专利名称：人工软骨及其制造方法
技术领域：
本发明涉及人工软骨及其制造方法。本发明涉及以生物体软骨的成分作为原料的富有弹性的人工软骨、及其制造方法。
背景技术：
软骨组织由软骨细胞和软骨基质(matrix)组成。软骨细胞是高度分化的细胞，其仅占软骨组织中的约10%，虽然基本上没有通过细胞分裂的增殖，但是软骨细胞在软骨组织内产生软骨基质成分，有助于维持占软骨组织约90%的软骨基质。虽然已经有尝试使用软骨细胞人工再生软骨组织，将其利用于针对软骨的破损 变性的治疗中，但是为了形成软骨样组织，使软骨细胞自身产生软骨基质成分的工序是不可缺的。然而，现有技术中，使软骨细胞高效率的生成修补缺损部的充足量的软骨基质是困难的，现在仍然存在许多需要解决的问题。 还进行了化学制备类似软骨组织的组织再生用材料的研究。例如，日本专利公开号2002-80501公开了通过糖胺聚糖(glycosaminoglycan)和聚阳离子的缩合反应得到的组织再生基质用糖胺聚糖-聚阳离子复合物，其记载了作为软骨、肝脏、血管、神经等各种组织的再生材料是有用的。然而，日本专利公开号2002-80501中记载的复合物与生物体软骨不同，由于其是以糖胺聚糖和聚阳离子作为主要的两种成分形成的，恐怕不能得到充分的生物体亲和性。另外，由于在制造过程中使用了交联剂和缩合剂，需要洗净除去这些交联齐U、缩合剂以及它们的副产物，需要许多步骤的同时，在将得到的复合物移植入体内的情况中，有产生化学物质的残留问题的危险。进一步地，由于使用交联剂和缩合剂制成的复合物的构造不是类似于纳米级的、生物体组织的构造，因此恐怕不能满足作为软骨的功能所必需的低摩擦性、耐压力性和生物体亲和性。国际公开号2007/032404公开了包含(a)混合糖胺聚糖和蛋白聚糖，制备糖胺聚糖蛋白聚糖聚集体的工序，和(b)在上述糖胺聚糖蛋白聚糖聚集体中混合胶原蛋白的工序的，自我组织化糖胺聚糖/蛋白聚糖/胶原蛋白复合物的制造方法，其记载了该糖胺聚糖/蛋白聚糖/胶原蛋白复合物具有作为软骨再生医疗的生物材料的非常适合的性质，同时由于其是通过自我组织化制成的，不需要除去杂质等的工序。然而，通过国际公开号2007/032404中记载的方法得到的复合物实际上仅由胶原蛋白成分组成，没有发生充分的复合化。
发明内容
[发明所解决的课题]因此，本发明的目的是提供由糖胺聚糖/蛋白聚糖/胶原蛋白复合物形成的，机械强度、生物体亲和性和自我组织化优异的人工软骨。[解决课题的方法]鉴于上述目的专心研究的结果，本发明人发现通过冷冻干燥含有合意的比例的胶原蛋白、蛋白聚糖和透明质酸的分散物得到的复合物适合于作为人工软骨，而想到了本发明。即，本发明的人工软骨的特征在于含有15 95质量％的胶原蛋白、4.9^70质量％的蛋白聚糖和0.r2o质量％的透明质酸。上述人工软骨优选被交联处理。上述人工软骨优选被灭菌处理。制造由胶原蛋白、蛋白聚糖和透明质酸形成的人工软骨的本发明的第一种方法的特征在于具有以下工序:得到由透明质酸和胶原蛋白形成的第一组合物的工序，得到由蛋白聚糖和胶原蛋白形成的第二组合物的工序，将上述第一和第二组合物混合的工序，和将得到的混合物冷冻干燥(第一冷冻干燥)的工序。制造由胶原蛋白、蛋白聚糖和透明质酸形成的人工软骨的本发明的第二种方法的特征在于具有以下工序:将胶原蛋白、蛋白聚糖和透明质酸混合的工序，和将得到的混合物冷冻干燥(第一冷冻干燥)的工序。上述冷冻干燥后，优选交联处理。制造人工软骨的本发明的第一种和第二种方法优选进一步具有以下工序:将得到的冷冻干燥物粉碎的工序，将得到的冷冻干燥物粉末分散于水中的工序，和将得到的分散物再次冷冻干燥(第二冷冻干燥)的工序。优选在上述第二冷冻干燥后进行交联处理。上述交联处理优选热脱水交联。`优选对交联后的人工软骨进行Y射线照射处理。[发明的效果]由于本发明的人工软骨以合意的比例含有胶原蛋白、蛋白聚糖和透明质酸，因此其机械强度、生物体亲和性和自我组织化优异。本发明的方法能够简便地制造机械强度、生物体亲和性和自我组织化优异的人工软骨。
具体实施例方式[I]人工软骨本发明的人工软骨含有15 95质量％的胶原蛋白、4.9^70质量％的蛋白聚糖和
0.广20质量％的透明质酸。通过胶原蛋白形成作为软骨组织骨架的网状结构，并且物理地和/或化学地形成与透明质酸和蛋白聚糖的交联，能够保持充足的水分，得到具有软骨特有的弹性的人工软骨。人工软骨中的胶原蛋白、蛋白聚糖和透明质酸的量较优选分别为45飞5质量％、20 40质量％和1.5飞质量％。在该范围的情况下，人工软骨特别适合于作为关节软骨。胶原蛋白含量不足15质量％的情况时，由于插入生物体时的膨胀率大，使人工软骨很难适合软骨缺损部，且由于膨胀人工软骨的孔隙率降低。胶原蛋白含量超过95质量％的情况时，人工软骨的着色变大。蛋白聚糖含量不足4.9质量％的情况时，人工软骨的弹性下降，作为软骨的性能下降。蛋白聚糖含量超过70质量％的情况时，通过人工软骨的膨胀，尺寸的变化大，孔隙率下降。透明质酸含量不足0.1质量％的情况时，人工软骨的弹性下降，作为软骨的性能下降，同时人工软骨表面的润滑性(低摩擦性)下降。透明质酸含量超过20质量％的情况时，大大超过了生物体软骨中所含有的比例，由于成为与生物体软骨不同成分的材料，根据适用部位，确保胶原蛋白和蛋白聚糖的合意的含有比例变得困难。作为胶原蛋白，没有特别地限定，可以使用从动物等提取的物质。并且作为来源的动物的种类、组织部位、年龄等也没有特别地限定。一般地，可以使用从哺乳动物(例如牛、猪、马、兔子、老鼠等)或鸟类(例如鸡等)的皮肤、骨、软骨、肌腱、脏器等得到的胶原蛋白。还可以使用从鱼类(例如鳕鱼、比目鱼、蝶鱼、鲑鱼、鳟鱼、金枪鱼、鲭鱼、红鲷鱼、沙丁鱼、S鱼等)的皮、骨、软骨、鳍、鳞、脏器等得到的胶原蛋白。另外，胶原蛋白的提取方法没有特别地限定，可以使用一般的提取方法。也可以使用合成胶原蛋白或通过基因重组技术得到的胶原蛋白代替从动物组织中提取出的胶原蛋白。糖胺聚糖是由氨基糖与糖醛酸或半乳糖结合得到的二糖的重复结构形成的酸性多糖。本发明中使用的透明质酸是糖胺聚糖的一种，除了透明质酸，还可以使用硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸乙酰肝素、硫酸角质素、肝素等，但是优选使用透明质酸。蛋白聚糖是在一个作为核心的蛋白质上结合一条或多条糖胺聚糖链的物质。作为蛋白聚糖没有特别地限定，可以举例聚集蛋白聚糖、多功能蛋白聚糖、神经蛋白聚糖、短小蛋白聚糖、核心蛋白聚糖、双链蛋白聚糖、丝甘蛋白聚糖、基底膜聚糖、多配体聚糖、磷脂酰肌醇聚糖、基膜聚糖、角膜蛋白聚糖等，但是优选聚集蛋白聚糖。蛋白聚糖的来源没有特别地限定，根据复合物的使用目的，可以从哺乳动物(人类、牛、猪等)、鸟类(鸡等)、鱼类(鲨鱼、鲑鱼等)、甲壳类(螃蟹、虾等)等的各种动物来源中适当地选择。特别地，当将本发明的人工软骨用作人类软骨缺损或变性的治疗用时，则优选从人免疫原性低的来源中选择。作为人工软骨中的胶原蛋白的 含量测定方法，可以举例UV吸收测定法、HPLC法等。作为透明质酸的含量测定，可以举例咔唑硫酸法、利用透明质酸结合性蛋白质的抑制法、HPLC法等。作为蛋白聚糖的含量测定，可以举例比色定量法(使用色素DMMB)、HPLC法
坐寸o人工软骨优选实施交联处理。交联处理可以通过物理的或化学的方法进行。并且，人工软骨优选通过Y射线处理等方法灭菌处理。人工软骨的孔隙率优选50、9%，更优选60、9%。人工软骨的平均气孔径优选I 1000 Ii m,更优选 50 800 u m。[2]制造方法(I)第一种方法制造本发明的人工软骨的第一种方法具有以下工序:得到由透明质酸和胶原蛋白形成的第一组合物的工序，得到由蛋白聚糖和胶原蛋白形成的第二组合物的工序，混合上述第一和第二组合物，得到混合物的工序，和将得到的混合物冷冻干燥的工序(第一冷冻干燥工序)。第一种方法可以进一步具有以下工序:将得到的冷冻干燥物粉碎的工序，将粉碎的冷冻干燥物分散于水中的工序，和将得到的分散物再次冷冻干燥的工序(第二冷冻干燥工序)。下面，详细说明制造人工软骨的第一种方法。(a)第一和第二组合物的制备在制备上述第一组合物的工序中，透明质酸和胶原蛋白的混合比(质量比)优选10000:1 1: 10000，更优选5000:1 1:5000，最优选15:1 1:15。优选使用将胶原蛋白以0.r20质量％的浓度预先溶解于稀盐酸(约5 50mM的浓度)中的物质。并且，优选使用将透明质酸以0.r20质量％的浓度预先溶解于无菌水(注射用水等)中的物质。优选于3 25°C进行透明质酸水溶液和胶原蛋白水溶液的混合。在制备上述第二组合物的工序中，蛋白聚糖和胶原蛋白的混合比(质量比)优选10000:1 1:10000、更优选5000:1 1:5000、最优选10:1 1:10。优选使用将胶原蛋白以0.r20质量％的浓度预先溶解于稀盐酸(5飞OmM左右的浓度)中的物质。并且，优选使用将蛋白聚糖以0.r20质量％的浓度预先溶解于无菌水(注射用水等)中的物质。优选于3 25°C进行蛋白聚糖水溶液和胶原蛋白水溶液的混合。由于透明质酸水溶液和胶原蛋白水溶液的混合(第一组合物的制备)以及蛋白聚糖水溶液和胶原蛋白水溶液的混合(第二组合物的制备)不需要特别高的剪切(# 〃断)，因此可以使用通常使用的搅拌器、混合器等器具。为了能够得到透明质酸和胶原蛋白的均一混合物，以及蛋白聚糖和胶原蛋白的均一混合物，优选于3 25°C，进行混合约11秒分钟。(b)第一和第二组合物的混合第一组合物和第二组合物的混合比按照混合后含有15 95质量％的胶原蛋白、
4.9^70质量％的蛋白聚糖和0.r20质量％的透明质酸的组成设定。第一和第二组合物的混合优选使用均质机、溶解器等的器具，通过具有剪切力的方法进行。例如，使用均质机的情况下，优选以1，000 12，OOOrpm的转速，进行30秒 3分钟的搅拌，重复2飞次。混合时的样品优选保持在约3 25°C。通过将分别制备的第一和第二组合物混合，能够促进软骨合成的进行。 (C)第一冷冻干燥将第一组合物和第二组合物混合得到的混合物置于热传导性好的容器(金属托盘等)中，于一 80°C 一 60°C冷冻过夜一晚。对于冷冻后的混合物，以隔板温度约一 50°C 一50C (优选一 40°C 一 5°C)进行约10小时 10天抽真空的第一干燥工序直至混合物的水分(冰)基本除尽，将隔板温度升至约20 40°C (优选25 40°C )进一步进行3 24小时抽真空的第二干燥工序。这样，通过使温度经过两个阶段的变化的冷冻干燥，甚至除去了结合水，得到更干燥的具有优异的保存性的冷冻干燥物。得到的冷冻干燥物可以就此原样作为人工软骨使用，但是也可以进一步进行如下所述的(d)粉碎工序 (g)第二冷冻干燥。经过这样的粉碎工序，能够得到高密度的人工软骨。优选对通过第一和第二冷冻干燥得到的冷冻干燥物实施下述交联和/或灭菌处理。(d)粉碎用磨粉机等的固体粉碎器粉碎得到的冷冻干燥物。粉碎方法没有特别地限定，但优选使冷冻干燥物的温度不要过高的方法。Ce)分散按照3 20质量％的浓度将粉碎后的冷冻干燥物与水或生理盐水混合，使用均质机等的器具，以3 25°C和1，000 15，OOOrpm的条件，分散30秒 3分钟X I 5次。(f)凝胶化将得到的分散物置于培养皿等的容器中并盖上盖子，于30 40°C静置I 5小时使之凝胶化。
(g)第二冷冻干燥优选将凝胶化的分散物再次冷冻干燥。于2 10°C冷藏凝胶化的分散物f 20小时，然后于约一 20°C 一 60°C冷冻过夜一晚。冷冻优选将装有凝胶化的分散物的容器置于放在不锈钢托盘内的网状隔板上进行。与上述第一冷冻干燥的情况相同，干燥冷冻后的分散物。(h)交联和灭菌处理为了在提高机械强度的同时能够经过长时间地保持插入体内的人工软骨，优选交联处理冷冻干燥物。交联处理可以通过使用Y射线、紫外线、电子束、热脱水等的物理交联方法，或通过使用交联剂、缩合剂的化学交联方法进行。在化学交联方法中，例如可以举例，将冷冻干燥物浸溃于交联剂溶·液中的方法，使含有交联剂的蒸气作用于冷冻干燥物的方法，以及向制造中的人工软骨水性分散物添加交联剂的方法。在这些方法中，本发明优选热脱水交联法。热脱水交联法可以通过将冷冻干燥后的分散物在100 160°C和0 IOOhPa的真空烘箱中保持10 30小时进行。优选将这样得到的人工软骨通过紫外线、Y射线、电子束、干燥加热等灭菌处理。特别地，优选通过照射25kGy以下的Y射线灭菌。(2)第二种方法制造本发明人工软骨的第二种方法具有以下工序:混合胶原蛋白、蛋白聚糖和透明质酸的工序，和将得到的混合物冷冻干燥(第一冷冻干燥)的工序。第二种方法可进一步具有以下工序:将得到的冷冻干燥物粉碎的工序，将粉碎后的冷冻干燥物分散于水中的工序，将得到的分散物再次冷冻干燥的工序(第二冷冻干燥)。另外，由于第一冷冻干燥工序及其后续工序与上述第一种方法相同，因此省略其说明，以下详细说明第二种方法中混合胶原蛋白、蛋白聚糖和透明质酸的工序。按照含有15 95质量％的胶原蛋白、4.9^70质量％的蛋白聚糖和0.f 20质量％的透明质酸的组成，混合胶原蛋白、蛋白聚糖和透明质酸。优选以0.广20质量％的浓度将胶原蛋白预先溶解于水或稀盐酸(约5 50mM的浓度)中。优选以0.r20质量％的浓度将蛋白聚糖预先溶解于无菌水(注射用水等)中。优选以0.r20质量％的浓度将透明质酸预先溶解于无菌水(注射用水等)中。优选使用均质机、溶解器等的器具，施加剪切力混合胶原蛋白、蛋白聚糖和透明质酸的各溶液。例如，在使用均质机的情况中，优选以1，000 12，OOOrpm的转速进行30秒^3分钟的搅拌，重复2飞次。优选在3 25°C保温进行胶原蛋白水溶液、蛋白聚糖水溶液和透明质酸水溶液的制备和混合。通过实施例进一步详细说明本发明，但这并不进一步限制本发明。比较例I(I)样品101的制备用水稀释市售I质量％浓度的胶原蛋白水溶液，制备0.5质量％浓度的胶原蛋白水溶液。用水溶解蛋白聚糖粉末，制备0.5质量％浓度的蛋白聚糖水溶液。用水溶解透明质酸粉末，制备0.6质量％浓度的透明质酸水溶液。以1:2 (质量比)混合得到的0.6质量％浓度的透明质酸水溶液和0.5质量％浓度的蛋白聚糖水溶液，然后将0.5质量％浓度的胶原蛋白水溶液2mL混合入上述混合液3mL中。
向得到的胶原蛋白/蛋白聚糖/透明质酸混合液(pH4.40)中添加INNaOH水溶液8 UL,将上述混合液的pH调节至6.03。pH6.03被视为实质上中性。将pH调节后的胶原蛋白/蛋白聚糖/透明质酸混合液置于37°C的具有振荡功能的培养箱(〃 ^ -7"') ￥ ^ -S-V3 X 一夕一 HB-100、TAITEC社)中，以60rpm振荡4小时，然后进行第I次超速离心分离(23000rpm、30分钟),使固体成分沉淀。不分离得到的沉淀物和上清液而于37°C原样静置过夜一晚。沉淀物保持了刚刚完成超速离心分离后的形状。将静置过夜一晚的沉淀物和上清液进行第2次超速离心分离(23000rpm、30分钟)，将上清液置换为生理盐水，然后，再次进行第3次超速离心分离(23000rpm、30分钟)得到人工软骨(沉淀物)。(2)样品102的制备向得到的胶原蛋白/蛋白聚糖/透明质酸的混合液(pH4.40)中添加IN NaOH水溶液IOii L，将上述混合液的pH调节至9.04，除此之外，与样品101同样地得到人工软骨。由于基本上所有未反应的成分包含在第2次超速离心分离后的上清液中，因此对上清液中的蛋白聚糖和透明质酸进行定量，计算出沉淀物(人工软骨)中含有的胶原蛋白、蛋白聚糖和透明质酸的组成比。结果示于表I。如表I所表明的，样品101 (实质上中性)的沉淀物基本上不含有生物体软骨中应该含有的蛋白聚糖和透明质酸，其基本上仅由胶原蛋白构成，且样品102 (碱性)的沉淀物基本上不含有透明质酸，蛋白聚糖的含量也少。表I
权利要求
1.一种人工软骨，其含有15 95质量％的胶原蛋白、4.9 70质量％的蛋白聚糖、和2o质量％的透明质酸。
2.根据权利要求1所述的人工软骨，其特征在于所述人工软骨经过交联处理。
3.根据权利要求1或2所述的人工软骨，其特征在于所述人工软骨经过灭菌处理。
4.一种制造由胶原蛋白、蛋白聚糖和透明质酸形成的人工软骨的方法，其特征在于所述人工软骨的制造方法具有以下工序:得到由透明质酸和胶原蛋白形成的第一组合物的工序，得到由蛋白聚糖和胶原蛋白形成的第二组合物的工序，混合上述第一和第二组合物得到混合物的工序，以及将 得到的混合物冷冻干燥的工序。
5.一种制造由胶原蛋白、蛋白聚糖和透明质酸形成的人工软骨的方法，其特征在于所述人工软骨的制造方法具有以下工序:将胶原蛋白、蛋白聚糖和透明质酸混合的工序，以及将得到的混合物冷冻干燥的工序。
6.根据权利要求4或5所述的人工软骨的制造方法，其特征在于在上述冷冻干燥后进行交联处理。
7.根据权利要求6所述的人工软骨的制造方法，其特征在于上述交联处理是热脱水交联。
8.根据权利要求6所述的人工软骨的制造方法，其特征在于对交联后的人工软骨进行Y射线照射处理。
9.根据权利要求4或5所述的人工软骨的制造方法，其特征在于所述方法进一步具有以下工序:将得到的冷冻干燥物粉碎的工序，将得到的冷冻干燥粉末分散于水中的工序，以及将得到的分散物再次冷冻干燥的工序。
10.根据权利要求9所述的人工软骨的制造方法，其特征在于在上述再次冷冻干燥后进行交联处理。
11.根据权利要求10所述的人工软骨的制造方法，其特征在于上述交联处理是热脱水交联。
12.根据权利要求10所述的人工软骨的制造方法，其特征在于对交联后的人工软骨进行Y射线照射处理。
全文摘要
本发明涉及一种人工软骨及其制造方法，该人工软骨含有15~95质量%的胶原蛋白、4.9~70质量%的蛋白聚糖、和0.1~20质量%的透明质酸。
文档编号A61L27/22GK103083722SQ20121044135
公开日2013年5月8日 申请日期2012年11月7日 优先权日2011年11月8日
发明者河东万智子 申请人:Hoya株式会社