专利名称：一种蛋鸡脾脏转移因子的生产工艺的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物工程技术领域，尤其是转移因子制备工艺的新技术。
背景技术：
转移因子是由具有生物活性的多肽及核苷酸组成的混合物，它能够将供体细胞所具有的细胞免疫功能转移给受体细胞，非特异性地增强一般细胞免疫，提高受体的免疫功能，而且安全无毒、无药物残留，是一种新型的免疫调节剂。主要用于对病毒性感染及自身免疫性疾病的治疗，配合疫苗使用可显著提高抗体滴度，增强免疫效果。现有技术中转移因子的一般提取工艺流程如下I对新鲜组织进行预处理，匀浆机匀浆后_20°C -20°C，反复冻融3-8次。2高速冷冻离心机离心取上清。3透析或超滤，截留分子量5000-10000。4制备不同剂型转移因子。上述制备转移因子的工艺流程普遍存在细胞破碎不完全、提取率低，原材料浪费多、成本高等缺陷，并且转移因子在现有的提纯工艺中易失活。另外，受限于提取工艺中的具体步骤和操作参数等，目前难以在产业上大规模生产质量合格的蛋鸡脾脏转移因子。
发明内容
本发明解决了以往转移因子制备工艺中因冻融方法导致的成本高、生物活性受影响，或细胞破碎不完全，有效成分产出率低，等诸多不足之处。本发明的新制备工艺具有高活性、高得率、低成本等诸多优点。适用于各种剂型、规格的制备需要。本发明提出的制备转移因子的主要工艺流程如下I将新鲜或解冻后的健康蛋鸡脾脏小心去除脂肪及筋膜，用生理盐水洗净、浙干、剪碎、称重备用。 2取处理好的脾脏按重量加入等量生理盐水，胶体磨连续研磨2-3次，每次3分钟I320°C条件下用 lmol/L 的 HCl 调 PH 至 3. 5。4将PH为3. 5的匀浆液置_20°C完全冰冻后，用25°C左右自来水完全融化，反复冻融3次。5 6000转/分钟，4°C离心20分钟，取上清液备用。取残渣添再次添加与起始蛋鸡脾脏等量的生理盐水，胶体磨研磨3分钟，再次调PH至3. 5，反复冻融3次后离心取上清，合并上清液。6按所得上清液的量加万分之5的甲醛灭活病毒。7将加有甲醛的上清液用截流值为5000道尔顿的中空纤维超滤膜加压超滤，所得滤液即为分子量小于5000道尔顿的转移因子原液。8原液在20°C条件下用lmol/L氢氧化钠调PH至7. O,按照所需浓度进行适当稀释，按O. 6g/L的量添加山梨酸。
9用孔径为O. 22 μ m的滤膜加压过滤除菌，所得滤液灌装即得。本制备工艺发明要点如下I采用胶体磨进行研磨，取得了优于匀浆机的匀浆效果，从而保证了转移因子高释放率，提高了转移因子的提取率。2在整个提取工艺中使用HCl调整体系的PH至3. 5其优点如下首先，pH3. 5的酸性环境有利于细胞的破膜作用，使得细胞内物质充分释放；其次，PH3. 5的酸性环境能显著抑制细菌、病毒的生长，起到一定的杀菌抑菌效果；再次，PH3. 5的酸性条件使得大部分杂蛋白发生变性，而使分子较小的转移因子处于可溶状态，使得在离心除去细胞碎片的同时也除去了大量的杂蛋白，即保证了转移因子的回收率，又简化了其后的提取步骤；最后，在ph3. 5的条件下进行冻融利于转移因子活性的保持，减少了提取工艺中的转移因子失活。3 6000转/分钟，4°C离心20分钟，取上清液备用。取残渣添加与起始蛋鸡脾脏等量的生理盐水，胶体磨研磨3分钟，再次调PH至3. 5，反复冻融3次后离心取上清，合并上清液。此步骤的优点如下优先分离出第一步冻融步骤中已经释放出来的转移因子，然后进行下一步冻融，避免了多次反复冻融对已经释放出来的转移因子活性的破坏；收集残渣再次研磨、调PH、反复冻融，使得没有释放完全的细胞内物质得以充分释放，增加转移因子的得率，节约成本。4添加加万分之5的甲醛灭活病毒。添加加万分之5的甲醛能够有效地起到杀灭匀浆上清液中的病毒和其它病原微生物，并且在对匀浆上清液进行超滤、稀释的过程中降低了甲醛的浓度。选择对匀浆液添加万分之5的甲醛即保证了灭活病毒等病原微生物的效果又减少了终产品中甲醛的残留，降低了副作用。本发明以目前通常提取方法和某品牌市售转移因子为对照进行转移因子临床试验，结果表明，本发明的方法制备得到的转移因子在多肽和核酸含量、活性、增强免疫方面及对NDV抗体滴度方面的效果均完全优于通常提取方法和目前市售产品。
具体实施例方式实施例1转移因子的制备(I)本申请的方法I将新鲜或解冻后的健康蛋鸡脾脏小心去除脂肪及筋膜，用生理盐水洗净、浙干、剪碎、称重备用。2取处理好的脾脏按重量加入等量生理盐水，胶体磨连续研磨2-3次，每次3分钟。3 20°C条件下用 lmol/L 的 HCl 调 PH 至 3. 5。4将PH为3. 5的匀浆液置_20°C完全冰冻后，用25°C左右自来水完全融化，反复冻融3次。5 6000转/分钟，4°C离心20分钟，取上清液备用。取残渣添加与起始蛋鸡脾脏等量的生理盐水，胶体磨研磨3分钟，再次调PH至3. 5，反复冻融3次后离心取上清，合并上清液。6按所得上清液的量加万分之5的甲醛灭活病毒。7将加有甲醛的上清液用截流值为5000道尔顿的中空纤维超滤膜加压超滤，所得滤液即为分子量小于5000道尔顿的转移因子原液。
8原液在20°C条件下用lmol/L氢氧化钠调PH至7. O,按照所需浓度进行适当稀释，按O. 6g/L的量添加山梨酸。9用孔径为O. 22 μ m的滤膜加压过滤除菌，所得滤液灌装即得。(2)对比提取方法(即通常的提取方法):以同一批鸡脾脏为原料，按照参考文献《鸡脾转移因子的制备及对雏鸡免疫应答的作用研究》(乔宏兴等，甘肃农业大学学报，2012. 02，第I期，13-16)中记载的常规提取方法提取鸡脾中的转移因子。实施例2对本发明所述工艺制备的转移因子的检测性状本品主要成分为低分子活性多肽和核糖，冷冻状态下为白色或淡黄色固体，解冻后为无色或微黄色澄明液体，可有微量多肽凝聚物沉淀。pH值按现行《中华人民共和国兽药典》附录进行测定，在20°C ±2°C时，pH值应为 6. O 7. 5。蛋白定性取本品适量2ml，加入20%磺基水杨酸试剂2ml，摇匀，溶液不得出现沉淀或混池反应。无菌检验按现行《中华人民共和国兽药典》2005版附录进行检验，应无菌生长。支原体检验按现行《中华人民共和国兽药典》2005版附录进行检验，应无支原体生长。外源病毒检验按现行《中华人民共和国兽药典》2005版附录进行检验，应无外源病毒污染。禽白血病病毒的检测按现行《中华人民共和国兽药典》2005版附录进行检验，应无外源病毒污染。安全检验对I日龄SPF鸡分别进行单剂量给药(O. 5ml/只)、单剂量重复给药(O. 5ml/只，每日一次，连用7日)、超剂量给药(2. 5ml/只)的安全性试验，连续观察14天，SPF鸡应全部健康存活。多肽按福林酚法进行，每Iml应不少于Img。核糖按核糖含量测定法进行，每Iml应不少于30 μ g。游离氨基酸采用高效液相色谱法，按现行《中华人民共和国兽药典》2005版附录进行测定。每Iml中游离氨基酸的量不得少于1. 3mg。活力测定取本品适量，按T细胞活性测定法一一脱E受体法测定，供试品管的E玫瑰花结百分率与对照管的E玫瑰花结百分率之差应不低于10. 0%。甲醛残留量按现行《中华人民共和国兽药典》2005版附录进行测定，不应超过O. 2%甲醛溶液量。实施例3转移因子的临床应用试验一不同提取方法产品含量比较
本专利方法提取的转移因子与对比提取方法提取的转移因子主要指标比较
权利要求
1.一种生产蛋鸡脾脏转移因子的方法，其特征在于生产方法如下所述 (1)取处理好的蛋鸡脾脏按重量加入等量生理盐水，用胶体磨连续2-3次研磨，每次3分钟，得匀浆液； (2)20°C条件下用lmol/L的HCl将上述匀浆液调pH至3. 5 ; (3)将上述pH为3.5的匀浆液置_20°C完全冰冻后，用25°C左右的自来水完全融化，反复冻融3次； (4)将步骤(3)得到的匀浆液在6000转/分钟，4°C离心20分钟，取上清液备用，取残渣添加与起始蛋鸡脾脏等量的生理盐水，胶体磨研磨3分钟，再次调pH至3. 5，反复冻融3次后离心取上清，合并上清液； (5)按所得上清液的量加万分之五的甲醛灭活病毒； (6)将上述加有甲醛的上清液用截流值为5000道尔顿的中空纤维超滤膜加压超滤，所得滤液即为分子量小于5000道尔顿的转移因子原液； (7)将上述转移因子原液在20°C条件下用Imol/LNaOH调pH至7，进行浓度测定后，按照所需浓度进行适当稀释，按O. 6g/L的量添加山梨酸； (8)用孔径为O.22 μ m的滤膜加压过滤除菌，灌装，得到转移因子成品。
2.按照权利要求1所述的方法生产的蛋鸡脾脏转移因子。
全文摘要
本发明涉及生物工程技术领域，尤其是转移因子制备工艺的新技术。处理好的蛋鸡脾脏加入等量生理盐水，用胶体磨均浆后，20℃条件下调PH值至3.5。-20℃-25℃反复冻融3次。离心取上清液备用。取残渣再次研磨、调PH、反复冻融3次、离心取上清，合并上清液。经病毒灭活、超滤、调PH值至7.0、过滤除菌等过程即得蛋鸡脾脏转移因子口服溶液。转移因子是由具有生物活性的多肽及核苷酸组成的混合物，它能够将供体细胞所具有的细胞免疫功能转移给受体细胞，非特异性地增强一般细胞免疫，提高受体的免疫功能，而且安全无毒，是一种新型的免疫调节剂。主要用于对病毒性感染及自身免疫性疾病的治疗，配合疫苗使用可显著增强免疫效果。
文档编号A61P37/04GK103027927SQ201210536559
公开日2013年4月10日 申请日期2012年12月13日 优先权日2012年12月13日
发明者赵风立, 尹建华, 吕振华, 侯娟娟 申请人:黑龙江省汇丰动物保健品有限公司, 青岛科亚华动物药业有限公司, 黑龙江省百洲生物工程有限公司