专利名称：Tubacin的新用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及Tubacin的新用途。
背景技术：
阿尔茨海默病(Alzheimer，s Disease, AD),又称老年性痴呆,是一种中枢神经系统原发性退行性变性疾病，主要临床相为痴呆综合症。该病发生徐缓，病程呈进行性，其发病率随年龄的增长而升高。据西方国家统计，AD在65岁以上老年人中的患病率为5%_8%，大约每增加10岁患病率就增加一倍(75岁以上为10%，85岁以上为25%)。我国关于AD的流行病学研究结果显示，AD在我国老年人中的发病率和西方国家及日本、韩国的统计数据很接近，大概为5. 9%左右。根据2008年的人口统计数据，我国65岁以上的老年人比例已达到了
8.3%,而且还在继续增加(数据来源于国家统计局《中国人口现状》http://www. gov. cn/test/2005-07/26/content_17363. htm)。根据这个比例推算，目前我国AD患者可能已经超过了 500万人。由于我国人口逐渐进入老龄化，老年病防治就成为了迫切需要解决的问题。在西方国家，AD已是继心血管疾病、肿瘤、中风之后第四位死亡原因，也是花费最多的疾病。由于AD患者后期生活不能自理，常有严重认知功能障碍和精神神经症状，给家庭及社会带来严重负担，由此带来的社会问题、经济问题、家庭问题以及公共卫生问题越来越严重。因此，AD已经成为了各国政府、公众以及科研人员关注的焦点。AD患者的主要病理性特征⑴大脑皮层出现弥漫性萎缩，以颞叶、顶叶和前额叶最为明显，大量神经元空泡化丢失，突触减少(健康人的大脑见图1A1，AD患者的大脑见图1A2) ； (2)海马和大脑皮层等细胞外出现淀粉样蛋白沉淀(Amyloid plaque, A β ),又称老年斑(Senile plaques, SPs)(见图IBl和图1B2) ； (3)细胞内出现由成对的螺旋状纤维构成的神经纤维缠结(neurofibrillary tangles, NFTs)(见图ICl和图1C2)。NFTs主要由过度磷酸化Tau形成的成对的螺旋状纤维(paired helicalfilaments, PHFs)构成。Tau蛋白是一种微管结合蛋白，主要在中枢和周围神经系统表达，在神经元的轴突中富集。早在上世纪八十年代，就有研究发现过度磷酸化的、不可溶的纤维化Tau是神经纤维缠结NFTs的主要成分，是AD的典型病理特征之一。Tau蛋白从结构上可以被分成四个结构域N端突出结构域(projection domain),脯氨酸富集区(proline-richregion),微管结合区(MT binding domain, MBD)和C端区域。在成人大脑中，N端和MBD结构域通过mRNA可变剪接可以产生6种Tau异构体。Tau异构体就是根据N端外显子(称为N)和微管结合重复(称为R)的数目来命名的。Tau的主要功能是通过MBD结构域结合并稳定微管，对于轴突的正常运输和神经元的正常生长发育都起着重要作用。Tau的微管结合区域还可以结合并抑制组蛋白去乙酰化酶-6 (HDAC6)的酶活。此外，Tau蛋白可以通过N端突出结构域和C端来结合微管外侧，并调控微管之间的空隙。Tau的N端还能与细胞膜相互作用。Tau的脯氨酸富集结构域可以结合含有SH3结构域的蛋白，如酪氨酸激酶Fyn，从而介导Αβ诱导的神经毒性。Tau蛋白还有很多其他的结合对象，包括信号分子，细胞骨架组分和脂类，提示Tau是一个多功能蛋白。在生理和病理情况下，Tau蛋白都会发生一系列复杂的翻译后修饰。例如，在胎儿发育和冬眠过程中Tau都会被正常的磷酸化。而在AD中，Tau的很多丝氨酸/苏氨酸位点都会被过度磷酸化。黑腹果蚬(Drosophila melanogaster)是生物学研究领域常用的一种模式生物，具有如下优势包括(I)生命周期短，生长迅速，繁殖能力强，为高通量筛选提供了充足的材料；(2)简单、明确与高度保守的遗传背景；已知的与人类智力障碍相关的280个基因中超过三分之二在果蝇中发现了同源基因，此外还包括一系列与发育和癌症有关的基因；(3)丰富强大的遗传操作工具，包括多种诱变技术和公共资源库，如美国的Bloomington StockCenter,日本的Drosophila Genetic Resource Center,奥地利的 Vienna Drosophila RNAiCenter等；(4)果蝇简单的神经系统适于研究基础科学问题和复杂行为；果蝇幼虫的神经肌肉接头(Neuromuscular junction, NMJ),感觉神经元都比较简单,适于单细胞水平研究突触结构和功能；果蝇大脑神经元在病理状态下，也会发生退行性病变，可以模拟相关神经退行性疾病表型；另外，果蝇大脑也可以控制复杂行为，包括求偶、恐惧、好斗、抉择等。 在果蝇的研究中经常会用到实现基因组织特异性表达的GAL4/UAS系统。该表达体系来源于酵母，其中Gal4蛋白是一个转录激活因子，可以特异性识别UAS(upstreamactivating sequence)序列并激活其下游基因的表达。如果Gal4蛋白的表达受到一个组织特异性或者条件特异性的启动子(promoter)的调控，那么UAS下游基因的表达也将呈现出同该启动子一样的组织特异性或者条件特异性。为了方便实验操作与品系保存，在果蝇中通常利用转座子转基因技术使GAL4/UAS系统以一种二元化体系存在，即构建两个转基因果蝇品系，其中一个表达Gal4基因，另外一个在基因组中含有插入的UAS序列，并且该UAS序列后往往跟随一个特异性的目的基因，如人类疾病相关蛋白。当需要表达这个目的基因时，只需要将这两种品系的果蝇进行一次杂交，就可以在子代果蝇中大量表达由Gal4调控的UAS下游基因。配合目前可以获得的数千种组织和条件特异性Gal4品系以及其它多种分子工具，使得在果蝇中研究基因的组织特异性功能具有其它模式生物所无法比拟的优势。这一点在利用果蝇模型进行人类神经退行性疾病研究领域得到了充分的展现。多种人类退行性疾病和一个或多个毒性蛋白有着紧密的联系，如AD中的Αβ和Tau，帕金森综合症(Parkinson，s disease)中的 a-synuclein,亨廷顿舞蹈症(Huntington，sdisease)中的Huntingtin,克-雅氏病(Creutzfeldt-Jakob disease, CJD,又称疯牛病)中的阮蛋白(prion)等等。利用GAL4/UAS系统在果蝇脑组织特异性表达这些蛋白质能够在一定程度上重现与病人类似的表型，从而为研究疾病的发病机制和寻找治疗方法提供了有效的研究对象。基于Tau和A β蛋白的相关转基因果蝇模型都能表现出年龄依赖的神经退行性病变和寿命缩短的现象，很好的模拟了 AD的病理特征。其中Tauopathy相关模型最早是由Dr. Mel Feany实验室构建的，后来被很多实验室使用。神经特异性表达野生型Tau和突变体Tau (含有人类疾病中的自发点突变)都能造成神经元的凋亡以及寿命缩短。在果蝇大脑神经元胞体也有过度磷酸化Tau的聚集，但是没有检测到不溶性的神经纤维缠结(PHFs)。据推测，可能是因为果蝇中没有神经纤维丝(neurofilament)，所以不能形成缠结，同时也说明了 PHFs并不是造成神经退行性病变的必要因素。
另外，利用果蝇AD模型可以大规模的进行药物筛选。已知的可以抑制AD果蝇模型中的病理特征的药物包括GSK-3 0抑制剂lithium，微管稳定药物Epothilone D，载脂蛋白 E 类似物(Blard et al. , 2007;Brunden et al. , 2010;Mudher et al. , 2004; Shulmanand Feany, 2003)等。以上的研究充分说明，利用果蝇来研究人类疾病，特别是AD具有很大的潜力。
发明内容
本发明的目的是提供Tubacin的新用途。本发明提供了 Tubacin在制备产品中应用；所述产品的用途为如下(I)至(5)中的至少一种(I)抑制微管破坏；(2)增加微管乙酰化水平；(3)抑制神经肌肉接头(NMJ)形态异常；(4)抑制神经肌肉接头(NMJ)微管骨架异常；(5)治疗阿尔茨海默病。所述(I)中的所述“抑制微管破坏”具体可为“抑制Tau蛋白过表达诱导的微管破 坏”。所述(I)中的所述“抑制微管破坏”具体可体现为促使微管密度增加和/或促进微管断头数目降低。所述(3)中的所述“抑制神经肌肉接头形态异常”具体可为“抑制Tau蛋白过表达导致的神经肌肉接头形态异常”。所述(3)中的所述“抑制神经肌肉接头形态异常”具体可体现为促使卫星突触扣结数目减少和/或神经肌肉接头总长度增加。所述(4)中的所述“抑制神经肌肉接头微管骨架异常”具体可为“抑制Tau蛋白过表达导致的神经肌肉接头微管骨架异常”。所述(4)中的所述“抑制神经肌肉接头微管骨架异常”具体可体现为微管结合蛋白Futsch可以到达神经肌肉接头的末端和/或增加神经肌肉接头中的微管乙酰化水平。本发明还保护一种产品，它的活性成分为Tubacin ;所述产品的用途为如下(I)至
(5)中的至少一种(I)抑制微管破坏；(2)增加微管乙酰化水平；(3)抑制神经肌肉接头(NMJ)形态异常；(4)抑制神经肌肉接头(NMJ)微管骨架异常；(5)治疗阿尔茨海默病。所述(I)中的所述“抑制微管破坏”具体可为“抑制Tau蛋白过表达诱导的微管破坏”。所述(I)中的所述“抑制微管破坏”具体可体现为促使微管密度增加和/或促进微管断头数目降低。所述(3)中的所述“抑制神经肌肉接头形态异常”具体可为“抑制Tau蛋白过表达导致的神经肌肉接头形态异常”。所述(3)中的所述“抑制神经肌肉接头形态异常”具体可体现为促使卫星突触扣结数目减少和/或神经肌肉接头总长度增加。所述(4)中的所述“抑制神经肌肉接头微管骨架异常”具体可为“抑制Tau蛋白过表达导致的神经肌肉接头微管骨架异常”。所述(4)中的所述“抑制神经肌肉接头微管骨架异常”具体可体现为微管结合蛋白Futsch可以到达神经肌肉接头的末端和/或增加神经肌肉接头中的微管乙酰化水平。所述Tau蛋白为如下(a)或(b)或(C):
(a)由序列表中序列I所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列表中序列I所示的氨基酸序列第337位氨基酸残基由V突变为M得到的蛋白质；(c)将序列I的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的的由序列I衍生的蛋白质。本发明对于阿尔茨海默病发病机制分析具有深远意义，对于阿尔茨海默病的药物研发和阿尔茨海默病的治疗具有重大价值。
图I为AD患者的主要病理性特征。图2为实施例I中免疫细胞染色的结果。 图3为实施例I中werstern blot分析的结果。图4为实施例2中免疫细胞染色的结果。图5为实施例3中免疫细胞染色的结果。图6为实施例3中werstern blot分析的结果。图7为pUAST质粒的结构示意图。
具体实施例方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。人类0N4R野生型Tau蛋白，简称tauWT蛋白，如序列表的序列I所示,编码tauWT蛋白的基因(tauWT基因)如序列表的序列2所不。人类0N4R野生型Tau蛋白的V337M突变体，简称tauV337M蛋白，是将tauWT蛋白第337位氨基酸残基由V突变为M得到的。编码tauV337M蛋白的基因(tauV337M基因)是将tauWT基因第1009至1011位核苷酸由GTG突变为ATG得到的。 UAS-tauV337M果蝇(即基因型为UAS_tauV337M/+的果蝇)在pUAST质粒中UAS序列下游的多克隆位点插入tauV337M基因，得到的重组质粒；将重组质粒导入W1118黒腹果蝇(Drosophila melanogaster),得到 UAS_tauV337M 果妮；参考文献Curtis ff. Wittmannetal. ；Tauopathy in Drosophila:Neurodegeneration Without Neurofibrillary Tangles ；Science 293，711(2001);DOI:10. 1126/science. 1062382。UAS_tauWT果蝇(即基因型为UAS_wt tau/+的果蝇)在pUAST质粒(结构示意图见图7)中UAS序列下游的多克隆位点插入tauWT基因，得到的重组质粒；将重组质粒导入W1118黒腹果蚬(Drosophila melanogaster),得到UAS_tauWT果蚬；参考文献Curtis ff. Wittmann et al. ；Tauopathy in Drosophila:NeurodegenerationWithout Neurotbrillary Tangles ； Sc i ence 293, 71 1 (2001) ; DO I : 10. 1126/science. 1062382。C57-GAL4果蝇(即基因型为BG57-GAL4/+的果蝇)参考文献Budnik etal. , Regulation of Synapse Structure and Function by the Drosophila TumorSuppressorGene dlg;Neuron, Vol. 17, 1996。elav_GAL4 果妮，在保种中心的名称为 “P {GawB} elav[C155] ” 美国 Bloomington果妮保种中心，stock number:458。w1118 黒腹果妮(Drosophila melanogaster):美国 Bloomington 果妮保种中心，stocknumber:5905。pUAST 质粒(结构不意图见图 7) Drosophila genomics resource center,https://dgrc. cgb. indiana. edu/product/View product=1000, stock number :1000oanti-a -tubulin mAb B-5_l_2 :Sigma,货号为 T6074。 anti-ace-tubulinmAb6-llB-l :Sigma，货号为T7451。山羊抗小鼠二抗Invitrogen，货号为A-10667。兔抗小鼠 HRP 标记 IgG 抗体Invitrogen，货号为 61-6420。Futsch 抗体DSHB，货号为 22C10。 总体积IOOOml的果蝇培养基的制备方法如下各个成分的组成见表I。表I各个成分的组成
权利要求
1.Tubacin在制备产品中应用；所述产品的用途为如下(I)至(5)中的至少一种(1)抑制微管破坏；(2)增加微管乙酰化水平；(3)抑制神经肌肉接头形态异常；(4)抑制神经肌肉接头微管骨架异常；(5)治疗阿尔茨海默病。
2.如权利要求I所述的应用，其特征在于所述(I)中的所述“抑制微管破坏”为“抑制Tau蛋白过表达诱导的微管破坏”。
3.如权利要求I或2所述的应用，其特征在于所述(I)中的所述“抑制微管破坏”体现为促使微管密度增加和/或促进微管断头数目降低。
4.如权利要求I所述的应用，其特征在于所述(3)中的所述“抑制神经肌肉接头形态异常”为“抑制Tau蛋白过表达导致的神经肌肉接头形态异常”。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述(3)中的所述“抑制神经肌肉接头形态异常”体现为促使卫星突触扣结数目减少和/或神经肌肉接头总长度增加。
6.如权利要求I所述的应用，其特征在于所述(4)中的所述“抑制神经肌肉接头微管骨架异常”为“抑制Tau蛋白过表达导致的神经肌肉接头微管骨架异常”。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于所述(4)中的所述“抑制神经肌肉接头微管骨架异常”体现为微管结合蛋白Futsch可以到达神经肌肉接头的末端和/或增加神经肌肉接头中的微管乙酰化水平。
8.一种产品，它的活性成分为Tubacin ;所述产品的用途为如下(I)至(5)中的至少一种(I)抑制微管破坏；(2)增加微管乙酰化水平；(3)抑制神经肌肉接头形态异常；(4)抑制神经肌肉接头微管骨架异常；(5)治疗阿尔茨海默病。
9.如权利要求8所述的产品，其特征在于所述(I)中的所述“抑制微管破坏”为“抑制Tau蛋白过表达诱导的微管破坏”;所述(3)中的所述“抑制神经肌肉接头形态异常”为“抑制Tau蛋白过表达导致的神经肌肉接头形态异常”;所述(4)中的所述“抑制神经肌肉接头微管骨架异常”为“抑制Tau蛋白过表达导致的神经肌肉接头微管骨架异常”。
10.如权利要求8所述的产品，其特征在于所述(I)中的所述“抑制微管破坏”体现为促使微管密度增加和/或促进微管断头数目降低；所述(3冲的所述“抑制神经肌肉接头形态异常”体现为促使卫星突触扣结数目减少和/或神经肌肉接头总长度增加；所述(4)中的所述“抑制神经肌肉接头微管骨架异常”体现为微管结合蛋白Futsch可以到达神经肌肉接头的末端和/或增加神经肌肉接头中的微管乙酰化水平。
全文摘要
本发明公开了Tubacin的新用途。本发明提供了Tubacin在制备产品中应用；所述产品的用途为如下(1)至(5)中的至少一种(1)抑制微管破坏；(2)增加微管乙酰化水平；(3)抑制神经肌肉接头(NMJ)形态异常；(4)抑制神经肌肉接头(NMJ)微管骨架异常；(5)治疗阿尔茨海默病。本发明对于阿尔茨海默病发病机制分析具有深远意义，对于阿尔茨海默病的药物研发和阿尔茨海默病的治疗具有重大价值。
文档编号A61P25/28GK102940629SQ201210477190
公开日2013年2月27日 申请日期2012年11月21日 优先权日2012年11月21日
发明者熊英, 赵恺, 吴家曦, 张永清 申请人:中国科学院遗传与发育生物学研究所