专利名称：一种兼具成骨及抗菌性能的钛表面改性方法
技术领域：
本发明涉及一种在医疗器械表面制备成骨和抗菌性兼具表面的方法，更确切地说涉及的是一种可用于人工骨、人工关节和牙种植体表面的银及钙共注入工艺，赋予其兼具成骨和抗菌性能的表面改性方法。属于医用材料表面改性领域。
背景技术：
近年来，随着材料表面涂层制备理论及技术的不断完善和发展，Ti植入体表面改性技术有了快速发展，这使Ti植入体生物相容性得到了进一步提高。然而，如前所述，长期临床跟踪及研究发现，现阶段致使植入体失效的主要原因有2个方面[BiomaCTomolecules,2009, 10:1603-1611 ;Tissue Engineering:Part A, 2 009，15:417-426.]:①植入体表面生物活性不够理想，致使硬组织植入体骨整合能力差，与周围组织结合不佳植入体表面无抗菌性，致使植入体相关细菌感染发生率高。因此，欲改善Ti植入效果，最佳方案是同时提高钛植入体表面细胞相容性及抗菌性能。一方面，银作为抑菌药物使用早已被人们所熟知。早在公元前4000年人们就已开始使用银来预防感染[Surg Infect 2009，10:289-292]。硝酸银被用以治疗伤口慢性局部溃烂，可以追溯至17世纪[Burns 2000, 26:117-130] 随着20世纪40年代青霉素的发明，银作为抗感染药物使用的频率才有所减少[J Antimicrob Chemother2007, 59:587-590]。但近年，随着抗生素耐药性问题日趋严重，银的抗菌效用又开始得到人们重视[J Antimicrob Chemother 2006, 57:589-608] 基于纳米材料特殊物理化学性质，银纳米颗粒作为新一代的抗菌材料，在绷带、医疗器械、洗液等方面的应用也有较多报道[Biotechnol Adv 2009，27:76_83]。虽然银颗粒的抗菌或抑菌效果明显，但其作用机理还没有完全搞清楚，研究显示银可阻碍细菌膜电子转移过程，破坏细菌膜结构[Nat Mater2008，7:236-241]，但具体控制方法仍有待开发。此外，游离态的银纳米颗粒容易被正常细胞吞噬并引起生物毒性[Biomaterials 2011, 32:9810-9817]，故银纳米颗粒生物毒性的控制也是其抗菌性能利用过程中应该兼顾的方面。另一方面，钙是成骨必需的营养元素[J. Am. Coll. Nutr. ,2000，19:715-737.Crit. Rev. Food Sc1. Nutr. , 2006, 46:621-628.]。大量研究表明适当的 I丐可促进成骨细胞分化、增殖及钙化[Biomaterials 2005, 26:4847-4855]。细胞外钙离子通过影响成骨细胞钙敏感受体并进一步控制其谷氨酸分泌，因此在骨重建起着关键作用[Bone 2010,46:571-576;Biomaterials 2011,32:2757-2774],虽然钛表面钙离子注入改性已有报道，并且也证实钙注入可显著改善钛的成骨性能[Biomaterials 2001,22:2139-2151;Biomaterials 2005,26:4717-4727;Biomaterials2007，28:38-44;Biomaterials 2007, 28:3306-3313]。这种单独钙注入工艺，虽然促进了成骨细胞的粘附、分化、增殖等行为，但是也同样会促进细菌在材料表面的粘附、增殖，不能实现兼具成骨与抗菌的目的。但是，一方面，这种单独钙注入工艺，虽然促进了成骨细胞的粘附、分化、增殖等行为，但是也同样会促进细菌在材料表面的粘附、增殖，不能实现兼具成骨与抗菌的目的。另一方面，由于I丐的标准电极电位为 _2· 868V[ Vanysek P. Electrochemical series. CRCPress LLC，2000.]，化学活泼，易与水，与空气中的氧反应，致使纯金属钙的加工、保存较难，因此现阶段所报道的钙注入工艺均采用束线式离子注入系统，以钙粉末蒸发的方式作为离子源进行，这种工艺不宜施行二元共注入，获得具有多种生物效应的改性表面。现阶段并没有采用金属钙阴极脉冲弧作为等离子体浸没离子注入弧源的报道。为此，本发明提出银、钙注入均采用阴极脉冲弧作为等离子体浸没离子注入弧源，将银和钙同时引入钛表面，以同时改善钛表面的成骨及抗菌性能，具有显著实用性。
发明内容
本发明基于游离态的银纳米颗粒容易被正常细胞吞噬并引起生物毒性以及单独钙注入工艺，虽然促进了成骨细胞的粘附、分化、增殖等行为，但是也同样 会促进细菌在材料表面的粘附、增殖，不能实现兼具成骨与抗菌的问题，提出利用等离子体浸没离子注入技术，同时将银和钙注入到基材表面，提出了一种兼具成骨和抗菌性能表面的制备方法。在此，本发明提供一种兼具成骨及抗菌性能的钛表面改性方法，其特征在于，采用等离子体浸没离子注入处理工艺将银离子和钙离子共注入钛基材表面，其中所述共注入为同时激发分别以纯银和纯钙为阴极的两个阴极脉冲弧源进行等离子体浸没离子注入。本发明的方法采用等离子体浸没离子注入技术同时(同一炉处理)将银和钙离子都引入基材表面。本发明所述银、钙共注入改性方法可用于改善可植入医疗器械(如人工骨、人工关节和牙种植体)表面的成骨和抗菌性能。这样所制备的改性后的材料其对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均具有显著抑制效果。其对成骨相关细胞(BMSCs、MG63细胞)粘附和增殖具有显著促进作用。优选地，本发明的方法所述等离子体浸没离子注入处理的工艺参数为真空室温度为20 60°C，真空度为3XE-3 4XE_3Pa ;注入电压为15 40kV，脉宽为300 600 μ s，频率为5 9Hz ;处理时间为O. 5 2. Oh。本发明的方法中还可以进一步包括在刚加工好的钙阴极表面涂覆碳覆盖层。这样可以延缓钙在空气中的氧化变质过程并利于所述钙阴极在空气中的保存。碳覆盖层须完整覆盖所述阴极。覆盖层厚度优选为大于200纳米。在本发明中，所述钛基材可以为纯钛或钛合金。本发明所述离子注入技术为等离子体浸没离子注入(PIII)，该技术可对三维实体进行表面处理，具有实用性。本发明制备工艺可控性好，易于推广应用。本发明的方法所制备的兼具成骨及抗菌性能的钛表面改性材料，所述银以单质银的形式“镶嵌”在基材表面，不易游离被细胞吞噬而引起细胞毒性。而所述钙则可以离子形式游离在液体(如生理体液)中，并影响细胞、细菌行为。本发明所制备银、钙共注入钛表面，对金黄色葡萄球菌(革兰氏阳性)和大肠杆菌(革兰氏阴性)均有抗菌效果，具有广谱抗菌特点；对成骨相关细胞的粘附、增殖、分化有显著促进作用，具有促进成骨效果。
图1为实施例1经本发明的方法改性后的材料表面银、钙X光电子能谱(XPS)深度分布曲线，可见经本发明的方法改性后，银、钙均分布在改性后材料的表面；
图2(a)为实施例1经本发明的方法改性后的材料表面XPS钙2p的高分辨谱，可见改性后材料最外层表面只有钙氧化物的峰；
图2 (b)为实施例1经本发明的方法改性后的材料10纳米深处XPS钙2p的高分辨谱，可见改性后材料10纳米深处有单质钙的峰；
图3为实施例1经本发明的方法改性后的材料体外细胞实验结果，显示银、钙等离子体浸没离子共注入材料可显著促进成骨相关MG63细胞增殖； 图4为实施例1经本发明的方法改性后的材料抗菌实验结果，显示经本发明的方法改性后的材料可显著抑制大肠杆菌增殖；
图5为实施例2经本发明的方法改性后的材料扫描电镜观察，显示经本发明的方法改性后的材料表面有银纳米颗粒形成；
图6为实施例2经本发明的方法改性后的材料体外细胞实验结果，显示成骨相关MG63细胞可经本发明的方法改性后的材料的表面正常粘附、铺展；
图7为实施例2经本发明的方法改性后的材料抗菌实验结果，显示本发明的方法改性后的材料可显著抑制金黄色葡萄球菌增殖；
图8为实施例3经本发明的方法改性后的材料表面X光电子能谱，结果显示离子注入处理后，银、钙均分布在改性后材料的表面；
图9为实施例3经本发明的方法改性后的材料体外细胞实验结果，显示大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)可迅速在本发明的方法改性后的材料表面粘附、铺展、增殖；
图10为实施例3经本发明的方法改性后的材料抗菌实验结果，显示本发明的方法改性后的材料可显著抑制金黄色葡萄球菌增殖；
图11为实施例4经本发明的方法改性后的材料表面X光电子能谱，结果显示经本发明的方法改性后，银、钙均分布在改性后材料的表面；
图12为实施例4经本发明的方法改性后的材料体外细胞实验结果，显示本发明的方法改性后的材料可显著促进成骨相关MG63细胞增殖；
图13为实施例4经本发明的方法改性后的材料抗菌实验结果，显示经本发明的方法改性后的材料可显著抑制金黄色葡萄球菌增殖；
图14为实施例5制备的改性材料的材料抗菌实验结果，显示经本实施例的方法改性后的材料不具有显著抑菌效果；
图15为实施例6制备的改性材料的体外细胞实验结果，显示银/钙共注入改性材料比单独钙及单独银注入材料对BMSCs细胞粘附的促进效果更显著。
具体实施例方式以下结合附图及下述实施方式进一步说明本发明，应理解，下述实施方式和/或附图仅用于说明本发明，而非限制本发明。本发明基于游离态的银纳米颗粒容易被正常细胞吞噬并引起生物毒性以及单独钙注入工艺，虽然促进了成骨细胞的粘附、分化、增殖等行为，但是也同样会促进细菌在材料表面的粘附、增殖，不能实现兼具成骨与抗菌的问题，提出利用等离子体浸没离子注入技术，同时将银和钙注入到基材表面，提出了一种兼具成骨和抗菌性能表面的制备方法。为此，本发明提供一种兼具成骨及抗菌性能的钛表面改性方法，其特征在于，采用等离子体浸没离子注入处理工艺将银离子和钙离子共注入钛基材表面，其中所述共注入为同时激发分别以纯银和纯钙为阴极的两个阴极脉冲弧源进行等离子体浸没离子注入。本发明所述银、钙共注入改性方法可用于改善可植入医疗器械(如人工骨、人工关节和牙种植体)表面的成骨和抗菌性能。更具体地，作为示例，本发明可以包括以下步骤
a)先对基材表面油污去除；
b)然后采用等离子体浸没离子注入技术(PIII)对基材进行银、钙离子共注入。
在步骤b)中，PIII处理，采用脉冲弧源，以纯银和纯钙为阴极。PIII处理工艺参数为真空室温度为20 60°C，真空度为3XE-3 4XE_3Pa，注入电压为15 40kV，脉宽为300 600 μ s，频率为5 9Hz，处理时间为O. 5 2h。上述银、钙等离子体浸没离子注入为同时、同炉进行。又，所述基材可为医用纯钛或钛合金。在步骤b)中，所述“共注入”为同时激发两个阴极脉冲弧源(分别为银、钙)进行等离子体浸没离子注入。这不同于先激发其中一个阴极脉冲弧源注入一种元素后再激发另一个阴极脉冲弧源注入另一种元素的情况(此情况本发明称为先后注入)。本发明所述钙阴极在空气中保存时，应在刚加工好的钙阴极表面涂覆碳覆盖层，以延缓其在空气中的氧化变质过程。涂覆碳覆盖层例如可用普通铅笔(如2B)实施，碳覆盖层须完整覆盖阴极，厚度例如可大于200纳米。本发明将银和钙同时引入钛表面，以同时改善钛表面的成骨及抗菌性能，具有显著实用性。下面进一步例举实施例以详细说明本发明。同样应理解，以下实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员根据本发明的上述内容作出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。下述示例具体的温度、时间、工艺参数等也仅是合适范围中的一个示例，即、本领域技术人员可以通过本文的说明做合适的范围内选择，而并非要限定于下文示例的具体数值。实施例1
(a)以医用纯钛为基材，表面丙酮去油处理后装炉，采用脉冲弧源，以纯银、纯钙为阴极，用普通铅笔(如2B)在钙阴极上涂覆一层完整的碳覆盖层，厚度大于200纳米，然后进行银、钙等离子体浸没离子共注入处理。离子注入采用具两个脉冲弧源的离子注入机，两个脉冲弧源联动控制。离子注入工艺参数为真空室温度为50 60°C，真空度为3XE-3 4XE-3Pa，注入电压为30 40kV，脉宽为 300 450μs，频率为5 7Hz，处理时间为 l.Oh ；
(b)X光电子能谱分析(使用仪器为美国PE-PHI公司PHI5802)，显示离子注入处理后，银、钙均分布在材料的表面(图1)，材料的最外层表面没有发现钙单质所对应的结合能峰(图2a)，仅有氧化钙(2ρ3/2=347·423)、碳酸钙(2ρ3/2=347. 035)以及额外的2ρ3/2=348. 183 (可能与银形成合金)峰；但是在材料的表面IOnm深处(图2b),却可找到单质钙的结合能峰(2p3/2=344. 502)，除此之外，还有氧化钙(2p3/2=347. 220)及额外的2p3/2=348.079(可能与银形成合金)峰。氧化钙和碳酸钙的形成与钙元素的高反应活性，材料在空气中较长时间暴露有关；(C)体外细胞实验(采用alamarBlue assay,阿尔玛蓝还原方法)，显示经本发明的方法改性后的材料可显著促进成骨相关MG63细胞增殖(图3);
(d)抗菌实验结果(将细菌种在样品表面，在37°C下培养一定时间后，脱水干燥在扫描电镜下观察)，显示经本发明的方法改性后的材料可显著抑制大肠杆菌增殖(图4)。实施例2
(a)以医用纯钛为基材，表面丙酮去油处理后装炉，采用脉冲弧源，以纯银、纯钙为阴极，用普通铅笔(如2B)在钙阴极上涂覆一层完整的碳覆盖层，厚度大于200纳米，然后进行银、钙等离子体浸没离子共注入处理。离子注入采用具两个脉冲弧源的离子注入机，两个脉冲弧源联动控制。离子注入工艺参数为真空室温度为20 40°C，真空度为3XE-3 4XE-3Pa，注入电压为15 25kV，脉宽为500 600 μ S，频 率为7 9Hz，处理时间为O. 5h ；
(b)扫描电镜观察，显示离子注入处理后，材料表面有银纳米颗粒形成(图5);
(c)体外细胞实验(将细胞种在样品表面，在CO2培养箱中37°C下培养一定时间后，脱水干燥在扫描电镜下观察)，显示成骨相关MG63细胞可在银、钙等离子体浸没离子共注入材料的表面正常粘附、铺展(图6);
(d)抗菌实验结果(将细菌种在样品表面，在37°C下培养一定时间后，脱水干燥在扫描电镜下观察)，显示银、钙等离子体浸没离子共注入材料可显著抑制金黄色葡萄球菌增殖(图 7)。实施例3
(a)以医用纯钛为基材，表面丙酮去油处理后装炉，采用脉冲弧源，以纯银、纯钙为阴极，用普通铅笔(如2B)在钙阴极上涂覆一层完整的碳覆盖层，厚度大于200纳米，然后进行银、钙等离子体浸没离子共注入处理。离子注入采用具两个脉冲弧源的离子注入机，两个脉冲弧源联动控制。离子注入工艺参数为真空室温度为30 50°C，真空度为3XE-3 4XE-3Pa,注入电压为25 30kV，脉宽为400 550 μ S，频率为6 8Hz，处理时间为2. Oh ；
(b)X光电子能谱分析(使用仪器为美国PE-PHI公司PHI5802)，显示离子注入处理后，银、钙均分布在材料表面(图8);
(c)体外细胞实验(将细胞种在样品表面，在CO2培养箱中37°C下培养一定时间后，染色后在光学显微镜下观察)，显示大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)可迅速在银、钙等离子体浸没离子共注入材料表面粘附、铺展、增殖(图9);
(d)抗菌实验结果(将细菌种在样品表面，在37°C下培养一定时间后，脱水干燥在扫描电镜下观察)，显示银、钙等离子体浸没离子共注入材料可显著抑制金黄色葡萄球菌增殖(图 10)。实施例4
(a)以医用纯钛为基材，表面丙酮去油处理后装炉，采用脉冲弧源，以纯银、纯钙为阴极，用普通铅笔(如2B)在钙阴极上涂覆一层完整的碳覆盖层，厚度大于200纳米，然后进行银、钙等离子体浸没离子共注入处理。离子注入采用具两个脉冲弧源的离子注入机，两个脉冲弧源联动控制。离子注入工艺参数为真空室温度为45 55°C，真空度为3XE-3 4XE-3Pa，注入电压为28 38kV，脉宽为400 550μs，频率为7 8Hz，处理时间为1. 5h ；
(b)X光电子能谱分析(使用仪器为美国PE-PHI公司PHI 5802)，显示离子注入处理后，银、钙均分布在材料表面(图11);(C)体外细胞实验(采用alamarBlue assay,阿尔玛蓝还原方法)，显示银、韩等离子体浸没离子共注入材料可显著促进成骨相关MG63细胞增殖(图12);
(d)抗菌实验结果(采用菌落数实验方法)，显示银、钙等离子体浸没离子共注入材料可显著抑制金黄色葡萄球菌增殖(图13)。实施例5
(a)以医用纯钛为基材，表面丙酮去油处理后装炉，采用脉冲弧源，先以纯钙为阴极，用普通铅笔(如2B)在钙阴极上涂覆一层完整的碳覆盖层，厚度大于200纳米，然后进行钙等离子体浸没离子注入处理。离子注入采用具两个脉冲弧源的离子注入机，两个脉冲弧源联动控制。离子注入工艺参数为真空室温度为45 55°C，真空度为3XE-3 4XE-3Pa，注入电压为28 38kV，脉宽为400 550 μ S，频率 为7 8Hz，处理时间为1. Oh ；
(b)对进行过(a)步骤处理的材料，以纯银为阴极，再进行银等离子体浸没离子共注入处理。离子注入工艺参数为真空室温度为45 55°C，真空度为3XE-3 4XE_3Pa，注入电压为28 38kV，脉宽为400 550 μ S，频率为7 8Hz，处理时间为1. Oh ；
(c)抗菌实验结果(将细菌种在样品表面，在37°C下培养一定时间后，脱水干燥在扫描电镜下观察)，显示钙、银先后等离子体浸没离子注入的材料对金黄色葡萄球菌增殖不具有显著抑制效果(图14)。实施例6
(a)以医用纯钛为基材，表面丙酮去油处理后装炉，采用脉冲弧源，以纯银、纯钙为阴极，用普通铅笔(如2B)在钙阴极上涂覆一层完整的碳覆盖层，厚度大于200纳米，然后进行银/钙等离子体浸没离子共注入及钙、银单独等离子体浸没离子注入处理。离子注入采用具两个脉冲弧源的离子注入机，两个脉冲弧源联动控制。离子注入工艺参数均为真空室温度为45 55°C，真空度为3XE-3 4XE_3Pa，注入电压为25 35kV，脉宽为400 550 μ S，频率为7 8Hz，处理时间为1. 5h ；
(b)体外细胞实验(将细胞种在样品表面，在CO2培养箱中37°C下培养一定时间后，染色后在光学显微镜下观察)，显示银/钙共注入改性材料比单独钙及单独银注入改性材料对BMSCs细胞粘附的促进效果更显著(图15)。实施例5对比了金黄色葡萄在钙、银先后注入及不注入钛表面的粘附情况，虽然材料表面同时注入有钙、银两种元素，但其对金黄色葡萄球菌并不具有显著抑制效果，这说明在某些情况钙的存在可削弱银的抗菌性表现。实施例6对比了干细胞(BMSC)在银/钙共注入，单注钙，单注银及纯钛表面培养I小时后的粘附情况，可见银/钙共注入表面对细胞粘附的促进效果显著优于单注入钙离子，单注入银离子的情况，这说明银/钙共注入表面不但对细菌具有协同效应(实施例1)，银/钙共注入的协同效果不是简单的两种元素分别注入效果的简单叠加，对正常细胞也有协同效应。产业应用性根据本发明所述银/钙共注入表面具有抑制细菌粘附、增殖，而促进正常细胞增殖的特征。本发明所述工艺简单易行，可应用于植入器械(如牙种植体、人工关节等)表面改性。
权利要求
1.一种兼具成骨及抗菌性能的钛表面改性方法，其特征在于，采用等离子体浸没离子注入处理工艺将银离子和钙离子共注入钛基材表面，其中所述共注入为同时激发分别以纯银和纯钙为阴极的两个阴极脉冲弧源进行等离子体浸没离子注入。
2.根据权利要求1所述的改性方法，其特征在于，所述等离子体浸没离子注入处理的工艺参数为真空室温度为20 60°C，真空度为3XE-3 4XE_3Pa ;注入电压为15 40kV,脉宽为300 600 u s,频率为5 9Hz ;处理时间为0. 5 2. Oh。
3.根据权利要求1或2所述的改性方法，其特征在于，所述钛基材为医用纯钛或钛合 金。
4.一种兼具成骨及抗菌性能的钛表面改性材料,其特征在于,所述材料由权利要求1至3中任一项所述的改性方法制备。
全文摘要
本发明涉及一种兼具成骨及抗菌性能的钛表面改性方法，采用等离子体浸没离子注入处理工艺将银离子和钙离子共注入钛基材表面，其中所述共注入为同时激发分别以纯银和纯钙为阴极的两个阴极脉冲弧源进行等离子体浸没离子注入。本发明所述银、钙共注入改性方法可用于改善可植入医疗器械(如人工骨、人工关节和牙种植体)表面的成骨和抗菌性能。这样所制备的改性后的材料对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均具有显著抑制效果。其对成骨相关细胞(BMSCs、MG63细胞)粘附和增殖具有显著促进作用。
文档编号A61L27/54GK103014646SQ201210537119
公开日2013年4月3日 申请日期2012年12月12日 优先权日2012年12月12日
发明者曹辉亮, 刘宣勇 申请人:中国科学院上海硅酸盐研究所