一种灭活疫苗中ca16抗原免疫原性的检测方法
【专利摘要】本发明提供了一种灭活疫苗中CA16抗原免疫原性的检测方法，属于疫苗免疫【技术领域】，是应用大鼠作为实验动物，将含CA16抗原的灭活疫苗免疫大鼠，通过测定大鼠血清的中和抗体效价来评价CA16病毒灭活疫苗免疫原性。本发明方法具有敏感性强、可多次免疫、可持续观察免疫后抗体消长趋势的优点，在CA16病毒灭活疫苗免疫原性的评价上具有良好的应用前景。
【专利说明】—种灭活疫苗中CA16抗原免疫原性的检测方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及疫苗免疫【技术领域】，具体地说，涉及一种灭活疫苗中CA16抗原免疫原性的检测方法。
【背景技术】
[0002]手足口病是由肠道病毒引起的传染病，世界大部分地区均有此病流行的报导。肠道病毒EV71和柯萨奇病毒Cox A16 (简称CA16)感染交替出现，成为手足口病的主要病原体。
[0003]近年来，我国手足口病疫情日益严重，发病、重症和死亡病例呈逐年上升趋势，2008年全国 共报道手足口病例489，073例，死亡126例；2009年报告发病1，155，525例，死亡353例；2010年报告发病I, 774，669例，死亡905例；2011年报告发病I, 638，743例，死亡506例。其中重症和死亡病例主要由EV71病毒感染引起，死者年龄通常为0.5-3岁，病程仅2天。该病已严重危及我国人民，特别是婴幼儿人群的健康和生命，给社会带来了巨大的疾病负担，我国于2008年5月2日将其列入丙类传染病。
[0004]虽然重症和死亡病例主要由EV71病毒感染引起，但值得关注的是CA16与心肌炎、心包炎、难治性休克等综合性疾病相关，且在部分地区成为手足口病优势病原。此外，卫生部相关数据显示，上一年流行CA16的地区，第二年流行EV71时的报告病例数、重症和死亡病例数均明显增加，提示二者可能存在协同关系。柯萨奇病毒(Coxasckie virus)A16型(Cox A16, CA 16)是小RNA病毒科的单股正链RNA病毒，呈20面立体对称球形，直径约23-30nm。主要经粪-口、呼吸道和密切接触传播，可通过胎盘传给胎儿引起宫内感染。早期发现的手足口病的病原体主要为Cox A16型，20世纪70年代后，与EV71感染交替出现，成为手足口病的主要病原体。我国北京、福建、天津、吉林、山东、广东、深圳、浙江、四川、安徽等多个省份均有报道。目前尚无CA16病毒疫苗的报道，因此开展CA16病毒灭活疫苗的临床前研究并有效评价其免疫原性是十分必要的，但如何有效地评价CA16病毒灭活疫苗的免疫原性，至今未有其方法的报道。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于提供一种灭活疫苗中CA16抗原免疫原性的检测方法。
[0006]本发明提供的灭活疫苗中CA16抗原免疫原性的检测方法，是将含CA16抗原的灭活疫苗免疫大鼠，通过测定大鼠血清的中和抗体效价来检测CA16病毒灭活疫苗免疫原性。
[0007]所述大鼠为Wistar大鼠、SD大鼠或Brown Norway大鼠。
[0008]本发明方法中，免疫途径为腹腔注射、肌肉注射或皮下注射。其中，免疫剂量为每次每只大鼠注射含25~1600UCA16抗原的灭活疫苗。
[0009]其中，免疫程序为O天、14天分别免疫2次，第28天采血，分离血清，采用常规的微量中和法测定血清的中和抗体效价。
[0010]具体步骤如下:将血清倍比稀释，CA16病毒(购自ATCC，100CCID50/0.05ml)与不同稀释度的血清于37°C中和反应后接种敏感细胞(Vero/RD细胞，来源于ATCC)，根据细胞的感染情况判定血清中和抗体的效价，计算各组血清的GMT (几何平均值)。
[0011]本发明方法也可选用以下免疫程序:免疫程序为O天、14天、28天分别免疫3次，第42天采血，测定血清的中和抗体效价。
[0012]本发明所述的灭活疫苗，其佐剂为氢氧化铝。
[0013]进一步地，本发明提供了 CA16病毒灭活疫苗免疫原性的检测方法，将CA16病毒灭活疫苗免疫Wistar大鼠、SD大鼠或BrownNorway大鼠，免疫途径为腹腔注射、肌肉注射或皮下注射，免疫剂量为每次每只大鼠注射含25~1600U CA16抗原的灭活疫苗；免疫程序为O天、14天分别免疫2次，第28天采血，或O天、14天、28天分别免疫3次，第42天采血，测血清的中和抗体效价。[0014]本发明还提供了一种CA16病毒免疫原性的检测方法，将CA16病毒接种大鼠，通过测定大鼠血清的中和抗体效价来检测CA16病毒的免疫原性。
[0015]进一步地，检测CA16病毒免疫原性的方法为将CA16病毒接种Wistar大鼠、SD大鼠或Brown Norway大鼠，接种途径为腹腔注射、肌肉注射或皮下注射；免疫程序为O天、14天分别免疫2次，第28天采血，或，在第O天、14天、28天分别免疫3次，第42天采血，测血清的中和抗体效价。
[0016]上述免疫剂量，本领域技术人员可根据实验大鼠的性别、重量、日龄结合现有技术进行常规选择。
[0017]对于血清中和抗体效价，通常情况下本领域技术人员认为抗体水平不低于1:40则认为产生有保护性的抗体，也即免疫原具有较好的免疫原性。
[0018]本发明利用实验大鼠开展对含CA16抗原的灭活疫苗免疫原性进行评价研究，前期研究结果表明应用小鼠、兔、羊评价CA16疫苗的免疫原性效果均不理想，而应用大鼠作为模型评价CA16疫苗的免疫原性相对较敏感，且具有可多次免疫、可持续观察免疫后抗体消长趋势的优点。本发明方法在CA16病毒灭活疫苗免疫原性的检测上具有良好的应用前
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【具体实施方式】
[0019]以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
[0020]若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。若未特别指明，实施例中所用的生化试剂均为市售。本发明使用的的CA16病毒株(毒株保藏号为:CGMCC N0.5373)已在中国专利CN102559606A中公开。实施例中涉及的CA16灭活疫苗和EV71-CA16灭活疫苗均由北京科兴生物制品有限公司生产。
[0021]实施例1免疫原性方法的建立与验证
[0022]本发明将三批CA16灭活疫苗同时免疫了大鼠、小鼠、羊、兔子等实验动物，且结合细胞水平的血清中和抗体检测方法进行评价抗体水平，具体实施如下所示:
[0023]1、应用小鼠为实验动物检测CA16灭活疫苗免疫原性
[0024]实验动物:ICR小鼠、B/c小鼠，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。[0025]佐剂类型:氢氧化铝佐剂
[0026]免疫方式:腹腔注射
[0027]免疫程序:0天、14天两针免疫，28天采血，测量血清效价。
[0028]免疫剂量:0.5ml/只/次，0.5ml疫苗中含CA16抗原400U。试验结果见表1:
[0029]表1CA16灭活疫苗免疫小鼠后的血清中和抗体效价
[0030]
【权利要求】
1.一种灭活疫苗中CA16抗原免疫原性的检测方法，其特征在于，将含CA16抗原的灭活疫苗免疫大鼠，通过测定大鼠血清的中和抗体效价来检测CA16病毒灭活疫苗免疫原性。
2.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述大鼠为Wistar大鼠、SD大鼠或Brown Norway 大鼠。
3.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，免疫途径为腹腔注射、肌肉注射或皮下注射。
4.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，免疫剂量为每次每只大鼠注射含25~1600U的CA16抗原的灭活疫苗。
5.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，免疫程序为O天、14天分别免疫2次，第28天采血，测血清中和抗体的效价。
6.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，免疫程序为O天、14天、28天分别免疫3次，第42天采血，测血清中和抗体的效价。
7.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述灭活疫苗的佐剂为氢氧化铝。
8.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述灭活疫苗为CA16灭活疫苗或EV71-CA16病毒二联灭 活疫苗。
9.一种CA16病毒免疫原性的检测方法，其特征在于，将CA16病毒接种大鼠，通过测定大鼠血清的中和抗体效价来检测CA16病毒的免疫原性。
10.如权利要求9所述的检测方法，其特征在于，将CA16病毒接种Wistar大鼠、SD大鼠或Brown Norway大鼠，接种途径为腹腔注射、肌肉注射或皮下注射；免疫程序为O天、14天分别免疫2次，第28天采血，或，第O天、14天、28天分别免疫3次，第42天采血，测血清的中和抗体效价。
【文档编号】A61K49/00GK103830748SQ201210480431
【公开日】2014年6月4日 申请日期:2012年11月23日 优先权日:2012年11月23日
【发明者】王巍巍, 李雅静, 高强, 姜德玉, 尹卫东 申请人:北京科兴生物制品有限公司