突变型大肠杆菌忌热毒素、其制备方法、增加免疫反应的佐剂及疫苗的制作方法【专利摘要】本发明提供一种突变型大肠杆菌忌热毒素、其制备方法、增加免疫反应的佐剂及疫苗。所述制备方法及其产物是通过大肠杆菌忌热毒素基因的定点突变、将大肠杆菌忌热毒素A亚单位及B亚单位的信号肽置换为大肠杆菌外膜蛋白质的信号肽、以及改造大肠杆菌外膜蛋白质信号肽而达成。此外，本发明具有可应用于佐剂及疫苗，可使其大量生产且降低成本等优点。【专利说明】突变型大肠杆菌忌热毒素、其制备方法、增加免疫反应的佐剂及疫苗【
技术领域：
】[0001]本发明是关于一种突变型大肠杆菌忌热毒素及其制备方法，特别是关于一种提升突变型大肠杆菌忌热毒素的产量以降低蛋白质佐剂与疫苗的生产成本及其方法。【
背景技术：
】[0002]大肠杆菌属在分类学上归属于肠道细菌科(Enterobacteriaceae),为兼性厌氧、不产孢的革兰氏阴性菌。大多数的大肠杆菌对人畜无害，但部分血清型的大肠杆菌则会引起腹泻、食物中毒及肠道外感染等症状。致病型大肠杆菌依发病型态的不同，可分为下痢性大肠杆菌(DiarrheagenicE.coli)及肠道外致病大肠杆菌(ExtraintestinalpathogenicE.coli,ExPEC)两类。其中，下痢性大肠杆菌又可分为肠致病性大肠杆菌(enteropathogenicE.coli；EPEC)、肠毒素产生性大肠杆菌(enterotoxigeicE.coli；ETEC)、肠侵袭性大肠杆菌(enteroinvasiveE.coli；EIEC)、肠道出血性大肠杆菌(enterohemorrageicE.coli；EHEC)及肠附着性大肠杆菌(enteroadherentaggregativeE.coli；EAggEC)等五类。肠道外致病大肠杆菌可分为尿道致病性大肠杆菌(UropathogenicE.coli;UPEC)、脑膜炎大肠杆菌(NeonatalmeningitisE.coli;NMEC)、败血性大肠杆菌(SepticemicE.coli；SEC)及细胞脱附性大肠杆菌(cell-detachingE.coli；CDEC)等四类(Kaperetal.,2004；PavankumarandSankaran,2008)。[0003]肠毒素产生性大肠杆菌会产生热稳定毒素(heatstabletoxin；ST)和忌热毒素(不耐热肠毒素，heatlabiletoxin；LT)(YamamotoandNakazawa,1997)。热稳定毒素可依照其对甲醇的溶解与否及对蛋白酶的抗性再区分为STI(STa)及STII(STb)。其中STI是由18~19个氨基酸所组成的肽，分子量约在1500~2000Daltons，可溶解于甲醇中，对蛋白酶具有抗性。STII则是由48个氨基酸所组成的肽，无法溶解于甲醇中，对蛋白酶具有敏感性(DubreuiI，2008)。热稳定毒素在100°C下加热30分钟仍不会失去活性。忌热毒素与霍乱弧菌(Vibriocholerae)所产生的霍乱毒素(choleratoxin；CT)具有相似的结构及作用机制，依据其与CT抗血清中和反应与否，又可区分为LTI及LTII。其中LTI可与CT抗血清反应；依照来源宿主的不同，又可区分为LTp-1及LTh-1；LTp-1是由猪只来源的ETEC所产生，LTh-1则是由人类来源的ETEC所产生。LTh-1及LTp-1氨基酸的相似度达95%以上,但毒性有别。体外及体内试验的结果显示，LTp-1的毒性低于LTh-1(Lasaroetal.，2008)。LTII则无法与CT抗血清反应；依据氨基酸组成及抗原性的不同又可区分为LTIIa、LTIIb及LTIIc。这些忌热毒素在65°C下加热30分钟即失去活性。[0004]不同菌株产生毒素的能力有所不同；如鞭毛抗原K88阳性反应的菌株通常会产生LT及STI,鞭毛抗原K99或987P1阳性反应的菌株仅会产生STI(YamamotoandKakazawa,1997)。[0005]忌热毒素LTI属于A-B毒素(A-Btoxin)，为高分子量的复合物，是由一个A亚单位(LT-A)及五个B亚单位(LT-B)所组成。A亚单位的分子量约为30kDa，由Al(I~192)及A2(195~240)两个多肽链以双硫键结合所组成，主要扮演毒素的角色。此亚单位具有二磷酸腺核苷核糖转移酶(ADP-ribosyltransferase)活性,在进入细肠细胞后，A亚单位的双硫键会被破坏，且被宿主的蛋白酶剪切为Al及A2片段。Al会活化腺苷酸环化酶(adenylatecyclase),使细胞中的环AMP(cAMP)增加。cAMP的增加会活化蛋白质激酶A(proteinkinaseA),将离子通道磷酸化,进而促使细胞中的Na+、K+及水分向肠腔内转移，水份与离子的大量流失会导致腹泻、脱水和电解质紊乱。B亚单位的分子量约为12kDa，其能与肠细胞膜上的GMl神经节苷酯(GMlganglioside)受体(receptor)结合,协助Al亚单位进入细胞内。研究显示，LTI除了造成人类及动物的腹泻外，亦具有做为大肠杆菌疫苗及疫苗佐剂的潜力。[0006]1972年，Northrup及Fauci等学者发现将霍乱毒素(choleratoxin；CT)与绵羊红血球细胞(sheepredbloodcells；SRBC)混合后,经静脉注射后可增进抗SRBC抗体的效价。1984年，Elson及Ealding等学者发现CT具有黏膜佐剂的效果。1988年，Lycke等学者发现氨基酸组成与结构和CT相似的LTI亦具有黏膜佐剂的效果，且可避免口服耐受性的问题。后续的研究结果显示，LTI亦可作为注射佐剂。有关LTI增强免疫反应的机制仍未阐明，目前仅知(I)LT的A亚单位及B亚单位与佐剂活性有关(Rappuolietal.，1999)。(2)LT可促进抗原呈现细胞表达MHC-1I分子，并刺激⑶4+T细胞的增殖反应(Yamamotoetal.,1999)o(3)LT会刺激细胞激素的产生，可诱发THl及TH2免应反应(Yamamotoetal.，2001)。(4)TH17细胞与大肠杆菌忌热毒素的佐剂活性有关(Breretonetal.,2011)。[0007]虽然LTI具有佐剂的效果，但以肠毒素产生性大肠杆菌生产LTI作为佐剂具有多项缺点，包括:(1)操作肠毒素产生性大肠杆菌具有感染的风险。(2)不同菌株的毒素生产量有别且产量低(约为60iig~2.5mg)(Lasaroetal.，2006)。(3)天然毒素虽能增进免疫效果，但具有毒性，不适合直接作为疫苗佐剂。以重组DNA技术生产低毒性或无毒性毒素可改善上述的缺点。例如中国台湾专利案1304838号，利用大肠杆菌表达系统生产无毒性LTI，此毒素LT-A的第61号氨基酸由丝氨酸(Serine)突变为精氨酸(Arginine)或赖氨酸(Lysine);或是美国专利案US7291588号，`利用细菌或酵母菌生产无毒性LTI，此毒素LT-A的第72号氨基酸由丙氨酸(alanine)突变为精氨酸(arginine)。然而,该些发明皆无法大量地量产突变型大肠杆菌忌热毒素；缘此，本发明的主要目的在于提升突变体的产量以降低蛋白质佐剂的生产成本。【
发明内容】[0008]有鉴于此，本发明的目的是开发一种可降低毒性甚至无毒的大肠杆菌忌热毒素，其利用突变其氨基酸序列所制得，其可使突变体的产量提升以降低蛋白质佐剂的生产成本。[0009]同时，本发明的另一目的是制备可同时诱发体液性免疫反应及细胞性免疫反应的佐剂，其可与抗原组合为疫苗。[0010]为达上述目的，本发明提供一种制备突变型大肠杆菌忌热毒素的方法，其可包含:(a)提供大肠杆菌忌热毒素的DNA序列，其至少包含一个A亚单位及一个B亚单位；(b)将A亚单位的第63号氨基酸突变为赖氨酸的密码子；(C)将A及B亚单位中转译为信号肽的DNA分别取代为转译为大肠杆菌外膜蛋白质的信号肽的DNA;(d)将大肠杆菌外膜蛋白质的信号肽的第9号氨基酸突变为缬氨酸的密码子；以及(e)将步骤(d)所制得的突变大肠杆菌忌热毒素的DNA置入大肠杆菌表达系统以制得突变型大肠杆菌忌热毒素。[0011]较佳地，大肠杆菌忌热毒素可包含一个A亚单位及五个B亚单位。[0012]在本发明的一较佳实施例中，当执行(e)步骤时，可先将突变大肠杆菌忌热毒素的DNA嵌入质粒，再将质粒转化入大肠杆菌表达系统。[0013]在本发明的一较佳实施例中，在(e)步骤之后，所产生的突变型大肠杆菌忌热毒素可采用固定化半乳糖树脂进行纯化。[0014]较佳地，步骤(a)的大肠杆菌忌热毒素的DNA序列可包含SEQIDN0.23、24或25。[0015]较佳地，大肠杆菌忌热毒素的A亚单位可包含氨基酸序列SEQIDN0.26。[0016]较佳地，大肠杆菌忌热毒素的B亚单位可包含氨基酸序列SEQIDN0.27。[0017]较佳地，大肠杆菌外膜蛋白质的信号肽可包含氨基酸序列SEQIDN0.14。[0018]在本发明的一较佳实施例中，大肠杆菌忌热毒素的A亚单位的第63号氨基酸的密码子可为丝氨酸。[0019]在本发明的一较佳实施例中，大肠杆菌外膜蛋白质的信号肽的第9号氨基酸的密码子为丙氨酸。[0020]在本发明的一较佳实施例中，当执行(b)步骤时，可利用引物进行重叠延伸聚合酶链式反应；其中，上述的引物可包含SEQIDN0.1、2、3、4、5及6。[0021]在本发明的一较佳实施例中，当执行(C)步骤时，可利用引物进行重叠延伸聚合酶链式反应；其中，上述的引物可包含SEQIDN0.7、8、9、10、11、12及13。[0022]在本发明的一较佳实施例中，当执行(d)步骤时，可利用引物进行重叠延伸聚合酶链式反应；其中，上述的引物可包含SEQIDN0.15、16、17及18。[0023]此外，本发明另提供一种突变型大肠杆菌忌热毒素，其可包含:至少一个A亚单位及至少一个B亚单位；其中A亚单位的第63号氨基酸可为赖氨酸；A亚单位及B亚单位的信号肽为大肠杆菌外膜蛋白质的信号肽，且大肠杆菌外膜蛋白质的信号肽的第9号氨基酸可为缬氨酸。[0024]较佳地，大肠杆菌忌热毒素可包含一个A亚单位及五个B亚单位。[0025]于本发明的一较佳态样中，大肠杆菌外膜蛋白质A的信号肽可包含氨基酸序列SEQIDN0.14。[0026]较佳地，本发明的突变型大肠杆菌忌热毒素可包含SEQIDN0.30的DNA序列。[0027]较佳地，本发明的突变型大肠杆菌忌热毒素可为经减毒的大肠杆菌忌热毒素。[0028]再者，本发明另可提供一种增加个体免疫反应的佐剂，其可为上述突变型大肠杆菌忌热毒素。[0029]较佳地，佐剂可诱发体液性免疫反应及/或细胞性免疫反应。[0030]最后，本发明再提供一种疫苗，其可包含:抗原及上述的佐剂。[0031]其中，抗原可包含猪肺炎霉浆菌黏附素P97的C端。[0032]其中，此疫苗可为细菌疫苗或病毒疫苗。[0033]较佳地，细菌可包含病原性大肠杆菌(Escherichiacoli)、空肠弯曲杆菌(Campylobacterjejuni)、大肠弯曲杆菌(Campylobactercoli)、沙门氏杆菌(Salmonellasp.)、猪胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacilluspleuropneumoniae)、巴氏杆菌(Pasteurellamultocida)、第二型猪链球菌(Streptococcussuistype2)、副猪嗜血杆菌(Haemophilusparasuis)、单核细胞增生李斯特菌(Listeriamonocytogenes)、猪肺炎霉衆菌(Mycoplasmahyopneumoniae)、猪鼻霉衆菌(Mycoplasmahyorhinis)、丹毒菌(Erysipeloidrixinsidiosia)、博德氏支气管败血症杆菌(Bordetellabronchiseptica)、气肿疽杆菌(Clostridiumchauvoei)、破伤风梭菌(Clostridiumtetani)、赤痢螺旋菌(Treponemahyodysenteriae)、鸡副嗜血杆菌(HaemophilusparagalIinarum)、水禽雷氏杆菌(Riemerellaanatipestifer)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、肉毒梭状芽抱杆菌(Clostridiumbotulinum)、婴I鶴披衣菌(Chlamydiapsittaci)、鸡败血性霉衆菌(Mycoplasmagallisepticum)、骨膜炎霉衆菌(Mycplosmasynoviae)、家禽结核菌(Mycobacteriumavian)、白色念珠菌(Candidaalbicans)或其组合。[0034]较佳地，病毒可包含血球凝集性脑炎病毒(haemagglutinatingencephalomyelitisvirus)、日本脑炎病毒(Japaneseencephalitisvirus)、猪传染性胃肠炎病毒(transmissiblegastroenteritisvirus)、猪肠病毒(swineenterovirusvirus)、假性狂犬病病毒(pseudorabiesvirus)、口蹄疫病毒(footandmousediseasevirus)、猪流行性感冒病毒(swineinfluenzavirus)、第二型猪环状病毒(porcinecircovirustype2)、猪生殖与呼吸综合症病毒(porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus)、猪痘病毒(swinepoxvirus)、猪细小病毒(porcineparovirus)、猪痕病毒(classicalswinefever)、白血病/肉瘤群病毒(leukosis/sarcomagroupvirus)、传染性法氏囊病病毒(infectiousbursaldiseasevirus)、家禽传染性支气管炎病毒(avianinfectiousbronchitisvirus)、鸡马立克氏病病毒(Marek'sdiseasevirus)、关节炎病毒(arthritisvirus)、鸡传染性贫血病毒(chickeninfectiousanemiavirus)、禽痘病毒(fowlpoxvirus)、新城疫病毒(Newcastlediseasevirus)、鸡传染性喉气管炎病毒(infectiouslaryngotracheitisvirus)、肿头症候群病毒(swollenheadsyndromevirus)、鸡产蛋下降症候群病毒(eggdropsyndromevirus)或其组合。[0035]本发明通过量产突变型大肠杆菌忌热毒素的方式来降低制作佐剂的成本，且具备毒性小及免疫效果良好等优点，可做为疫苗佐剂。【专利附图】【附图说明】[0036]图1显示本发明171、196及286菌株的内生性质粒；[0037]图2显示本发明利用PCR扩增171、196及286菌株的elt操纵子(operon)；[0038]图3显示本发明171菌株elt操纵子的核苷酸序列(SEQIDN0.23)；eltA的序列以斜体表示；[0039]图4显示本发明196菌株elt操纵子的核苷酸序列(SEQIDN0.24);eltA的序列以斜体表示；[0040]图5显示本发明286菌株elt操纵子的核苷酸序列(SEQIDN0.25)；eltA的序列以斜体表示；[0041]图6显示本发明171、196及286菌株EltA的氨基酸序列(SEQIDN0.26)；[0042]图7显示本发明171、196及286菌株EltB的氨基酸序列(SEQIDN0.27)；[0043]图8显示本发明大肠杆菌忌热毒素基因突变策略及PCR产物的分析；图片A:基因突变使用的引物组合；图片B:利用DNA电泳分析PCR产物；[0044]图9显示本发明突变大肠杆菌忌热毒素DNA序列(SEQIDN0.28);突变位置以粗体字标示，且eltA的序列以斜体表示；[0045]图10显示本发明利用蛋白质电泳侦测重组突变大肠杆菌忌热毒素的表达情形；[0046]图1IA显示本发明置换大肠杆菌忌热毒素A亚单位及B亚单位信号肽DNA使用的策略；[0047]图1lB为本发明置换大肠杆菌忌热毒素A亚单位及B亚单位信号肽DNA的PCR产物的分析图；[0048]图12显示本发明融合OmpA信号肽DNA的eltA及eltB的DNA序列(SEQIDN0.29)；0mpA信号肽以粗体字表示，且eltA的序列以斜体表示；[0049]图13显示本发明融合突变OmpA信号肽DNA的eltA及eltB的DNA序列(SEQIDN0.30);突变OmpA信号肽以粗体字表示，且eltA的序列以斜体表示；[0050]图14显示本发明重组突变大肠杆菌忌热毒素的纯化结果。【具体实施方式】[0051]以下将配合图式详细叙述例示实施例。然而，这些实施例可以包含于不同的形式中，且不应被解释为用以限制本发明。这些实施例的提供使得本发明的揭露完整与完全，本领域的技术人员将能经由这些实施例了解本发明的范畴。[0052]本发明是关于一种制备突变型大肠杆菌忌热毒素的方法，其可包含:(a)提供大肠杆菌忌热毒素的DNA序列，其至少包含一个A亚单位及一个B亚单位；(b)将A亚单位的第63号氨基酸突变为赖氨酸的密码子；(c)将A及B亚单位中转译为信号肽的DNA分别取代为转译为大肠杆菌外膜蛋白质的信号肽的DNA;(d)将大肠杆菌外膜蛋白质的信号肽的第9号氨基酸突变为缬氨酸的密码子；以及(e)将步骤(d)所制得的突变大肠杆菌忌热毒素的DNA置入大肠杆菌表达系统以制得突变型大肠杆菌忌热毒素。[0053]此外，本发明另提供一种突变型大肠杆菌忌热毒素，其可包含:至少一个A亚单位及至少一个B亚单位；其中A亚单位的第63号氨基酸可为赖氨酸；A亚单位及B亚单位的信号肽为大肠杆菌外膜蛋白质的信号肽，且大肠杆菌外膜蛋白质的信号肽的第9号氨基酸可为缬氨酸。[0054]较佳地，本发明的大肠杆菌忌热毒素可包含一个A亚单位及五个B亚单位。[0055]再者，本发明另可提供一种增加个体免疫反应的佐剂，其可为上述突变型大肠杆菌忌热毒素。[0056]最后，本发明再提供一种疫苗，其可包含:抗原及上述的佐剂。[0057]本文中「LT」一词，是指大肠杆菌忌热毒素。LT至少由单一A亚单位及单一B亚单位所构成，较佳为单一A亚单位及五个相同的B亚单位构成。[0058]本文中「突变型大肠杆菌忌热毒素」一词，相较于野生型大肠杆菌忌热毒素之下，是指经突变、经减毒、毒性较低或不具毒性的大肠杆菌忌热毒素。[0059]本文中「elt」一词，是指大肠杆菌忌热毒素的结构基因。[0060]「rmLT」一词是指重组天然产生的LT所制成的突变型。用于与rmLT相关的「实质上无毒性」一词是指实质上较其野生型相对物低的毒性。[0061]后述的实例是用于阐明本发明的多种态样，并使得本领域技术人员得以据以实施，以下的实例仅为例示性，并非用于限制本发明意欲主张的申请专利范围。[0062]实例[0063]本发明的一种突变型大肠杆菌忌热毒素及其制备方法，特别是关于一种提升突变型大肠杆菌忌热毒素的产量以降低蛋白质佐剂的生产成本及其实验方法步骤与实验的结果讨论，其将以具体实例说明的方式阐述，其过程及结果仅为例示性，并非用于限制本发明意欲主张的申请专利范围。[0064]实例I[0065]菌株的分离[0066]自发生猪只下痢的猪场收取猪肠。以灭菌的接种环钩取猪肠液，并于麦康凯琼脂(MacConkeyagar)培养基上进行划线培养。隔夜培养后，挑选单一红色菌落进行生化试验，包括D引哚试验(indoletest)、甲基红试验(methylredtest)、佛普二氏反应(Voges-Prokauerreaction)及柠檬酸试验。菌株进行测试后，若吲哚试验为阳性反应、甲基红试验为阳性反应、佛普二氏反应为阴性反应及柠檬酸试验为阴性反应，则判定为大肠杆菌。进一步以鞭毛抗原K88抗血清进行血清凝集试验，若凝集试验为阳性反应,代表此菌株为K88+的大肠杆菌。将不同猪场的菌株分别编号为171、196及286。[0067]实例2[0068]肠毒素产生性大肠杆菌质粒的抽取[0069]利用质粒提取纯化试剂盒PlasmidMiniprepPurificationKitII(GeneMark,Taiwan)进行大肠杆菌质粒的抽取，操作流程依照厂商提供的方法进行。流程中提及的溶液1、溶液I1、溶液II1、洗涤溶液A、洗涤溶液B及冲提溶液均为试剂盒中所附的试剂。取1.5mL隔夜培养的菌液至微量离心管，离心(21，000Xg，3分钟，室温)收集菌体，并倒除上清液，重复此步骤二次。将菌体重新悬浮于200iiL溶液I中。之后加入200iiL溶液II，缓和混合数次。接着加入200iiL溶液III，缓和混合数次。离心(21，000Xg，10分钟，室温)收集上清液。将纯化管柱(spincolumn)放置于收集管(collectiontube)上,并将上清液置入纯化管柱(spincolumn)中，经离心(21，000Xg,2分钟,室温)后,倒除滤液。接着加入500iiL洗漆溶液A至纯化管柱(spincolumn)中，离心(14000rpm,2分钟，室温)后，倒除滤液，此步骤可有效降低核酸内切酶(endonuclease)的污染。紧接着加入700iiL洗涤溶液B，经离心(21，000Xg，2分钟，室温)后，倒除滤液。之后，继续离心(21，000Xg，5分钟，室温)以去除残留的酒精。最后将纯化管柱(spincolumn)置于灭菌的微量离心管中,加入适量的冲提溶液至纯化管柱(spincolumn)中并离心(21，000Xg，2分钟，室温)以冲提质粒DNA。将质粒贮存于_20°C中备用。[0070]实例3[0071]利用聚合酶链式反应扩增elt操纵子(operon)[0072]大肠杆菌忌热毒素LTp-1的结构基因包括eltA及eltB。eltA基因的上游区域被称之为A-box，含有基因转录所需的启动子(promoter);eltB基因的下游区域被称之为B-box,含有终止基因转录所需的终止子(terminator)。这些区域的核苷酸序列在不同菌株间有很高的同源性(Schloret〃/.，2000)。针对同源性为100%的区域设计两条引物，包括ELjTORF(5’-AAGTCGCGACTAATAAAAATMTCAGGTTGCC-3’)(SEQIDN0.31)/ELT0RR(5’_GATAACCCTGCCATTTTCATCCAGTT_3’)(SEQIDN0.32)。以肠毒素产生性大肠杆菌的质粒DNA作为模板，利用ELTORF及ELTORR引物组合进行elt操纵子的扩增。在50yLPCR反应混合物中包含I倍ExTaq?缓冲液，200yM的dATP、dTTP、dGTP与dCTP,IuM扩增引物，IOOng肠毒素产生性大肠杆菌的质粒DNA及1.25UTakaRaExTaq?DNA聚合酶。PCR的反应条件为:94°C下5分钟(I个步骤);94°C下30秒、55°C下30秒、72°C下I分钟40秒(35个循环);以及72°C下7分钟(I个步骤)。将PCR产物以PCRClean-Upkit(GeneMark,Taiwan)回收后，贮存于_20°C中备用。[0073]实例4[0074]elt操纵子(operon)的克隆(TA克隆，TAcloning)[0075]本实验利用益生TA克隆试剂盒(TAcloningkit)进行。实验步骤参考厂商提供的yT&A克隆载体试剂盒操作手册进行。取5iiL经PCR清洁处理试剂盒(cleanupkit)回收纯化的PCR产物(eltoperonDNA)与2yLyT&A载体(vector)、IyL连接缓冲液A(ligationbufferA)、IuL连接缓冲液B和IuLT4DNA连接酶(lunit/uL)混合均匀后，于22°C反应30分钟进行连接反应。将连接混合物(ligationmixture)转化入大肠杆菌XLl-blue(Protech,Taiwan)中，转化的条件依厂商提供的流程进行。转化后的菌体加入ImLSOC再生培养液中，于37°C、250rpm的条件下震荡60分钟。之后，取适量菌液涂布于含氨苄西林(ampicillin)(最终浓度为100yg/mL)的固态培养基上，于37°C下培养16小时。之后，以菌落聚合酶链式反应(colonyPCR)筛选转化株。菌落聚合酶链式反应实验步骤如下所述。首先，先准备一微量离心管加入反应缓冲液、dNTP、引物、TakaraExTaq?DNA聚合酶(Takara，Japan)及加入灭菌水调整至适当体积，分装于PCR小管(10yL/管)。随后再以牙签自培养皿上将菌落点至PCR小管，进行PCR反应。PCR反应条件为:95°C反应5分钟(I个步骤)；95°C反应30秒、55°C反应30秒、72°C，反应I分钟50秒(25个循环)；72°C反应7分钟(I个步骤)。利用DNA电泳确认有无预估大小的DNA片段。以菌落聚合酶链式反应确认转化株中的重组质粒带有嵌入DN`A后，再抽取转化株中的质粒并进行DNA定序(源资国际生物科技股份有限公司)。将含有171、196及286菌株elt操纵子(opeixm)的质粒分别命名为TA-171ELT、TA-196ELT及TA-286ELT。[0076]实例5[0077]大肠杆菌忌热毒素基因的定点突变[0078]利用重叠延伸聚合酶链式反应(overlapextensionpolymerasechainreaction,0EPCR)进行定点突变，突变的位置包括大肠杆菌忌热毒素基因的第63号氨基酸-丝氨酸(Serine)的密码子(codon),使其由变为赖氨酸(lysine)的密码子；此外,基因中的NdeI切位亦进行沉默突变(silentmutation)，使其由CATATG改变为CGTATG(密码子改变但不改变氨基酸)，以方便基因的克隆。首先设计EltAF(SEQIDN0.1)、S63KF(SEQIDN0.2)、S63KR(SEQIDN0.3)、NdeImutf(SEQIDN0.4)、NdeImutR(SEQIDN0.5)及EltBR(SEQIDN0.6)等六条引物；引物的序列如下列表一所示。[0079]表一、大肠杆菌忌热毒素基因定点突变所使用的引物[0080]【权利要求】1.一种制备突变型大肠杆菌忌热毒素的方法，其包含:(a)提供一大肠杆菌忌热毒素的DNA序列，其至少包含一个A亚单位及一个B亚单位；(b)将该A亚单位的第63号氨基酸突变为赖氨酸的密码子；(c)将该A及B亚单位中转译为信号肽的DNA分别取代为转译为大肠杆菌外膜蛋白质的信号肽的DNA;及(d)将该大肠杆菌外膜蛋白质的信号肽的第9号氨基酸突变为缬氨酸的密码子'及(e)将该步骤(d)所制得的突变大肠杆菌忌热毒素的DNA置入大肠杆菌表达系统以制得突变型大肠杆菌忌热毒素。2.如权利要求1所述的方法，其中当执行该(e)步骤时，是先将该突变大肠杆菌忌热毒素的DNA嵌入质粒，再将该质粒转化入该大肠杆菌表达系统。3.如权利要求1所述的方法，其中在该(e)步骤之后，所产生的该突变型大肠杆菌忌热毒素是采用固定化半乳糖树脂进行纯化。4.如权利要求1所述的方法，其中该突变型大肠杆菌忌热毒素包含一个A亚单位及五个B亚单位。5.如权利要求1所述的方法，其中该步骤(a)的大肠杆菌忌热毒素的DNA序列包含SEQIDN0.23,24或25。6.如权利要求1所述的方法，其中该大肠杆菌忌热毒素的A亚单位包含氨基酸序列SEQIDN0.26。7.如权利要求1所述的方法，其中该大肠杆菌忌热毒素的B亚单位包含氨基酸序列SEQIDN0.27。8.如权利要求1所述的方法，其中该大肠杆菌外膜蛋白质的信号肽包含氨基酸序列SEQIDN0.14。9.如权利要求1所述的方法，其中该A亚单位的第63号氨基酸为丝氨酸。10.如权利要求1所述的方法，其中该大肠杆菌外膜蛋白质的信号肽的第9号氨基酸为丙氨酸。11.如权利要求1所述的方法，其中当执行该(b)步骤时，是利用引物进行重叠延伸聚合酶链式反应。12.如权利要求11所述的方法，其中该引物包含SEQIDN0.1、2、3、4、5及6。13.如权利要求1所述的方法，其中当执行该(c)步骤时，是利用引物进行重叠延伸聚合酶链式反应。14.如权利要求13所述的方法，其中该引物包含SEQIDN0.7、8、9、10、11、12及13。15.如权利要求1所述的方法，其中当执行该(d)步骤时，是利用引物进行重叠延伸聚合酶链式反应。16.如权利要求15所述的方法，其中该引物包含SEQIDN0.15、16、17及18。17.一种突变型大肠杆菌忌热毒素，其包含:至少一个A亚单位及至少一个B亚单位；其中该A亚单位的第63号氨基酸为赖氨酸；该A亚单位及B亚单位的信号肽为一大肠杆菌外膜蛋白质的信号肽，且该大肠杆菌外膜蛋白质的信号肽的第9号氨基酸为缬氨酸。18.如权利要求17所述的突变型大肠杆菌忌热毒素，其包含一个A亚单位及五个B亚单位。19.如权利要求17所述的突变型大肠杆菌忌热毒素，其中该大肠杆菌外膜蛋白质的信号肽包含氨基酸序列SEQIDN0.14。20.如权利要求17所述的突变型大肠杆菌忌热毒素，其具有SEQIDN0.30的DNA序列。21.如权利要求17所述的突变型大肠杆菌忌热毒素，其是使用权利要求1至16中任一项的方法所制得。22.如权利要求17所述的突变型大肠杆菌忌热毒素，其为经减毒的大肠杆菌忌热毒素。23.—种增加免疫反应的佐剂，其包含权利要求17至20中任一项所述的突变型大肠杆菌忌热毒素。24.如权利要求23所述的佐剂，其诱发体液性免疫反应及/或细胞性免疫反应。25.一种疫苗，其包含:抗原及权利要求23的佐剂。26.如权利要求25所述的疫苗，其中该抗原包含猪肺炎霉浆菌黏附素P97的C端。27.如权利要求25所述的疫苗，其中该疫苗为细菌疫苗或病毒疫苗。28.如权利要求27所述的疫苗，其中该细菌包含病原性大肠杆菌、空肠弯曲杆菌、大肠弯曲杆菌、沙门氏杆菌、猪胸膜肺炎放线杆菌、巴氏杆菌、第二型猪链球菌、副猪嗜血杆菌、单核细胞增生李斯特菌、猪肺炎霉浆菌、猪鼻霉浆菌、丹毒菌、博德氏支气管败血症杆菌、气肿疽杆菌、破伤风梭菌、赤痢螺旋菌、鸡副嗜血杆菌、水禽雷氏杆菌、金黄色葡萄球菌、肉毒梭状芽孢杆菌、鹦鹉披衣菌、鸡败血性霉浆菌、骨膜炎霉浆菌、家禽结核菌、白色念珠菌或其组合。29.如权利要求27所述的疫苗，其中该病毒包含血球凝集性脑炎病毒、日本脑炎病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪肠病毒、假性狂犬病病毒、口蹄疫病毒、猪流行性感冒病毒、第二型猪环状病毒、猪生殖与呼吸综合症病毒、猪痘病毒、猪细小病毒、猪瘟病毒、白血病/肉瘤群病毒、传染性法氏囊病病毒、家禽传染性支气管炎病毒、鸡马立克氏病病毒、关节炎病毒、鸡传染性贫血病毒、禽痘病毒、新城疫病毒、鸡传染性喉气管炎病毒、肿头症候群病毒、鸡产蛋下降症候群病毒或其组合。【文档编号】A61P31/04GK103773790SQ201210537762【公开日】2014年5月7日申请日期:2012年12月11日优先权日:2012年10月24日【发明者】林俊宏,王志鹏,谢明伟,方健宇,曾皓真,杜清富申请人:财团法人台湾动物科技研究所