比为2: 8。
10.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，步骤2)中乳酸乙醇酸共聚物与丝素蛋白混合后经高压静电纺丝的技术制成纳米级网状纤维平面支架。
全文摘要
本发明所述的一种可以用于大鼠气管上皮种植的新型电纺纳米支架及其制备方法，其中，组成材料包括乳酸乙醇酸共聚物和丝素蛋白，乳酸乙醇酸共聚物与丝素蛋白的质量比为1-3:7-9，混合后的乳酸乙醇酸共聚物与丝素蛋白制成纳米级网状纤维平面支架。本发明所述的可以用于上皮种植的新型纳米支架，利于细胞的黏附和增殖，可以用作气管上皮、消化道上皮、消化腺腺泡和导管等的修复，尤其可用作气管缺损修补，对促进气管粘膜修复及临床重建气管缺损、减少重建气管术后并发症提供了有意义的参考。
文档编号A61L27/26GK102895701SQ20121041873
公开日2013年1月30日 申请日期2012年10月29日 优先权日2012年10月29日
发明者郑卉, 陈昶, 高文 申请人:上海市肺科医院